BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA HÓA HỌC


KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH
ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE CỦA CAO HEXAN
LÁ BÌNH BÁT DÂY COCCINIA GRANDIS (L.) J. VOIGT
HỌ BẦU BÍ (CUCURBITACEAE)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
CỬ NHÂN HÓA HỌC

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Hướng dẫn khoa học: TS. LÊ TIẾN DŨNG
Sinh viên thực hiện: TRẦN THỊ KIM HỒNG

Tp HCM - 5/2013


LỜI CẢM ƠN
Với tấm lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc,em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:
• TS. Lê tiến Dũng – phòng hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học, thầy
đãtận tình hướng dẫn, giúp đỡ, cung cấp kiến thức, dộng viên, tạo mọi diều
kiện giúp em hoàn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp này.
• TS. Mai Đình Trị - phòng hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học, thầy đã
giúp đỡ, cho em những ý kiến quý báu để em hoàn thiện đề tài của mình
• Thầy cô bộ môn hóa hữu cơ – Khoa hóa – Trường đại học Sư Phạm tp HCM
và các thầy cô của viện khoa học và công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều
kiện giúp đỡ em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.


Ethanol

M

Methanol

Tiếng việt

SKLM

Sắc kí lớp mỏng

SKC

Sắc kí cột

NMR

Nuclear Magnetic

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Resonance
Carbon (13) nuclear

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

magnetic resonance


Độ dịch chuyển hóa học

ppm

Part per million

Phần triệu

Mp

Melting point

Điểm nóng chảy

s

Singlet

Mũi đơn

d

Doublet

Mũi đôi

dd

Doublet of doublet



Milligram

Kg

Kilogram

IC 50

Hằng số ghép spin

half maximal inhibitory
concentration

iii

50% nồng độ ức chế tối đa


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Kết quả sắc ký cột cao BBD2(13,7g) ............................................. 23
Bảng 2.2. Kết quả sắc khí cột silica gel cao BBD2.10 (567,4mg). ................ 23
Bảng 3.1 Kết quả IC 50 của các mẫu cao Bình bát dây .................................... 26

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1 Điều chế mẫu thử hoạt tính ......................................................... 17
Sơ đồ 2.2 Phản ứng thủy phân enzym α-glucosidase với cơ chất là pNitrophenyl-α-D-glucopyranoside ............................................................... 18
Sơ đồ 2.3 Điều chế cao thô ............................................................................ 21
Sơ đồ 2.4 Quy trình điều chế các phân đoạn từ cao n-hexan .................... 22


1.2.1 Sơ lược về enzym .............................................................................. 7
1.2.2 Chất ức chế enzym ............................................................................ 7
1.2.3 Giới thiệu enzym α–glucosidase ....................................................... 7
1.2.4 Cơ chế hoạt động của enzym α–glucosidase .................................... 8
1.2.5 Tác nhân ức chế enzym α–glucosidase ............................................. 8
1.3 ĐẠI CƯƠNG VỀ THỰC VẬT ............................................................... 8
1.3.1 Đặc điểm cây Bình Bát Dây .............................................................. 8
1.3.2 Tác dụng dược lý của Bình bát dây................................................. 10
1.3.3 Thành phần hóa học chung của Bình bát dây ................................. 11
Chương 2: THỰC NGHIỆM ....................................................................... 14
2.1. Hóa chất ................................................................................................ 14
2.2. Thiết bị .................................................................................................. 14
2.3. Phương pháp tiến hành ......................................................................... 15
2.3.1 Phương pháp cô lập các hợp chất .................................................... 15
vi


2.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất .................... 15
2.4. Nguyên liệu ........................................................................................... 15
2.5 Xử lí mẫu nguyên liệu .......................................................................... 15
2.6. Thử nghiệm hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase............................. 16
2.6.1 Điều chế mẫu thử ............................................................................ 16
2.6.2 Nguyên tắc....................................................................................... 17
2.6.3 Cơ sở phương pháp ......................................................................... 18
2.6.5 Cách tính kết quả ............................................................................. 19
2.7 Cô lập các chất từ lá bình bát dây .......................................................... 20
2.7.1 Điều chế các cao thô....................................................................... 20
2.7.2 Cô lập các chất từ cao hexan ........................................................... 21
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 26
3.1 Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase .................. 26

