i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐH BÀ RỊA VŨNG TÀU Độc lập – Tự do – Hạnh phúc ĐỀ TÀI ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Họ và tên: Đào Kim Ngọc Khóa: 2009 – 2013
Khoa: Hóa học và công nghệ thực phẩm. Ngành: Công nghệ thực phẩm
1. Đề tài đồ án
Phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm men phục vụ quá trình sản xuất
rượu vang từ nước ép thịt quả ca cao
2. Nội dung các phần thuyết minh
Mở đầu
Chương 1. Tổng quan tài liệu
Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Chương 3. Kết quả và thảo luận
Kết luận
3. Giảng viên hướng dẫn
ThS. Phạm Thị Hữu Hạnh
4. Ngày giao đề tài đồ án
15/03/2013
5. Ngày hoàn thành đề tài đồ án
08/07/2013 Vũng Tàu, ngày 15 tháng 07 năm 2013
TRƯỞNG BỘ MÔN GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN
(ký, ghi rõ họ tên) (ký, ghi rõ họ tên)

iii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp này, tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo khoa, quý
Thầy, Cô giảng dạy đã quan tâm giúp đỡ, cố vấn cho tôi những kiến thức chuyên
môn.
Tôi xin chân thành cảm ơn cô Phạm Thị Hữu Hạnh đã tận tình tạo điều kiện,
giúp đỡ và định hướng cho tôi trong quá trình tìm hiểu tài liệu và hoàn thành bài
báo cáo này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Nguyễn Minh Nhựt - quản
lý phòng thí nghiệm của khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm đã hỗ trở, giúp đỡ
tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài.
Đồng thời, tôi xin cảm ơn chú Trịnh Văn Thành – Giám đốc công ty TNHH
Thành Đạt đã cung cấp nguồn nguyên liệu nước ca cao để tôi hoàn thành đồ án.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn ba, mẹ, người thân cùng bạn bè đã quan tâm, chăm

Nếu sai, tôi xin chịu mọi hình thức kỹ luật theo quy định. Sinh viên thực hiện
(ký tên)

Đào Kim Ngọc

vi

DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Hình
Hình 1.1. Cây ca cao 3
Hình 1.2. Cấu tạo quả ca cao 3
Hình 1.3. Giống Forastero 4
Hình 1.4. Giống Criollo 4
Hình 1.5. Giống Trinitario 5
Hình 1.6. Rượu vang đỏ 7
Hình 1.7. Rượu vang chát 8
Hình 1.8. (a): tế bào nấm men nảy chồi; (b): tiến trình sinh sản bằng nảy chồi ở nấm
men; (c): vết sẹo sau khi nảy chồi 12
Hình 1.9. Nấm men nảy chồi và hình thành bào tử túi 13
Hình 1.10. Đường cong sinh trưởng của nấm men 16
Hình 1.11. Saccharomyces cerevisiae 18
Hình 1.12. Saccharomyces uvarum 19
Hình 1.13. Saccharomyces chevalieri 19
Hình 1.14. Saccharomyces oviformis 20
Hình 1.15. Kloeckera apiculata 20
Hình 1.16. Cơ chế phân hủy đường trong tế bào nấm men 23
Hình 1.17. Quy trình sản xuất rượu vang tổng quát 29
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 31
Hình 2.2. Sơ đồ huấn luyện giống 34
Hình 2.3. Sơ đồ phân lập nấm men 37


2
27
1.4.7. Ảnh hưởng của nồng độ rượu tạo thành 27
1.4.8. Ảnh hưởng của vi khuẩn lactic 27
1.5. Quy trình sản xuất rượu vang 29
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30
2.1. Phương tiện nghiên cứu 30
2.2. Phương pháp nghiên cứu 31
2.3. Bố trí thí nghiệm 36
2.3.1. Thí nghiệm 1. Phân lập nấm men từ nước ca cao 36
2.3.2. Thí nghiệm 2. Xây dựng đường cong sinh trưởng của loài Saccharomyces
cerevisiae và loài phân lập khi lên men nước ca cao 38
ix

