TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NC&PT CÔNG NGHỆ SINH HỌC - KHOA KHOA HỌC


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP MỘT SỐ DÒNG NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG
TỔNG HỢP ENZYME PHYTASE VÀ ỨNG DỤNG
CHÚNG TRONG SẢN XUẤT NÔNG NGHIỆP

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

PGS.TS CAO NGỌC ĐIỆP

PHẠM KHÁNH NGUYÊN HUÂN

VIỆN NC & PT CNSH

LỚP CÔNG NGHỆ SINH HỌC K31
MSSV: 3052826

Cần Thơ, Năm 2009


Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------



Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Acid phytic – phytate
Acid phytic (Myo-inositol hexakisphosphat) là một loại muối phosphor hữu cơ có
vai trò rất quan trọng đối với động vật cũng như thực vật, con người và vi khuẩn.
Phytate là muối của acid phytic. Acid phytic có nhiều trong các loại hạt ngũ cốc và
hạt phấn, nó được giải phóng trong suốt quá trình nảy mầm của hạt. Acid phytic là
thành phần dự trữ chính của phosphor, nguồn inositol và nhiều chất khoáng trong
cây. Acid phytic chiếm 75-80% lượng phosphor tổng trong các loại hạt và 1-5%
trọng lượng của các loại hạt dùng làm thực phẩm như hạt đậu, hạt ngũ cốc, và hạt có
dầu (Oh et al., 2004; Vohra et al., 2003).
Bảng 1: Hàm lượng Phytase Phosphorus và phosphor tổng trong thức ăn thực
vật (%)
Tên thức ăn

Bắp
Đại mạch
Tiểu ngạch
Lúa thóc
Khoai mì
Cao lương
Cám tiểu mạch
Lúa mì
Cám gạo nhuyễn
Bã cám gạo
Bã đậu

0,48
0,34
70,1
1,77
1,33
75,1
1,82
1,58
86,8
1,40
0,57
40,4
0,97
0,63
64,9
1,01
0,63
62,4

(Viện chăn nuôi Việt Nam 2009)

Trong tự nhiên, acid phytic tồn tại chủ yếu trong các dạng muối phytate dưới dạng
phức hợp với các cation quan trọng cho dinh dưỡng như Ca2+, Zn2+ và Fe2+. Vì vậy,
khi nói về acid phytic thì thường dùng thuật ngữ phytate. Phytate chứa 14-25%

Trang 2


Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ

nguyên tố khoáng, protein, acid amin, tinh bột và liposome. Phytase không chỉ là
một loại enzyme có tác dụng phá vỡ phức hợp phytic, tăng khả năng tiêu hóa các
phosphor thực vật trong thức ăn, giải phóng một số acid amin, tinh bột, calcium và
các nguyên tố vi lượng khác mà phytase còn giúp giảm lượng phosphor vô cơ sử
dụng và do đó sẽ giảm được chi phí thức ăn.
2.3 Nấm mốc sản xuất phytase
2.3.1 Sơ lược về đặc điểm hình thái của một số loại nấm mốc có khả năng tổng
hợp phytase (Cao Ngọc Điệp, 2006)
2.3.1.1 Aspergillus
Chi Aspergillus thuộc ngành phụ Nấm Nang (Ascomycotina). Chi này có khoảng
200 loài và phát tán khắp nơi trong tự nhiên.
Khuẩn ty Aspergillus có vách ngăn hoàn chỉnh và phân nhánh. Nhiều khuẩn
ty phát triển trên bề mặt cơ chất để hấp thu chất dinh dưỡng. Khuẩn ty khi
đứt thành khúc thì mỗi khúc hay đoạn có thể phát triển cho ra một khuẩn ty
mới.
Khuẩn ty hình thành một cọng mang túi bào tử (conidiophore) và bào tử đính
(conidia) với cọng mang túi bào tử không vách ngăn và không xuất phát từ tế bào
chân (foot cell). Túi hay bọng (vesicle) là tế bào đa nhân và phát triển bề mặt gắn
liền với thể bình (phialide hay sterigmata) (hình 2). Thể bình với bậc 1 hay bậc 2,
mỗi thể bình là cấu trúc đa nhân và trên đầu thể bình tạo thành một chuổi bào tử
đính, những bào tử non ở trong và càng xa càng già; bào tử trưởng thành sẽ phóng
thích vào không khí và nẩy mầm (hình 3).