ở nương, rẫy, bờ rào. Đọt và lá non có vị ngọt, tính mát thường được nấu canh ăn có
tác dụng: Thanh nhiệt, mát phế, thanh vị, nhuận táo, sinh tân dịch, dưỡng âm, tiêu
độc, trị tiểu đường… .Có thể dùng ngọn lá non cả hoa quả rửa sạch ăn sống hoặc
xay nước uống đều được. Người bệnh tiểu đường hái lá non bình bát dây 100g, thịt
1


cua 50g, gia vị vừa đủ nấu canh ăn thường xuyên. Nhiều người sử dụng lá bình bát
dây cho biết, có thể giảm được 50% liều thuốc Tây trị đái tháo đường loại 2 nhẹ.
Mặt khác, để giảm chứng đái tháo đường thì người bệnh nên có chế độ ăn uống tập
luyện điều độ, tránh béo phì, tránh các bệnh mạn tính như huyết áp, tim mạch, gan
nhiễm mỡ... Tuy nhiên, những công trình nghiên cứu về thành phần hóa học cũng
như hoạt tính sinh học về loài cây này chưa được nghiên cứu nhiều ở trên thế giới
cũng như Việt Nam. Do vậy, đề tài “Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính ức
chế enzym α-glucosidase của cao hexan lá Bình bát dây Coccinia grandis (L.) J.
Voigt. Họ Bầu Bí (Cucurbitaceae)” là cơ sở khoa học ban đầu cho những nghiên
cứu tiếp theo, nhằm sớm đưa cây Bình bát dây thành một vị thuốc có giá trị và đóng
góp thêm những hiểu biết về thành phần Hóa – Thực vật của loài Coccinia grandis
(L.), qua đó nâng cao giá trị sử dụng của loài thực vật này.

Mục tiêu của đề tài
-

Phân lập các chất tinh khiết từ lá Bình bát dây.

-

Xác định cấu trúc các chất đã phân lập được.

-


3


Hình 1.1 Phân loại bệnh đái tháo đường

1.1.2.3 Bệnh tiểu đường thai kỳ
Đây là dạng tiểu đường xảy ra ở một số phụ nữ mang thai và chấm dứt sau khi
sanh. Có thể gây ra các vấn đề trong quá trình mang thai. Phụ nữ bị Bệnh tiểu
đường thai kỳ có nhiều khả năng phát triển thành Bệnh tiểu đường loại 2 sau này.

1.1.3 Các biến chứng của bệnh tiểu đường
Các biến chứng được chia ra theo thời gian xuất hiện và mức độ tiến triển.

1.1.3.1 Biến chứng cấp tính
Các biến chứng cấp tính là những bệnh cảnh cấp cứu nội khoa, thường gặp và
đe dọa tính mạng, thường gặp ở các nước đang phát triển, gồm các loại biến chứng
sau:
- Nhiễm toan ceton: Là biến chứng thường gặp điển hình ở bệnh nhân tiểu
đường loại 1. Cơ chế sinh lý bệnh chủ yếu là do thiếu insulin và sự tăng tiết các

4


hormon đối kháng gây giảm sử dụng glucose, rối loạn chuyển hóa lipid và tăng tạo
các thể cetone gây tình trạng toan máu và rối loạn nước, điện giải.
- Tăng áp lực thẩm thấu: bệnh nhân đái tiểu đường không được điều trị sẽ mất
rất nhiều dịch do đi tiểu nhiều, gây ra tình trạng cô đặc máu làm áp lực thẩm thấu
trong máu tăng cao. Biến chứng này thường gặp ở bệnh nhân tiểu đường loại 2 và
có thể gây tử vong nếu không được điều trị.


1.1.4.2 Phương pháp điều trị bệnh tiểu đường loại 2
Phụ thuộc vào tình trạng của bệnh nhân, phương pháp chữa trị gắn liền với
việc ăn uống thích hợp, tăng cường hoạt động. Chỉ bệnh nhân tiểu đường loại 2
mới dùng thuốc kết hợp với những chất đặc hiệu nhằm làm giảm lượng đường
huyết.Bệnh nhân có thể dùng riêng thuốc viên hoặc kết hợp với phương pháp tiêm
insulin.
Thuốc sử dụng để điều trị bệnh tiểu đường loại 2 chủ yếu chia 3 nhóm:
•

Nhóm thuốc thúc tụy tạng tiết thêm insulin như nhóm sufonylurea:

Tolbutamide, Chlorpropamide, Glibenclamid, Gliclazid, Glimepirid, Glipizide,
Glinide; nhóm meglitinide: Prandin, Starlix; nhóm sitagliptin: Januvia, Onglyza.
•