2.3.3. Thí nghiệm 3. So sánh các thông số trong dịch ca cao khi lên men bằng loài
Saccharomyces cerevisiae và loài nấm men phân lập 39
2.4. Phương pháp phân tích 40
2.5. Phương pháp xử lý số liệu 46
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47
3.1. Thí nghiệm 1. Phân lập nấm men từ nước ca cao 47
3.2. Thí nghiệm 2. Xây dựng đường cong sinh trưởng của loài Saccharomyces
cerevisiae và loài phân lập khi lên men nước ca cao 49
3.3. Thí nghiệm 3. So sánh các thông số trong dịch ca cao khi lên men bằng loài
Saccharomyces cerevisiae và loài nấm men phân lập 52
3.3.1. So sánh sự thay đổi độ Brix 52
3.3.2. So sánh hàm lượng rượu tạo thành 53
3.3.3. So sánh sự thay đổi pH trong dịch ca cao lên men 55
3.3.4. So sánh đường cong sinh trưởng bằng phương pháp nhuộm tế bào và đếm
bằng kính hiển vi 56
3.4. Đánh giá cảm quan sản phẩm rượu vang ca cao lên men bằng LTM và LPL 58

được dùng rất phổ biến. Nhưng ở nước ta, sản phẩm rượu vang vẫn chưa được
quan tâm nhiều, qui mô sản xuất chủ yếu dưới dạng thủ công, lên men tự nhiên
chưa có cơ sở khoa học cũng như phương pháp hợp lí dẫn đến năng suất cũng như
chất lượng sản phẩm chưa cao.
Trong quá trình sản xuất rượu truyền thống, rượu từ nước ép thịt quả ca cao
được lên men tự nhiên do nhiều chủng nấm men có sẵn trong dịch ép. Để sản phẩm
ổn định và đạt chất lượng cao, đề tài “Phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm
men phục vụ quá trình sản xuất rượu vang từ nước ép thịt quả ca cao” được tiến
hành nhằm phân lập và chọn giống nấm men.
Từ trước đến nay, nhiều nghiên cứu sản xuất rượu ca cao từ nấm men thuần
chủng Saccharomyces cerevisiae là loại nấm men được bán ngoài thị trường. Do
đó, đề tài chọn loài này để nghiên cứu và so sánh tốc độ lên men cũng như chất
lượng sản phẩm rượu thu được từ nấm men Saccharomyces cerevisiae và nấm men
phân lập từ tự nhiên (trong nước ép từ thịt quả ca cao).
Việc nghiên cứu xem trong 2 giống nấm men trên giống nào có hoạt lực lên
men mạnh nhất, khả năng tạo rượu cao, đang là một nhu cầu thiết thực nhằm nâng
cao hiệu suất lên men cũng như chất lượng sản phẩm.
2

 Mục tiêu đề tài
Tuyển chọn một số chủng nấm men có hoạt lực cao, lên men rượu tốt để áp
dụng hiệu quả vào thực tế sản xuất.
 Nội dung nghiên cứu
 Phân lập nấm men từ nước ép thịt quả ca cao.
 Tuyển chọn giống nấm men có khả năng lên men tốt.
 Khảo sát đường cong sinh trưởng trong quá trình nhân giống loài nấm men
thuần và loài phân lập.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Ca cao
1.1.1. Đặc điểm cây ca cao [22]
Ca cao thuộc họ Sterculiaceae, giống Theobroma, loài Ca cao, có nguồn gốc
từ miền Nam Châu Phi.

Hình 1.1. Cây ca cao
Ca cao là cây công nghiệp dài ngày, trồng thích hợp ở vùng nhiệt đới, thân gỗ,
cao 5 – 7 m (thường phát triển dưới tán). Sau khi trồng 3 – 4 năm, cây bắt đầu ra
trái, sau 10 năm thì cây phát triển hoàn thiện. Cây ca cao có thể cho thu hoạch quả
đến 50 năm.
Hoa nhỏ, đường kính khoảng 15mm, có màu vàng, đỏ, trắng hay tím tùy theo
loài. Hoa mọc trực tiếp từ thân và cành, thuộc loại lưỡng tính và thụ phấn chủ yếu
là nhờ côn trùng. Có khoảng 0,5% hoa nở tạo quả, trong đó 90% quả non sẽ bị khô
và rụng.
Quả phát triển trong 5 – 6 tháng, màu sắc biến đổi tùy theo loài. Quả ca cao có
kích thước lớn, không nứt. Trong quả thường có 5 hàng hạt bám xung quanh cùi.
Mỗi hạt có lớp vỏ nhầy bao quanh.

