BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC
œ&•
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
PHÂN LẬP MỘT SỐ DÒNG VI KHUẨN CỐ
ĐỊNH ĐẠM Azospirillum TRÊN LÚA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
PGS. TS. NGUYỄN HỮU HIỆP LÊ HOÀNG THĂNG
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT LỚP CÔNG NGHỆ SINH HỌC
TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA 30
tốt nhất giúp tôi học tập và thực hiện đề tài này.
- Bạn Nguyễn Như Phương và Bùi Việt Sang lớp Công Nghệ Sinh
Học Khóa 30, đã luôn động viên và giúp đỡ tôi những lúc khó khăn trong quá
trình thực hiện đề tài.
LÊ HOÀNG THĂNG
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
MỤC LỤC
TÓM LƯỢC...........................................................................................Trang 1
ABSTRACT ...........................................................................................Trang 1
PHẦN I. ĐẶT VẤN ĐỀ.........................................................................Trang 2
PHẦN II – LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
I. Giới thiệu về cây lúa
1. Oryza satival L...............................................................Trang 4
2. Oryza rufipogon Griff.....................................................Trang 4
3. Đặc điểm sinh trưởng của lúa.........................................Trang 4
4. Tình hình sản xuất lúa gạo ở Việt Nam...........................Trang 4
II. Tầm quan trọng của đạm đối với lúa.........................................Trang 5
III. Sự cố định đạm sinh học.........................................................Trang 6
IV. Vai trò của Azospirillum trong nông nghiệp
1. Sơ lược về vi khuẩn Azospirillum ...................................Trang 7
2. Các nghiên cứu về sự cố định đạm sinh học của Azospirillum
. ...........................................................................................Trang 9
V. Một số kỹ thuật trong sinh học phân tử.
1. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)..................Trang 10
2. Điện di agarose gel........................................................Trang 11
PHẦN III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
I. Địa điểm và thời gian.
1. Địa điểm........................................................................Trang 12
2. Thời gian.......................................................................Trang 12
II. Vật liệu thí nghiệm..................................................................Trang 12
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
I. Kết luận....................................................................................Trang 32
II. Đề nghị....................................................................................Trang 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................Trang 33
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1: Nguồn gốc cây chủ, xuất xứ và một số đặc tính của các dòng vi khuẩn đã
phân lập trên lúa trồng và lúa hoang..........................................Trang 23
Bảng 1: Nguồn gốc cây chủ, xuất xứ và một số đặc tính của các dòng vi khuẩn đã
phân lập trên lúa trồng và lúa hoang (tt)....................................Trang 24
Bảng 1: Nguồn gốc cây chủ, xuất xứ và một số đặc tính của các dòng vi khuẩn đã
phân lập trên lúa trồng và lúa hoang (tt)....................................Trang 25
Bảng 2. Màu môi trường, màu sắc và đường kính khuẩn lạc của các dòng vi
khuẩn đã phân lập......................................................................Trang 26
Bảng 2. Màu môi trường, màu sắc và đường kính khuẩn lạc của các dòng vi
khuẩn đã phân lập (tt)................................................................Trang 27
Bảng 3: Kết quả nhuộm Gram và đo hình dạng tế bào............................Trang 28
Bảng 3: Kết quả nhuộm Gram và đo hình dạng tế bào (tt).......................Trang 29
Bảng 3: Kết quả nhuộm Gram và đo hình dạng tế bào (tt).......................Trang 30 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
DANH SÁCH HÌNH
wild rice, winter crop and high productivity rice in some provines of the Mekong
Delta. These strains have some characteristics which are the same to the
descriptions of previous research. All of them are negative Gram, motile, short
rods or long rods, short rods in pair, white or blue colony... Using PCR technique
with specific primers of nifH gen, 2 strains AR8 and AR41 strains were identified
Azospirillum lipoferum.