Nhóm thuốc giúp insulin hoạt động hữu hiệu hơn như nhóm biguanide:

metformin (Glucophage, Glucophge XR, Metformin XR); nhóm thiazolidinedione
(TZD)hay glitazone, (Rosiglitazone, pioglitazone ).
• Thuốc ức chế men alpha-glucosidase(làm chậm hấp thu đường glucose từ
ruột vào máu):Acarbose (Precose, Glucobay), miglitol (Glyset).
Ngày nay, việc sử dụng nhóm thuốc chất ức chế alpha-glucosidase đang được chú ý
nhiều. Thuốc ức chế α-glucosidase sẽ làm chậm quá trình hấp thu carbohydrat ở
đường tiêu hóa, nhờ đó làm giảm độ tăng đường máu sau bữa ăn. Chất đường trong
ruột sẽ được hấp thụ chậm vào cơ thể và đường ngay sau khi ăn sẽ không tăng cao
trong máu. Tuy nhiên, chúng lại có nhiều tác dụng phụ như gây đầy hơi và sôi bụng,
đôi khi gặp đau bụng và tiêu chảy, vì thuốc này làm chậm quá trình tiêu hóa chất
bột đường trong lòng ruột.Chính vì vậy, việc nghiên cứu thêm những chất ức chế
enzyme α-glucosidase từ nhiều nguồn khác nhau là rất cần thiết, giúp cho sự điều trị

1.2.3 Giới thiệu enzym α–glucosidase
Enzymeα-glucosidase với những tên khác như maltase, glucoinvertase,
glucosidosucrase,maltase-glucoamylase, α−glucopyranosidase, glucosidoinvertase,
α-D-glucosidase, α-glucosidase hydrolase, α-1,4-glucosidase, thuộc nhóm
hydrolase (nhóm enzyme xúc tác các phản ứng thủy phân).
7


1.2.4 Cơ chế hoạt động của enzym α–glucosidase
Chúng ta biết rằng carbohydrat chứa trong thức ăn là nguồn cung cấp chất
đường cho cơ thể.Sau khi vào cơ thể, những carbohydrat được thủy phân thành
những phân tử đường đơn bởi những enzyme trong ruột non và các phân tử đường
này được tỏa ra nuôi các tế bào cơ thể.Tiến trình phân hóa này đòi hỏi tụy tạng phải
tiết ra α-amylase dùng để phá vỡ các phân tử carbohydrat lớn thành oligosaccharid,
màng tế bào ruột non lại tiết ra α-glucosidase để tiếp tục phân hóa các
oligosaccharide thành các phân tử đường đơn rồi mới thẩm thấu vào máu. Chức
năng chính của enzyme này là xúc tác cho việc cắt đứt liên kết 1,4-α-D-glucosid
của cơ chất để giải phóng ra α-D-glucose. Bằng cách kiềm chế sự hoạt động của
enzyme α-glucosidase, có thể làm giảm sự thủy giải của carbohydrat và làm chậm
sự thẩm thấu glucose vào máu.

1.2.5 Tác nhân ức chế enzym α–glucosidase
Việc tìm kiếm các hợp chất ức chế enzym α-glucosidase có ý nghĩa rất lớn
trong các lĩnh vực như dược phẩm, thực phẩm…Đã có rất nhiều hợp chất được tìm
thấy trong tự nhiên hoặc tổng hợp có khả năng ức chế enzym α-glucosidase.Tuy
nhiên, những tác nhân ức chế enzym α-glucosidase hiện nay thường gây nhiều phản
ứng phụ.Vì vậy, việc tìm kiếm các chất có khả năng ức chế enzym α-glucosidase
vẫn đang được sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới.

1.3 ĐẠI CƯƠNG VỀ THỰC VẬT[3],[10],[23],[24],[25],[27],[28],[29]

trên nương rẫy, ở rào, lùm bụi từ vùng thấp tới vùng cao khắp nước ta. Có thể thu
hái các bộ phận của cây quanh năm.
Lá non và quả dùng làm rau ăn.