Hình 1.2. Cấu tạo quả ca cao [22] 4

1.1.2. Các giống ca cao [22]
Có 3 giống ca cao chủ yếu là giống Forastero, Criollo và Trinitario.
 Giống Forastero:
Xuất xứ từ Tây Phi, Brazil, Indonesia, Malaysia.
Đặc tính thực vật: quả khi chín màu vàng, hình dài, nhọn, ít khía, mặt trơn, hạt
hơi lép, lúc tươi có vị chát đắng, 60 – 80 hạt/quả. Chất lượng trung bình, năng suất

62
42
Glucose (mg/ml)
41
24
Sucrose (mg/ml)
32
21
Protein (mg/ml)
6
6
Muối khoáng (mg/ml)
8
8
Ethanol (% v/v)
0,5
0,3
Acid citric (mg/ml)
2,4
2,1
Acid lactic (mg/ml)
0,3
0,3
Acid acetic (mg/ml)
0,4
0,4
pH
3,7
4,8


với chất lượng ngày càng tốt hơn.

1.2.2. Giá trị của rượu vang [5]
Bản chất của rượu vang là nước quả lên men. Do vậy, vang là sản phẩm tự
nhiên có giá trị dinh dưỡng cao, hương vị thơm ngon, nhiều vitamin và khoáng,
chứa các đường đơn dễ tiêu hóa, độ cồn nhẹ có tác dụng kích thích tiêu hóa, chống
ung thư, có thể dùng chữa một số bệnh như thiếu máu, hen,… dùng làm rượu bổ,
bồi dưỡng cho người sức khỏe yếu khi dùng điều độ.
Dùng rượu vang với lượng vừa phải, có tác dụng kích thích, lợi cho sức khỏe.
rượu vang có chứa lượng cồn trung bình nên phụ nữ và người già có thể dùng
được, cồn trong rượu vang là cồn tinh khiết do lên men tự nhiên nên khi uống vào
sẽ ngấm dần làm người uống không bị nhanh say.
Rượu vang chứa nhiều chất dinh dưỡng hơn hẳn các loại rượu khác, là loại
thức uống có thành phần tương đối ổn định, mùi thơm đặc trưng.

7

1.2.3. Phân loại rượu vang [1]
Rượu vang có rất nhiều loại, chúng rất phong phú và đa dạng tùy theo dòng
sản phẩm, từ nguyên liệu và công nghệ khác nhau sẽ hình thành các dòng sản phẩm
khác nhau.
a. Theo màu sắc
- Vang trắng
- Vang đỏ

Hình 1.6. Rượu vang đỏ
b. Theo hàm lượng đường
- Vang chát
- Vang khô (lên men hết đường < 4g đường sót/l).
- Vang ngọt (80 – 90g đường sót/l).

+ Đường sót: 1 – 14%
- Vang khai vị
+ Hàm lượng ethanol:12 – 17%v/v
 Khai vị bán ngọt
+ Hàm lượng ethanol: 14 – 16%v/v
+ Đường sót: 5 – 12%
 Khai vị ngọt
+ Hàm lượng ethanol: 15 – 17%v/v
+ Đường sót: 14 – 20%
 Khai vị rất ngọt:

9

+ Hàm lượng ethanol: 12 – 17%v/v
+ Đường sót: 21 – 35%
 Rượu vang có gas
 Vang có gas CO
2
tự nhiên (còn gọi là rượu champagne): để giữ được
CO
2
tự nhiên trong sản phẩm do quá trình lên men tạo ra, ta thực hiện quá trình lên
men phụ trong chai, thùng, hay hệ thống kín. Phụ thuộc vào điều kiện lên men
khác nhau như nhiệt độ, thời gian mà ta có những sản phẩm khác nhau với mức
chất lượng khác nhau.
+ Hàm lượng ethanol: 10 – 12%v/v
+ Đường sót: 3 – 5%
 Vang có gas nhân tạo: được nạp CO
2