Trang 4


Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------



Trang 6


Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Bảng 2: Sự khác biệt giữa hai chi Aspergillus và Penicillium
Chi Aspergillus

Chi Penicillium

- Cọng bào tử không phân chia và

- Cọng bào tử phân chia và có vách ngăn

không có vách ngăn ngang

ngang

- Cọng bào tử phát triển từ một tế bào

- Cọng bào tử phát triển từ một vài tế

gọi là tế bào chân

bào của khuẩn ty, không có tế bào chân

- Mỗi cọng bào tử mở rộng trong một túi

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Rhizopus thuộc ngành phụ Nấm tiếp hợp (Zygomycotina) với khoảng 120 loài.
Khuẩn ty thường có màu trắng, phân nhánh, đa nhân và không có vách ngăn ngang.
Khi còn non khuẩn ty có dạng sợi như bông vải, khi phát triển sâu vào cơ chất thì
phân chia thành ba dạng khuẩn ty là khuẩn căn, khuẩn ngang và cọng bào tử (hình
5).
Khuẩn căn là khuẩn ty ăn vào cơ chất để hấp thu chất dinh dưỡng.
Khuẩn ngang là khuẩn ty phát triển theo chiều ngang, trên mặt cơ chất nối
từng nhóm nấm với nhau.
Cọng mang túi bào tử là khuẩn ty mọc thẳng lên không, chúng phát triển từ
trung tâm điểm xuất phát của khuẩn căn và khuẩn ngang. Từ một điểm mọc lên
nhiều cọng bào tử.
Đặc tính của Aspergillus là hình thành những cọng mang bọc bào tử
(sporangiophores) và túi (bọc) bào tử (sporangium). Bào tử không có roi, gần
như tròn, đồng nhất, đa nhân nằm trong túi màu đen gọi là túi bào tử. Một túi bào
tử phát triển đơn độc và tận cùng của cọng mang bọc bào tử và bọc bào tử có màu
đen nên còn gọi là mốc đen.
2.3.1.4 Mucor
Mucor cũng thuộc ngành phụ Nấm tiếp hợp (Zygomycotina).
Nấm Mucor sinh sản vô tính như nấm Rhizopus bằng cách thành lập cọng mang
bọc bào tử và bào tử vách dày (chlamydospore).
Cọng mang bọc bào tử với những bào tử bất động hình thành trong cái bao hay
bọc bào tử (sporangia); mỗi bọc bào tử phát triển tận ngọn, không phân nhánh và
cọng mang bọc bào tử phát triển riêng biệt, không cùng nhóm (hình 6). Một số loài
cá biệt có thể mang bọc bào tử phân nhánh như Mucor racemosus và Mucor
plumbeus.
Trong tế bào chất chứa nhiều nhân nhưng ở bào tử chỉ có 1 nhân, túi bào tử đổi
sang màu nâu khi bào tử trưởng thành và dễ dàng vỡ ra để phóng thích bào tử
theo gió hoặc bám vào chân côn trùng để phát tán.


- Cọng bào tử phát triển riêng biệt và

biệt với khuẩn căn

không cùng tập hợp thành nhóm

- Bào tử dính trên cuống bào tử và - Bào tử dễ phát tán theo gió
khó phân tán

Trang 9


Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

2.3.2 Một số nấm mốc tổng hợp phytase
Một số nhóm Aspergillus niger sản xuất phytase ngoại bào có thể cắt phosphor từ
Calcium phytate trong môi trường axit. Được phân lập từ đất A. ficuum NRRL 3135
sản xuất hầu hết phytase có hoạt tính trong môi trường tinh bột ngô. Việc sản xuất
phytase bị ức chế một cách mạnh mẽ bởi phosphate vô cơ và tỉ lệ C/P trong môi
trường (Shieh và Ware, 1968). Hơn 2000 loài được phân lập từ 68 mẫu đất trong
môi trường giàu dinh dưỡng. Hoạt tính của phytase ngoại bào được tìm thấy trong
một vài nấm mốc khác nhau đã được kiểm tra trên môi trường (Shieh và Ware,
1968).
Bảng 4: Những loài Aspergillus phân lập từ đất sản xuất phytase ngoại bào có
hoạt tính

