BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN LÊ QUANG DŨNG
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG
VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ TỰ DO Azotobacter sp.
TRÊN MỘT SỐ LOẠI ĐẤT Ở ĐĂK LĂK
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011

lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu làm luận văn tốt nghiệp.

Đăk Lăk, tháng 10 năm 2011.
Tác giả

Lê Quang Dũng
DANH MỤC CÁC BẢNG
2.1 Nồng ñộ IAA thành lập ñồ thị ñường chuẩn 29

3.1 Ký hiệu, ñịa ñiểm phân lập các chủng vi khuẩn trên môi trường Ashby 34
3.2 Mô tả Hình thái khuẩn lạc của 24 chủng vi khuẩn phân lập ñược 36
3.3 Khả năng cố ñịnh nitơ của các chủng vi khuẩn Azotobacter sp. 40
3.4 Khả năng sinh IAA của các chủng vi khuẩn Azotobacter sp. 42
3.5 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn Azotobacter sp. ñến số lá cây cải ngọt 44
3.6 Ảnh hưởng các chủng vi khuẩn Azotobacter sp. ñến chiều cao cây cải ngọt 45
3.7. Ảnh hưởng của các chủng VK Azotobacter sp. ñến khối lượng rễ cây cải 47
3.8. Ảnh hưởng của các chủng VK Azotobacter sp. ñến năng suất cây cải ngọt 48
3.9. Ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn Azotobacter sp. ñến số lá cây cải ngọt 50
3.10. Ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn Azotobacter sp. ñến chiều cao cây cải ngọt 52
3. 11. Ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn Azotobacter sp. ñến khối lượng rễ cây cải ngọt 53
3.12. Ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn lên diện tích lá cây cải ngọt 55
3.13. Ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn Azotobacter sp. ñến năng suất cây cải ngọt 56
3.14. Hàm lượng nitơ tổng số (mg/l) của 4 chủng vi khuẩn Azotobacter sp. tuyển
chọn nuôi cấy từ các nguồn carbon khác nhau. 58
3.15. Hàm lượng nitơ tổng số (mg/l) của 4 chủng vi khuẩn Azotobacter sp.
tuyển chọn nuôi cấy ở các nồng ñộ glucose khác nhau 61
3.16. Hàm lượng nitơ tổng số (mg/l) của bốn chủng vi khuẩn Azotobacter sp.
tuyển chọn nuôi cấy trên các khoản nhiệt ñộ khác nhau 63
3.17. Hàm lượng nitơ tổng số (mg/l) của 4 chủng vi khuẩn Azotobacter sp.
tuyển chọn ñược nuôi cấy ở các pH khác nhau 65

được thực hiện bởi các nhóm vi sinh vật trong đất, trong đó có sự đóng góp của
nhóm vi khuẩn cố định nitơ tự do Azotobacter sp. Các vi sinh vật thuộc nhóm