Key words: Azospirillum lipoferum, wild rice, PCR, nifH.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
SVTH: Lê Hoàng Thăng Lớp: Công Nghệ Sinh Học K.30
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp Trang 2
PHẦN I - ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây lúa (Oryza sativa L.) thuộc họ Hòa Bản, là cây lương thực quan trọng
cho khoảng 3 tỷ người trên thế giới, đặc biệt ở các nước đang phát triển như Việt
Nam. Năm 2007, sản lượng lúa thế giới đạt khoảng 645 triệu tấn (International
Rice Research Institute (IRRI), 2007). Trong tình hình dân số thế giới đông (hơn
6,6 tỷ người) ngày càng tăng như hiện nay, nhu cầu về lương thực là rất quan
trọng. Theo dự đoán của các chuyên gia về dân số học, nếu dân số thế giới tiếp
tục gia tăng trong vòng 20 năm tới, thì sản lượng lúa gạo phải tăng 80% mới đáp
là một trong những nguyên nhân gây ra hiệu ứng nhà kính
(Shenoy và ctv, 2001).
Khi bón phân đạm vào đất, cây trồng chỉ hấp thu khoảng 40 - 50% lượng
phân bón, lượng còn lại bị nước mưa, nước tưới rửa trôi, hoặc bị chuyển hóa và
bốc hơi ở dạng NH
3
, NO
x
, N
2
(Nguyễn Huy Phiêu, 2000). Bên cạnh đó, sự lạm
dụng quá nhiều phân bón hóa học để gia tăng năng suất đã làm cho đất đai ngày
càng bạc màu, độ phì nhiêu kém dần, tình trạng ô nhiễm nguồn nước mặt gây nên
hiện tượng nước nở hoa, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe và môi trường sống
của con người cũng như các sinh vật khác trong tự nhiên (Shenoy và ctv, 2001;
Huỳnh Thu Hòa, 2006). Vì vậy, việc gia tăng bón phân đạm hóa học chỉ là giải
pháp tạm thời, không thể áp dụng lâu dài bởi chúng phát sinh nhiều mối lo ngại.
Việc nghiên cứu và sử dụng phân sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật, đã
được nhiều nước trên thế giới quan tâm trong đó có Việt Nam, nhằm tạo ra một
sản phẩm sạch, giảm bớt chi phí đầu tư sản xuất trong nông nghiệp và bảo vệ môi
trường hướng tới xây dựng một nền nông nghiệp bền vững.
Qua nhiều nghiên cứu, dòng vi khuẩn Azospirillum có khả năng cố định
đạm giúp tăng suất cây trồng đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu. Dòng
Azospirillum với nhiều đặc điểm thuận lợi như: có khả năng cố định đạm tự do
trong không khí, tổng hợp được các chất kích thích sinh trưởng làm hệ thống rễ
phát triển vững chắc, hấp thu nước và chất dinh dưỡng tốt (Okon, 1985).
Việc nghiên cứu và ứng dụng các dòng Azospirillum làm phân bón trong
nông nghiệp là rất cần thiết, đặc biệt trên lúa nhằm thay thế một lượng đạm hóa
học đáng kể cho cây, bảo vệ môi trường và góp phần bảo vệ sức khoẻ cộng đồng.
Đồng thời, gia tăng sản lượng lúa, tăng thu nhập cho người nông dân.
gần như bị tiêu diệt hết, vì vậy để bảo tồn nguồn gen quí này người ta đã đưa
giống lúa hoang sang viện lúa Quốc Tế IRRI để lưu trữ (http://www. viettribune.
com /vt/ index.php?id=629).
3. Đặc điểm sinh trưởng của lúa.
Thời gian sinh trưởng tính từ lúc nảy mầm cho đến lúc chín khoảng 90
đến 180 ngày, tùy theo giống, điều kiện ngoại cảnh và thời vụ gieo cấy.
Về mặt nông học có thể chia thành 3 thời kỳ: sinh trưởng dinh dưỡng
từ lúc nảy mầm; sinh trưởng sinh sản từ làm đòng đến trổ bông và thời kỳ chín từ
trổ bông đến thu hoạch. Nắm được qui luật sinh trưởng, phát triển của cây lúa,
chúng ta có thể chủ động áp dụng các biện pháp kỹ thuật theo hướng có lợi nhất
cho quá trình sinh trưởng và phát triển nhằm tạo năng suất cao.