1.3.2 Tác dụng dược lý của Bình bát dây.[10],[11]
Lá và thân chống co thắt và là chất long đàm.Quả xanh có vị rất đắng.Quả
xanh được nhai để chữa bệnh loét trên lưỡi.
Ở Ấn Ðộ dịch lá và rễ dùng trị bệnh tiểu đường.Người ta dùng cả cây để làm
thuốc trị bệnh lậu. Lá dùng đắp ở ngoài da trị phát ban da, trị ghẻ lở, mụn nhọt, các
vết thương và các vết cắn của rắn rết. Lá Bình bát dây cho thấy rằng nó ức chế hoạt
động của enzyme glucose-6-phosphatase và có hoạt tính chống ô xi hoá.
Ở Campuchia người ta dùng dịch chiết từ thân cây để trị bệnh đau giác mạc.
10


Ở Inđônêxia, người ta còn dùng cây làm thuốc trị bệnh đậu mùa, đau dạ dày và
ruột.
Dân gian dùng củ ngâm rượu bóp chữa sưng đau hay các khớp bị viêm.
Trong dân gian, Bình bát dây còn dùng điều trị bệnh vàng da, bệnh viêm cuống
phổi, bệnh vẩy nến, herpes mảng tròn, bệnh lây lan qua đường tình dục như bệnh
giang mai, bệnh lậu (Nadkarni và Nadkarni, 1976; Dash, 1987; Jain và DeFilipps,
1991; Kapoor, 1990).
Trong y học cổ truyền, lá bình bát dây có vị ngọt, tính mát. Tác dụng: Thanh
nhiệt, mát phế, thanh vị, nhuận táo, sinh tân dịch, dưỡng âm, tiêu độc. Người bệnh
tiểu đường hái lá non bình bát dây 100g, thịt cua 50g, gia vị vừa đủ nấu canh ăn
thường xuyên. Có thể dùng ngọn lá non cả hoa quả rửa sạch ăn sống hoặc xay nước
uống đều được.

1.3.3 Thành phần hóa học chung của Bình bát dây[10],[25]
G. Singh và các cộng sự cô lập được hợp chất đầu tiên có trong Bình bát dây là


Taraxerol

13


Chương 2: THỰC NGHIỆM
2.1. Hóa chất
Dung dịch đệm phosphat 0,01 M; pH = 7,0
Dung dịch enzym 0,2 U mL-1
Dung dịch nền p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid 3 mM
Dung dịch Na 2 CO 3 0,1 M
Hạt silica gel cỡ hạt 0,04 – 0,063 mm dùng cho pha thường của Scharlau, silica
gel pha đảo ODS (0,040 – 0,063 mm), sephadex LH-20, bảng nhôm tráng sẵn với
silica gel 60 F 254 (Merck) dùng cho pha thường và Rp18 F 254S (Merck) cho pha
đảo.
Dung môi: n- hexane, chloroform, ethyl acetate, acetone, methanol, ethanol 960,
nước cất.
Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên bảng mỏng: dùng H 2 SO 4 /EtOH,
FeCl 3 /EtOH.

2.2. Thiết bị
Máy đo điểm nóng chảy
Máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance.
Máy cô quay chân không
Máy sấy.
Máy đánh siêu âm.
Máy hút chân không.
Đèn UV soi tử ngoại bước sóng 254 – 365 nm hiệu UVITEC
Cân phân tích AB 265 – S và cân kỹ thuật PB 602 – S.

Mẫu lá cây Bình bát dây được bộ môn tài nguyên thực vật - Trung tâm sâm và
dược liệu giám định tên khoa học.

2.5 Xử lí mẫu nguyên liệu
Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khô trong bóng
râm, sau đó sấy ở nhiệt độ 500C, rồi xay thành bột mịn.Đây là nguyên liệu dùng
trong nghiên cứu.

15


Hình 2.1 lá Bình bát dây khô

2.6.Thử nghiệm hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase
2.6.1 Điều chế mẫu thử
Bột lá bình bát dây được tận trích với ethanol 960 bằng phương pháp ngâm dầm,
lọc bỏ bã, phần dịch chiết được cô loại dung môi dưới áp suất kém thu được cao
EtOH ở dạng sệt. Cao EtOH được hòa tan trong nước và chiết lỏng – lỏng lần lượt
với các dung môi n-hexan, ethyl acetace. Cô đuổi dung môi các dịch trích dưới áp
suất kém thu được các cao tương ứng. Quá trình điều chế cao thô được tóm tắt theo
sơ đồ 2.1.

16


- Tận trích bằng EtOH 960
- Lọc bỏ bã, cô giảm áp dịch chiết

Cao EtOH
- Hòa tan với nước

Hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase in vitro được tiến hành theo phương
pháp của Sigma Aldrich có cải biên. Để khảo sát hoạt tính ức chế α-glucosidase từ

17