này có khả năng chuyển hóa nitơ phân tử thành các hợp chất chứa nitơ mà cây
trồng có khả năng hấp thụ được [3].
Azotobacter sp. là một loại vi khuẩn hiếu khí, sống tự do trong đất, chúng
có khả năng cố định đạm cao và không phụ thuộc vào cây chủ. Ngoài đặc điểm
trên thì một số chủng thuộc chi này còn có khả năng sinh tổng hợp nên IAA
(chất kích thích sinh trưởng ở thực vật). Chính nhờ đặc điểm quan trọng đó vi
khuẩn Azotobacter sp. được ứng dụng rộng rãi trong các chế phẩm phân bón vi
sinh vật làm tăng năng suất cây trồng.
Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về vi sinh vật cố định nitơ
tự do trên một số loại đất để làm phân vi sinh, nhưng hiện nay chưa có một
nghiên cứu nào về thành phần loài thuộc chi Azotobacter sp. trên một số loại đất
ở Đăk Lăk.
Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập
và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố ñịnh nitơ tự do Azotobacter sp. trên
một số loại ñất ở Đăk Lăk”.
2. Mục tiêu của ñề tài
- Tuyển chọn được một số chủng Azotobacter sp. cố định đạm cao trên một
số loại đất ở Đăk Lăk.
- Đánh giá hiệu quả của một số chủng vi khuẩn Azotobacter sp. đối với sự
sinh trưởng của cây cải ngọt (Brassica juncea)
3. Ý nghĩa của ñề tài
Ý nghĩa khoa học
Đề tài góp phần phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn Azotobacter sp.
bản địa có khả năng cố định đạm cao trên một số loại đất ở Đăk Lăk, góp phần
vào công công tác bảo tồn đa dạng vi sinh vật ở Đăk Lăk và Tây Nguyên.
Ý nghĩa thực tiễn
Đề tài là cơ sở cho việc lựa chọn các chủng Azotobacter sp. trên một số
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Nguồn nitơ trong tự nhiên
Trong nước, nitơ chủ yếu ở dạng hợp chất của NH
4
+
, NO
2
-
, NO
3
-
. Trong đất
có 2 dạng nitơ tồn tại đó là nitơ vô cơ trong các muối khoáng và nitơ hữu cơ
trong xác, chất bài tiết từ sinh vật. Các hợp chất chứa nitơ trong xác, chất bài tiết
của động vật và thực vật bị một số loại nấm và vi khuẩn phân giải.
Trong đất amon hầu như chuyển hóa toàn bộ thành hợp chất nitrat. Phần lớn
hợp chất nitrat được thực vật hấp thụ, phần còn lại bị mất đi do mưa rửa trôi và
tác dụng của phản nitrat hóa.
Hợp chất đạm mà thực vật hút từ đất một phần như gốc rễ được trả lại đất,
phần còn lại được động vật và thực vật dị dưỡng tiêu thụ, lại biến thành các chất
bài tiết trả lại đất. Những chất hữu cơ này dưới tác dụng của nhiều loại vi sinh
vật, nấm bị khử thành đạm ở dạng hữu hiệu.
Nitơ trong không khí tồn tại chủ yếu ở dạng nitơ phân tử (N
2
) chiếm khoảng
80%, ở dạng nguyên tử kép (N
2

quá trình sinh học đặc biệt - quá trình cố định nitơ. Nhóm vi sinh vật có khả năng
thực hiện quá trình này được gọi là các vi sinh vật cố định nitơ. Việc sử dụng
phân bón vi sinh làm đất không bị ô nhiễm, khả năng giữ ẩm tốt hơn, tăng cường
khả năng cải tạo đất do các hệ sinh vật có ích hoạt động mạnh làm cho đất tơi
xốp hơn, cây dễ hút chất dinh dưỡng hơn. Ngoài ra, còn có các con đường tạo
nitơ khác như do sấm chớp hay cháy [12].
1.2. Vai trò của nitơ ñối với thực vật
Nitơ là thành phần quan trọng cấu tạo nên các phân tử hữu cơ như protein,
diệp lục, ATP… Hàm lượng nitơ trong thành phần các chất khô của thực vật dao
động từ 1 – 3%. Tuy hàm lượng trong cây thấp nhưng nitơ có vai trò sinh lý đặc
biệt quan trọng trong đời sống sinh trưởng phát triển và hình thành năng suất của
cây trồng. Thiếu nitơ, cây sinh trưởng kém, chlorophyll không được tổng hợp
đầy đủ, lá vàng, đẻ nhánh và phân cành kém, sút giảm hoạt động quang hợp nên
năng suất giảm. Nếu thừa nitơ cũng sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng đến sinh trưởng,
phát triển và năng suất của cây trồng. như cây sinh trưởng mạnh thân lá tăng
nhanh nên cây rất yếu, dễ đổ, thu hoạch gặp nhiều khó khăn.
1.3. Quá trình chuyển hóa nitơ trong tự nhiên
1.3.1. Quá trình khoáng hóa
Quá trình khoáng hóa là quá trình phân hủy xác hữu cơ dưới tác động của
quần thể vi sinh vật thành các chất khoáng hòa tan hay các chất khí và tỏa nhiệt,
tùy thuộc vào điều kiện khoáng hóa mà cho các sản phẩm khác nhau. Giai đoạn
này có sự tham gia của các chủng vi sinh vật nitrat hóa như Nitrosomonas và
Nitrobacter - những vi khuẩn tham gia vào quá trình oxy hóa những hợp chất
chứa nitơ thành nitrat (NO
3
-
), một dạng thích hợp để cho cây trồng hấp thu.