4. Tình hình sản xuất lúa gạo ở Việt Nam.
Đối với Việt Nam cây lúa có vai trò quan trọng trong việc giải quyết
nhu cầu lương thực cho nhân dân. Gắn liền với quá trình phát triển của lịch sử,
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
SVTH: Lê Hoàng Thăng Lớp: Công Nghệ Sinh Học K.30
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp Trang 5
cây lúa được coi là người bạn gần gũi nhất đối với đồng ruộng và người nông
dân. Với tập quán canh tác và tiêu dùng lúa gạo, hàng năm lúa gạo đáp ứng trên
80% nhu cầu lương thực của cả nước. Người ta thống kê được, sản lượng lúa
vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long đã tăng từ 9,5 triệu tấn (năm 1990) lên 19,2
triệu tấn (năm 2007) ( và http:
//www. sgtt.com.vn/detail3.aspx?newsid=32713&fld=HTMG/2008/0410/32713).
Vụ lúa đông xuân năm 2008, tổng sản lượng toàn vùng Đồng Bằng
Sông Cửu Long đạt 9,4 triệu tấn, tăng 300 ngàn tấn so với năm 2007. Tính chung
cả nước thì vụ đông xuân năm 2008 này sản lượng lúa đạt 17,2 triệu tấn, tăng
khoảng 200 ngàn tấn so với vụ trước (
Trang 6
thống rễ kém phát triển; lá mỏng, kém hấp thu năng lượng ánh sáng mặt trời, dễ
bị côn trùng phá hoại, đồng thời dễ đổ ngã dẫn đến năng suất giảm.
Đối với cây lúa, đạm là yếu tố rất quan trọng quyết định năng suất,
mùa vụ. Mất khoảng 1kg đạm để sản xuất 15 - 20kg lúa (Shenoy và ctv, 2001).
Trong cây lúa, đạm tập trung nhiều ở phiến lá hơn là các cơ quan khác và cũng là
nguồn protein chủ yếu cho sự hình thành hạt, chính vì vậy đạm mang lại hiệu quả
cao trong thực tế sản xuất rõ hơn các yếu tố khoáng khác.
Theo Nguyễn Huy Phiêu (2000), bình quân từ một ha đất lúa có thể
huy động được 30 - 50kg đạm, nhưng một vụ lúa một ha đất mất đi tới 150kg
đạm. Nếu không bón đủ để bù đắp lượng dinh dưỡng lấy đi do nông phẩm cũng
như thất thoát do rửa trôi thì không thể duy trì độ phì nhiêu và nâng cao năng
suất cây trồng được. Người ta dự đoán, nhu cầu phân đạm ở Việt Nam sẽ tăng từ
1.271.000 tấn (năm 2000) lên 1.627.000 tấn (năm 2010) (inap.
org/vietnam/fertilizer.html).
III. Sự cố định đạm sinh học.
Khí quyển là nguồn dự trữ đạm N
2
rất lớn, trong khoảng không khí
bên trên mỗi km
2
đất đai có khoảng 8 triệu tấn nitơ. Tuy nhiên, loại nitơ này cây
trồng không thể hấp thu được trực tiếp mà phải được vi sinh vật biến đổi thành
NO
3
−
hoặc khử thành NH
4
+
, , HCN,…thành các sản phẩm tương
ứng như: C
2
H
4
, CH
3
NH
2
… (Nguyễn Lân Dũng và ctv, 1997).
Theo Evans và Barber (1977) thì quá trình cố định đạm xảy ra như sau:
N
2
+ H
2
+ 6e NH
3NH
3
được tạo thành sẽ kết hợp với acid hữu cơ tạo thành protein:
NH
3
+ Acid hữu cơ Acid amino Protein
Chính vì vậy mà vai trò của sự cố đinh đạm sinh học có một ý nghĩa
hết sức quan trọng đối với nông nghiệp, nhất là đối với các nước có nền công
nghiệp sản xuất phân hóa học chưa phát triển mà Việt Nam là một ví dụ điển
Ngoài ra, Nguyễn Hữu Hiệp và ctv (2005) cũng tìm ra dòng vi khuẩn
Azospirillum cố định đạm cộng sinh với cây không thuộc họ đậu.
Vi khuẩn Azospirillum là vi khuẩn cố định đạm hiện diện trong rễ,
vùng đất quanh rễ, thân và lá của cây. Chúng sống tự do trong đất hay cộng sinh
với rễ của các loại ngũ cốc, các loại cây cỏ và cây có củ (Döbereiner và ctv,
1995).