Loài

0
1
1
0
0
0
21
0
3

A. Fumigatus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A. Flavus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A. Flavipes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A. Clavatus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A. glaucus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A. nidulans. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
A. ochraceus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A. versicolor. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A. terreus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A. ustus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A. wentii. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A. restrictus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A. niger. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A. candidus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Aspergillus speceisα. . . . . . . . . . . . . . . .
(Shieh và Ware, 1968)

Hoạt tính của phytase ngoại bào được quan sát với 28 trong 82 loài Aspergillus spp.,
1 trong 58 loài Penicillium spp., 1 trong 37 loài Mucor spp., không có trong 13 loài
Rhizopus, 4 loài Cunninghamella, 4 loài Neurospora, 140 loài nấm men thì thể hiện

A. ficuum WB 4016
A. ficuum WB 320
A. ficuum WB 364
A. ficuum WB 4541
A. ficuum WB 4781
A. ficuum NRRL 3135 (phân lập từ đất)
A. niger X (phân lập từ đất)
A. niger K (phân lập từ đất)

Hoạt tính
(units/ml)
2,1
0,8
3,5
1,4
0,6
1,0
0,7
0,8
0,7
0,5
2,3
3,3
1,8
1,9
1,5
2,4
1,1
1,0
1,5

khi tăng hàm lượng phosphate bổ sung vào môi trường. Sự ức chế quá trình tổng
hợp phytase bằng phosphate là một hiện tượng chung, điều này được quan sát ở tất
cả các loài nấm mốc và nấm men (Shieh và Ware, 1968).
Bảng 6: Ảnh hưởng của hàm lượng phosphate lên sự tổng hợp phytase của
Aspergillus ficuum NRRL 3135
Số lượng mẫu

Hàm lượng P tổng (%)

Hoạt tính (units/ml)

15

0,10

6,4

14

0,17

6,0

5

0,24

1,5

8


0,44

0,16

3

0,69

0,15

2

0,70

0,15

(Shieh và Ware, 1968)

Trang 12


Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Bảng 7: Ảnh hưởng của tỉ lệ C/Pb lên việc sản xuất phytase của Aspergillus
ficuum NRRL 3135α+

Bột ngô


532

10,8

4

222

0

444

1,9

882

11,4

3

296

0,10

592

1,9

1,184


0.4

2,220

1,10

4,440

1,2

8,880

12,7

(Shieh và Ware, 1968)

Sự hiện diện của phytase được giới hạn bởi phosphate vô cơ và hàm lượng carbon
trong môi trường. Việc sản xuất phytase trong môi trường có bột ngô tăng khi tăng tỉ
lệ C/Pb (bảng 5) (Shieh và Ware, 1968).
A. ficuum NRRL 3135 sản xuất hầu hết phytase có hoạt tính khi lượng phosphate vô
cơ kém hơn 0,004%(w/v) trong môi trường chứa 8%(w/v) bột ngô. Khi lượng
phytase được tạo ra thì lượng phosphate vô cơ trong môi trường bị giới hạn (Shieh
và Ware, 1968).
Một thông báo chỉ ra rằng enzyme phytase được tinh sạch từ nhiều dòng khác nhau.
Nhũng dòng có đặc điểm tốt nhất là Aspergillus ficuum và A. niger. Gen tổng hợp
enzyme phytase của những dòng Aspergillus niger, A. fumigatus, A. terrus, A.
nidulans, Myceliophthora thermophila, và Talaromyces thermophila đã được nhân
dòng và giãi trình tự (Jane et al., 2007).