 Cơ chế hóa sinh của quá trình cố ñịnh nitơ của vi khuẩn sống tự do
trong ñất.
NO
3
-

Vi khuẩn phản nitrat hóa
N
2
N
2
+ H
2
Nitrogenase
Vi khuẩn cố ñịnh ñạm
NH
3
H
2
O
NH
4
+

NH
4
+

2
và có thể nêu ra giả
thuyết về 2 con đường cố định N
2
của vi khuẩn sống tự do trong đất như sau:

Trong công nghiệp, nhờ các chất xúc tác nên năng lượng dùng cho phản
ứng cố định N
2
được giảm nhiều, chỉ vào khoảng 16 – 20 Kcal/M, song lượng
năng lượng vẫn còn lớn so với trong cơ thể sinh vật. Tốc độ phản ứng nhanh
chóng trong tế bào vi sinh vật ở nhiệt độ thấp nhờ có hệ thống hydrogenase hoạt
hóa H
2
và nitrogenase hoạt hóa N
2
.
Năm 1961 – 1962, người ta đã tách từ Clostridium pasteurrianum hai tiểu
phần hoạt hóa H
2
và N

Trong các nốt sần có một chất có bản chất HEM rất giống với hemoglobin trong
máu gọi là leghemoglobin. Nó dễ dàng liên kết với O
2
để biến thành
oxyhemoglobin. Leghemoglobin chỉ được tạo nên khi vi khuẩn sống cộng sinh
với cây bộ đậu, còn khi nuôi cấy tinh khiết các Rhizobium sẽ không tạo
leghemoglobin và không cố định được N
2
. Những nghiên cứu gần đây về quá
trình cố định N
2
cho thấy quá trình cố định này đòi hỏi:
Có sự tham gia của enzyme nitrogenase. Có thể coi đây là nhân tố chìa khóa
cho quá trình này. Enzyme này hoạt động trong điều kiện yếm khí.
Có lực khử mạnh với thế năng khử cao (NAD, NADP, )

Có năng lượng ATP đủ và có sự tham gia của nguyên tố vi lượng. Nhóm
hoạt động của enzyme nitrogenase có chứa Mo và Fe. Vì vậy sử dụng Mo và Fe
cho cây họ đậu thường có hiệu quả rất cao.
Tiến hành trong điều kiện yếm khí. Các chất khử là NADH
2
và Fd cùng với
năng lượng do hô hấp, quang hợp của cây chủ cung cấp. Sự cố định N
2
cần rất
nhiều năng lượng, cần 16 ATP để khử 1 N
2
. NH
3
tạo thành trong quá trình cố

Fe protein) còn gọi là thành phần I, thành phần kia gọi là
protein sắt (Fe protein), còn gọi là nitrogenase khử hay thành phần II. Thành
phần I và thành phần II của nitrogenase đều rất mẫn cảm với oxy, vì vậy nên
hoạt động cố định nitơ của vi sinh vật diễn ra trong điều kiện kỵ khí [18].
1.4 . Tổng quan về vi khuẩn cố ñịnh Nitơ
Người ta nhận thấy muốn thu hoạch 12 tạ hạt trên mỗi hecta, cây trồng lấy
đi khỏi đất khoảng 30 kg nitơ [3]. Theo thống kê hàng năm các sản phẩm nông
nghiệp trên thế giới lấy đi khỏi đất khoảng 100 – 110 triệu tấn nitơ (G. Colar và
Greenland) [3]. Trong khi đó lượng phân nitơ hóa học hiện nay chỉ bù đắp được
một phần lượng nitơ mà cây lấy đi khỏi đất, những tổn thất về nitơ được bù đắp
bởi một quá trình sinh học đặc biệt gọi là quá trình cố định nitơ do vi sinh vật
thực hiện, chúng có khả năng chuyển hóa nitơ phân tử trong không khí thành các