Azospirillum lipoferum là một trong bảy loài vi khuẩn đã được phát
hiện: Azospirillum lipoferum, Azospirillum brasilense (Tarrand và ctv, 1978);
Azospirillum amazonese (Magalhaes và ctv, 1983); Azospirillum halopraeferrans
(Reinhold và ctv, 1987); Azospirillum irkense (Khanmas và ctv, 1989); hai loài
còn lại là Azospirillum doebereinerae và Azospirillum largomobile được Dekhil
và ctv tìm ra năm 1997. Chúng có những đặc điểm chung như: là vi khuẩn Gram
âm, hình que cong hay hình chữ S, chiều rộng 1,0 - 1,5µm, sinh trưởng tốt ở
30
0
C và pH từ 6,0 - 7,0 (Bashan và ctv, 2004). Azospirillum có thể chuyển động
được trong môi trường lỏng nhờ có những chiên mao dài ở một đầu (polar
flagellum) tế bào (Đào Thanh Hoàng, 2005).
Vi khuẩn thuộc loài Azospirillum lipoferum sinh trưởng dưới 2 điều
kiện hiếu khí và kỵ khí. Tuy nhiên, chúng phát triển thích hợp và tối ưu nhất ở
điều kiện vi hiếu khí với sự có mặt hoặc không của đạm trong môi trường
(Döbereiner và Pedrosa, 1987). Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của những vi
khuẩn này là 35 - 37
0
C. Khuẩn lạc của chúng phát triển trên môi trường agar -
khoai tây có màu hồng nhạt hay đậm.
Azospirillum có thể tiết ra những kích thích tố tăng trưởng thực vật như
IAA (Indole - 3 - acetic acid), IBA (Indole - 3 - butyric acid), ABA (Abscisic
acid) và Cytokynin (Bashan và Levanony, 1990). Sự sản xuất hormone thực vật
của vi khuẩn Azospirillum đã làm tăng chiều dài rễ, tăng hấp thu khoáng, từ đó
Theo dữ liệu của thế giới ở thập kỷ qua, khi ủ thử nghiệm hột giống
với Azospirillum hoặc kết hợp với vi khuẩn cố định đạm khác dẫn đến kết quả là
vi khuẩn có khả năng gia tăng sản lượng nông nghiệp trên những loại đất và khu
vực khác nhau (Sumner và ctv, 1990; Fages và ctv, 1994). Điều này được giải
thích như sau: khi ủ hạt giống với vi khuẩn với Azospirillum không chỉ giúp cố
định đạm trong vùng rễ mà còn làm cho hệ thống rễ phát triển nhiều hơn, gia
tăng diện tích tiếp xúc của rễ với đất nhờ đó mang lại hiệu quả cao trong sự thẩm
thấu nước và chất dinh dưỡng, giúp tăng năng suất cây trồng (Bashan và
Holguin, 1997; Boddey và ctv, 1986).
v Một số nghiên cứu về Azospirillum tại Việt Nam
Theo Nguyễn Thái Huy (1999), sử dụng phân đạm vi sinh (nhóm
Azospirillum, loài Pseudomonas, Enterobacter...) cho thấy lúa có thể tăng năng
suất 10 - 15%, tiết kiệm được 30 - 40 kg đạm/ha.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
SVTH: Lê Hoàng Thăng Lớp: Công Nghệ Sinh Học K.30
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp Trang 10
Tại Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Việt Nam, ở bộ môn Vi
sinh vật học, thí nghiệm về xử lý mầm mạ với chế phẩm Azospirillum cho thấy
mạ cứng chắc và lớn hơn, chống chịu rét tốt hơn nếu mạ gặp rét đậm kéo dài
(dưới 10
0
C). Lúa chín sớm hơn từ 3 - 5 ngày so với cây lúa không xử lý với chế
phẩm Azospirillum (Nguyễn Bảo Vệ, 2004).
Theo Phạm Thị Ngọc Lan và Lý Kim Bảng (2004), số lượng vi khuẩn
cố định đạm trong mẫu đất phân lập (trong đó có Azospirillum) đạt từ 414,0 -
428,3 CFU/g đất khô tuyệt đối và khi xử lý hạt của giống lúa Khang Dân với
nồng độ vi khuẩn 10
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Copyright: Tài liệu đại học ©