Regarded As Safe) (Wodzinski và Ullah, 1996; Kerovuo, 2000).
2.4.2 Trong công nghiệp thực phẩm
Ngũ cốc, hạt có dầu và các loại đậu là các loại nguyên liệu phổ biến trong chế biến
thực phẩm. Điều này dẫn đến một lượng lớn phosphate được đưa vào trong cơ thể

Trang 14


Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

con người. Phytate trong hệ ruột không được tiêu hóa sẽ tác động xấu đến sự hấp thu
kẽm, calcium, magie và sắt. Hơn nữa, nó còn ức chế hoạt động của enzyme tiêu hóa.
Do đó, việc bổ sung phytase vào nguyên liệu trước khi chế biến có ý nghĩa lớn
(Kerovuo, 2000).
Phytase đã được bổ sung vào quá trình chế biến bột mì để làm giảm lượng acid
phytic trong các loại bánh dùng bột mì (trong bánh mì, acid phytic chiếm 0,29% 1,05% (w/w)). Phytase thích hợp cho quá trình này cần có pH tối ưu ở 4,5 – 5,0,
nhiệt độ tối ưu 300C và không phụ thuộc vào ion Ca2+.
Các loại nấm mốc dùng trong chế biến thực phẩm lên men phương Đông được cho
biết là tiết phytase. Tempeh là một loại thực phẩm lên men phổ biến của người dân
Indonesia được làm từ đậu nành ủ với nấm mốc Rhizopus oligosporus, nấm này có
tiết phytase và làm tăng mùi, tăng hàm lượng vitamin và tăng khả năng tiêu hóa của
đậu nành.
Phytase đã được bổ sung vào quá trình chế biến nước chiết bắp (corn steep liquor),
rút ngắn được thời gian ngâm bắp (Kerovuo, 2000).
2.4.3 Các ứng dụng khác
Ngoài các ứng dụng trên, phytase còn được dùng trong chế biến thức ăn cá để làm
giảm lượng phosphor thải ra môi trường nước và giảm chi phí bổ sung phosphate vô
cơ vào thức ăn cá (Kerovuo, 2000).

phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2 Thời gian thực hiện
Từ tháng 04/2009 đến tháng 07/2009.
3.2 Phương tiện
3.2.1 Thiết bị và dụng cụ
Sử dụng phương tiện nghiên cứu có tại Viện nghiên cứu và Phát triển Công nghệ
Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
* Thiết bị, dụng cụ nhân giống Vi sinh vật
- Tủ lạnh
- Tủ ủ vi sinh vật Incucell 111 (Đức)
- Tủ cấy vi sinh vật (Pháp)
- Máy lắc mẫu GFL 3005 (Đức)
- Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi- international (Đức)
- Máy đun nóng
- Máy quang phổ spectronic 20
- Bộ micropipette P10, P20, P100,P1000 (Đức)
- Tủ sấy EHRET (Đức)
- pH kế Orion 420A (Mỹ)
- Kính hiển vi quang học Olympus CH-2

Trang 17


Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

- Đĩa petri, ống nghiệm, bình Erlenmeyer 100ml-500ml, bình tam giác, cốc
đựng dung dịch, chai lọ thủy tinh
- Đèn cồn, que cấy, tiêm bơm, bộ lọc vi khuẩn