hợp chất chứa nitơ và làm giàu thêm nguồn đạm trong đất, có thể xếp chúng
thành ba nhóm lớn:
+ Nhóm vi sinh vật sống cộng sinh với thực vật.
+ Nhóm vi khuẩn sống tự do.
+ Nhóm vi khuẩn lam.
1.4.1. Nhóm Vi sinh vật sống cộng sinh với thực vật
1.4.1.1. Vi khuẩn nốt sần cộng sinh với cây bộ ñậu
Nhà khoa học Hà Lan M.W. Beijrinck đã phân lập được loài vi khuẩn sống
cộng sinh trong nốt sần ở rễ một cây thuộc bộ đậu và ông đặt tên là Bacillus
radicicola, vi khuẩn này được xếp vào chi riêng Rhizodium.
Trên môi trường đặc, vi khuẩn nốt sần thường có khuẩn lạc trơn bóng, nhầy,
vô màu. Khi còn non tế bào của chúng có dạng hình que hoặc cầu

0,5 – 0,9 x 1,2 – 3,0µm, có khả năng di động nhờ tiêu mao; khi già tế bào trở nên
bất động kích thước lớn phân nhánh gọi là thể giả khuẩn [3], [8].
Đây là các loài hiếu khí, tuy nhiên vi khuẩn nốt sần vẫn có thể sử dụng
được ngay cả ở trong trường hợp chỉ có một áp lực oxy rất thấp khoảng 0.01atm.

1.4.2. Nhóm Vi khuẩn cố ñịnh nitơ tự do
1.4.2.1. Vi khuẩn cố ñịnh nitơ tự do kỵ khí Clostridium
Clostridium được phát hiện lần đầu tiên bởi Vinogradxki (1893). Tế bào
Clostridium hình que có kích thước 2,5 – 7,5 x 0,7 – 1,3 µm, có thể đứng riêng
rẽ hoặc kẹp đôi thành chuỗi ngắn. Khi còn non có khả năng di động, khi già mất
khả năng di động, bào tử nằm ở trung tâm, khuẩn lạc nhẵn và trắng có khả năng
chịu được nhiệt độ cao và khô hạn [5].
Vi khuẩn Clostridium có nhiều loài có khả năng cố định nitơ phân tử như:
Cl. pasteurianum, Cl. butylicum nhưng loài có khả năng cố định đạm cao nhất
là Clostridium pasteurianum. Chúng có khả năng cố định được 5 – 10 mg nitơ
khi tiêu thụ hết 1g carbon. Phạm vi hoạt động cố định nitơ của Clostridium trong
khoảng pH khá rộng 4,7 – 8,5, tối thích là 6,9 – 7,3.

1.4.2.2. Vi khuẩn cố ñịnh nitơ tự do hiếu khí
Nhóm này gồm hai chi chính là Beijerinskia sp. và Azotobacter sp.
1.4.2.2.1. Nhóm vi khuẩn thuộc chi Beijerinskia sp.
Beijerinskia sp. là loài vi khuẩn hiếu khí cố định nitơ rất giống với
Azotobacter sp. Chúng được phân lập bởi R. J. Starkey (1939), tế bào có hình
dạng thay đổi như hình cầu, hình que, hình bầu dục. Beijerinski là vi khuẩn gram
âm, không sinh bào tử và bào xác, đặc điểm chung của vi khuẩn thuộc chi này là
chịu chua cao. Có khả năng sống tốt trong môi trường acid (pH=3), và nhiệt độ
từ 16 – 37
O
C.
Trên môi trường vô đạm, sau 3 ngày nuôi cấy xuất hiện khuẩn lạc nhầy. Lồi.
Vi khuẩn có khả năng cố định được 16 – 20 mg nitơ khi đồng hóa hết 1g dinh
dưỡng carbon. Ngoài khả năng cố định nitơ chúng còn có khả năng tổng hợp các
chất kích thích sinh trưởng cho cây trồng.
1.4.2.2.2. Nhóm vi khuẩn thuộc chi Azotobacter sp.
Azotobacter sp. đuợc phân lập lần đầu tiên vào năm 1901 (M. Beijerinck).

không khuếch tán ra môi trưòng nuôi cấy.
+ Azotobacter vinelandii: Tế bào có kích thước 1,5 x 3,4 µm, có khả năng
di động và hình thành nang xác. Khuẩn lạc màu lục huỳnh quang, sắc tố khuếch
tán vào môi trường [19], [26].
+ Azotobacter agilis: Tế bào có kích thước 2,8 x 3,3 µm, có khả năng di
động, không hình thành nang xác, khuẩn lạc màu vàng lục huỳnh quang, sắc tố
khuếch tán vào môi trường [2].