8g/l

+ MgCl2.6H2O

1g/l

+ NH4Cl

0,3g/l

+ FeCl3.6H2O

0,04g/l

+ Trace element

1ml/l

+ Sodium phytate

3g/l

+ Biotin/ yeast extract

0,01g/l

+ CaCl2.2H2O

5g/l


+ MnSO4

0,01g/l

Trang 19


Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phân lập nấm mốc trên môi trường có phytate
Tiến hành phân lập các dòng nấm mốc sinh phytase từ các mẫu thức ăn, phân gia
cầm, đất... thu thập được.
Phương pháp phân lập:
Ủ các mẫu thu thập trên môi trường M2. M2 là môi trường dinh dưỡng có bổ sung
phytase như là nguồn phosphor duy nhất. Vì phytate không tan nên làm cho môi
trường M2 có màu trắng đục.
Chỉ những dòng nấm mốc nào có khả năng sử dụng phytate trong môi trường tức là
có thể tổng hợp phytase mới có thể phát triển trên môi trường này. Khi tổng hợp
phytase hòa tan phytate nên làm cho một vùng môi trường trở nên trong, vùng đó
gọi là halo.
Những dòng nấm mốc có khả năng sinh phytase sẽ tạo ra halo lớn, phytase sinh ra
càng nhiều thì vùng halo càng lớn. Căn cứ vào kích thước halo này để chọn những
dòng nấm mốc sinh nhiều phytase cho các thí nghiệm về sau.
Cấy chuyển từ 3 đến 4 lần trên môi trường M2 nhằm làm cho các dòng nấm mốc đạt
độ ròng.
Cấy riêng lẻ các dòng nấm mốc vào môi trường đặc, sau 16h sẽ tiến hành đo kích
thướt halo và so sánh với nhau.

1 dung dịch

NT3

Bột đậu nành với dung dịch chứa nấm mốc 2 theo tỉ lệ 3 đậu nành –
1 dung dịch

NT4 (đối
chứng 2)

Phân hữu cơ với nước cất vô trùng

NT5

Phân hữu cơ với dung dịch chứa nấm mốc 1 theo tỉ lệ 3 phân – 1
dung dịch

NT6

Phân hữu cơ với dung dịch chứa nấm mốc 2 theo tỉ lệ 3 phân – 1
dung dịch

 Cách chủng
Chủng nấm mốc với phân hữu cơ và bột đậu nành theo tỉ lệ 3:1 (3 cơ chất : 1
dung dịch nấm mốc).
Chuẩn bị hộp nhựa hoặc bọc nylon vô trùng. Cân 450g cơ chất và 150ml dịch
nấm mốc đã chuẩn bị trước.
Đối với phân hữu cơ cho vào 1 lần đậy kín, ủ trong 20 ngày.

Trang 21

màu, lên thể tích bằng nước cất tới vạch và lắc đều, để yên 10 – 20 phút đem đo trên

Trang 22


Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

máy so màu ở bước sóng 880nm. (Chuẩn bị mẫu blank giống như thật nhưng không
có mẫu phân hữu cơ).
Đường chuẩn: từ dung dịch chuẩn 0,1 mg/ml P2O5, hút lần lượt 1, 2, 3, 4, 5
ml cho vào bình định mức 5ml, thêm vào 20ml nước cất và cho hóa chất làm giống
dung dịch trích, đo trên máy đo OD ở bước sóng 880nm.
Cách tính kết quả
P2O5 (mg/1g mẫu khô)= a  v 100  k/(%m  vi)
Trong đó:
a (mg): Số P2O5 tìm đo trên đồ thị
v (ml): Thể tích dung dịch trích P dễ tiêu trong đất
Vi (ml): Thể tích dịch trích mang đi so màu
K: hệ số khô kiệt của mẫu.
 Đối với mẫu bột đậu nành
Khảo sát các chỉ tiêu protein dễ tiêu bằng phương pháp Kjeldahl, đo lân hòa tan
bằng phương pháp so mẫu còn calcium được đo bằng phương pháp ASS.

Trang 23


Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ


Có

6

Có

7

Có

8

Không

Bảy dòng nấm mốc (từ 1 tới 7) có khả năng tạo halo trên môi trường với phytate là
nguồn phosphor duy nhất chứng tỏ chúng có khả năng sản sinh enzyme phytase.
Hai dòng 6 và 7 tạo halo lớn nhất chứng tỏ chúng có khả năng sản xuất phytase
nhiều nhất sẽ được chọn để nhân giống trong môi trường lỏng dùng cho các thí
nghiệm tiếp theo.

Trang 24