1.4.3. Nhóm vi khuẩn lam
Năm 1928, Drewes (Đức) lần đầu tiên chứng minh một cách xác đáng khả
năng cố định nitơ của ba loại khuẩn lam và đã phân lập chúng một cách thuần
khiết.
Đa số các loài khuẩn lam có khả năng cố định nitơ sống tự do trong đất,
trong nước nhưng cũng có một số sống cộng sinh trong thực vật.
Đây là vi sinh vật hiếu khí, chúng thích hợp phát triển trong môi trường
trung tính hoặc kiềm. Nhiệt độ thích hợp từ 28 – 30
o
C. Chúng có khả năng cung
cấp cho đất khoảng 50 kg nitơ/ha/năm [2].
Ngoài các nhóm vi sinh vật cố định nitơ chủ yếu nói trên người ta còn thấy
nhiều vi sinh vật thuộc nhóm khác cũng có khả năng đồng hóa nitơ như: Tảo
xanh Lục, một số đại diện của nấm men và nấm mốc (Saccharomyces
apiculatus, Oidium Lactic )
Có thể nói vi sinh vật đóng vai trò hết sức quan trọng đối với nông nghiệp
trong việc cung cấp đạm sinh học cho đất. Vấn đề đặt ra cho các nhà khoa học
hiện nay là nghiên cứu phương pháp nuôi cấy hiệu quả nhất để tăng sinh khối tế
bào. Từ đó ứng dụng vào nông nghiệp, hướng đến một nền sản xuất nông nghiệp

Kapoor cũng cho kết quả tương tự khi phối hợp chủng Azotobacter sp. với các
chủng phân giải phosphat như Bacillus sp., Pseudomonas sp. Thí nghiệm làm
tăng năng suất lúa, bông vải lên 10 – 20 % [21].
El–Komy (2005) nghiên cứu phối hợp hai chủng cố định nitơ
Azospirillum và phân giải lân Bacillus megaterium xử lý cho lúa mì. Kết quả cho
thấy hàm lượng nitơ trong thân lúa mì của các thí nghiệm có xử lý hai chủng này
tăng 37 – 53 %; hàm lượng photpho trong thân tăng 48,6 %; hàm lượng kali tăng

10 – 14,3 % so với đối chứng không xử lý. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy xử
lý phối hợp hai chủng có tác dụng cộng hưởng, tốt hơn xử lý đơn chủng [18].
Zemrany (2006) nghiên cứu sử dụng chủng A. lipoferum cho ngô. Kết quả
cho thấy khi sử dụng chủng này đã làm giảm 50 % lượng nitơ cho cây mà năng
suất vẫn đảm bảo.
1.6. Nghiên cứu trong nước
Nhằm mục tiêu phát triển nông nghiệp sinh thái bền vững và ứng dụng công
nghệ sinh học vào nông nghiệp, trong những năm gần đây Việt Nam có khá
nhiều nghiên cứu về Azotobacter và Azospirillum làm phân sinh học [5].
Phạm Bích Hiên và cộng sự (2003) đã nghiên cứu 10 chủng Azotobacter của
Việt Nam và nhận thấy rằng ngoài khả năng cố định nitơ chúng còn có khả năng
sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng IAA. Nhiệt độ thích hợp của các chủng
này là 25 – 30
o
C, pH thích nghi rộng từ 5,5 – 8,0 [8].
Phạm Ngọc Lan (1999) đã phân lập được 37 chủng Azotobacter trên đất gò
đồi vùng Thừa Thiên- Huế. Nhóm nghiên cứu cũng tuyển chọn được hai chủng
có khả năng kháng sinh, tồn tại được ở pH kiềm (pH=8). Kết quả thử nghiệm
gây nhiễm cây giống keo tai tượng trong vườn ươm đã làm tăng tỷ lệ sống, sinh
khối, chiều cao cây và hàm lượng nitơ trong lá cũng cao hơn so với đối chứng
[12].
Nguyễn Thị Phương Chi (1999) nghiên cứu bón thử nghiệm chủng cố định


Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nội dung nghiên cứu
Để đạt được mục tiêu của đề tài cần tiến hành nghiên cứu các nội dung sau:
+ Phân lập, mô tả một số đặc điểm sinh học và định danh các chủng vi khuẩn
cố định nitơ tự do đã phân lập.
+ Tuyển chọn một số chủng Azotobacter sp. có hoạt tính cố định nitơ và IAA
cao.
+ Đánh giá hiệu quả của các chủng Azobacter sp. có hoạt tính cố định nitơ
cao đến khả năng sinh trưởng của loài cây cải ngọt Brassica juncea.
+ Xây dựng qui trình nuôi cấy các chủng Azotobacter sp. có hoạt tính cố định
nitơ cao.
+ Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng carbon đến sinh trưởng của Azotobacter sp.
tuyển chọn.
+ Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sinh khối Azotobacter sp.
+ Ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy đến sinh khối Azotobacter sp.
+ Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sinh khối Azotobacter sp.
2.2. Đối tượng và ñịa ñiểm nghiên cứu
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Các chủng vi khuẩn cố định nitơ tự do Azotobacter sp. được phân lập ở loại
đất bazan nâu đỏ tại Tp. Buôn Ma Thuột và huyện Krông Ana, đất xám tại
Huyện Ea Kar và huyện Buôn Đôn thuộc địa bàn tỉnh Đăk Lăk.
2.2.2. Địa ñiểm nghiên cứu

O
CaCO
3
, Na
2
MoO
4
, FeCl
3
Agar, Glucose là các hóa chất tinh khiết.
- Thiết bị nghiên cứu:
+ Đĩa petri, micropipette, ống nghiệm, que cấy, …
+ Box cấy vô trùng,
+ Máy quang phổ spectrophotometer Plus 100 (Nhật Bản)
+ Tủ ấm.
+ Nồi hấp khử trùng.
+ Máy lắc.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp phân lập
2.3.1.1. Phương pháp thu và bảo quản mẫu.
Phương pháp thu mẫu: mẫu đất được lấy cách bề mặt đất khoảng 5cm bằng
dụng cụ và túi đựng vô trùng, khoảng 100 g đất/1 mẫu. Mỗi loại hình đất nghiên
cứu được thu tại ba địa điểm khác nhau mỗi địa điểm thu 10 mẫu đất ở 10 vị trí
khác nhau, đồng nhất mẫu để có một mẫu đất cần phân tích. Mẫu thu cần phân
lập ngay hoặc bảo quản ở nhiệt độ 8
o
C.
2.3.1.2. Phương pháp pha loãng dung dịch.
- Cân 10 g mẫu đất cho vào 90 ml nước cất vô trùng.
- Chuẩn bị năm ống nghiệm đánh số thứ tự từ 1 đến 5.

NaCl : 0,2 g.
K
2
SO
4
: 0,1 g.
CaCO
3
: 5,0 g.
Agar : 20 g.
Nước cất vừa đủ :1000 ml
pH = 7
Môi trường Ashby lỏng thì không bổ sung agar.
Môi trường thạch Ashby được hấp khử trùng ở 1atm trong thời gian 30
phút. Sau đó, phân phối môi trường vào các đĩa petri.
Khi môi trường đông đặc và nguội dùng micropipet hút 100 µl dung dịch ở
các nồng độ pha loãng khác nhau cho vào đĩa (3 đĩa/1 nồng độ pha loãng). Dùng
que gạt thủy tinh dàn đều trên đĩa thạch.
Gói các đĩa đã cấy và đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 30
o
C sau 3 – 7 ngày quan sát
khuẩn lạc, mô tả và chụp hình.
2.3.1.4. Bảo quản và giữ giống thí nghiệm.

Sau khi thu đúng khuẩn lạc theo tài liệu mô tả, chọn các khuẩn lạc đơn, cấy
dòng thuần từ 4 – 5 lần, sau đó cấy vào ống thạch nghiêng, đặt vào tủ ấm ở nhiệt
độ 30
o
C.
Sau 4 – 5 ngày làm tiêu bản, quan sát dưới kính hiển vi để xác định đúng