Ngoài ra, vị của rượu còn bị ảnh hưởng của các yếu tố như vị ngọt: trong
rượu vẫn còn một lượng đường, hàm lượng đường sót còn lại sẽ quyết định độ ngọt
của rượu. Tuy nhiên, cho dù những loại rượu khô nhất cũng chứa một hàm lượng
đường nhất định.
Vi sinh vật:
Vi sinh vật chủ yếu trong rượu là nấm men, là nhân tố chính tạo ra hương vị
cho rượu. Khi rượu đã lên men hoàn toàn nó thường bị vẩn đục và cặn, tạo ra bởi
những tế bào men đã chết. Chính vì thế người ta dùng nhiều kỹ thuật khác nhau để
lọc cặn ra khỏi rượu.

1.2.5. Tính chất cảm quan của rượu vang [21]
Rượu vang có chứa nhiều thành phần khác nhau, chính những thành phần này
tạo cho rượu vang giá trị cảm quan khác nhau, đem lại cho người thưởng thức
những cảm giác rất đặc biệt. Có thể nói rượu vang là một hỗn hợp nhiều thành phần,
trong đó chứa hơn 800 cấu tử bay hơi. Một số thành phần có từ nguyên liệu,
còn một số thành phần khác được hình thành trong quá trình lên men hoặc quá
trình ủ chín (tàng trữ).
a. Tính chất cảm quan về màu sắc, độ trong
Màu sắc đặc trưng cho từng loại vang, tùy loại nguyên liệu cũng như công
nghệ sản xuất rượu tạo cho rượu có màu sắc nhạt hoặc thẫm khác nhau.
Trạng thái trong của rượu phải đạt sao cho khi cảm quan nhìn bằng mắt
thường thấy trong và không có vẩn đục.
Trong quá trình đóng chai, tàng trữ màu của rượu có thể bị biến đổi do quá
trình oxy hóa hoặc dưới tác dụng của ánh sáng, vì vậy người ta thường dùng những
chai sẫm màu hoặc chai sần để chiết rượu đồng thời bảo quản rượu ở nơi râm mát
tránh tiếp xúc với ánh sáng.
Quá trình biến đổi màu có thể do trong quá trình tàng trữ, bảo quản đã oxy hóa
các hợp chất anthocyanin làm cho rượu bị mất màu dần, giá trị cảm quan về màu
không còn hấp dẫn nữa.
b. Tính chất cảm quan về mùi vị

- Chiều rộng: 2 – 7 µm
Kích thước cũng thay đổi, không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các độ tuổi
khác nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau.
 Cấu tạo tế bào nấm men
Tế bào nấm men cũng như nhiều loại tế bào khác được cấu tạo chủ yếu từ các
phần cơ bản như sau:
- Thành tế bào: cấu tạo từ nhiều thành phần khác nhau. Trong đó chủ yếu là:
glucan, manan, protein, lipid và một số thành phần nhỏ khác như chitin, volutin,…
- Màng nguyên sinh chất: gồm các hợp chất phức tạp như protein (chiếm 50%
khối lượng khô), lipid chiếm 40% và một ít polysaccharide.

12

- Chất nguyên sinh: thành phần cấu tạo chủ yếu là nước (75 – 85%), protid,
gluxid, lipid và các muối khoáng, enzyme và có các bào quan trong đó (nhân tế
bào, không bào, ty lạp thể, ribosome,…).
 Sự sinh sản của nấm men
Đối với nấm men thuộc giống Saccharomyces có 2 phương thức sinh sản. Đó
là sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi và sinh sản hữu tính bằng bào tử túi.
- Sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi:
Nảy chồi là phương pháp sinh sản phổ biến nhất ở nấm men. Ở điều kiện
thuận lợi, nấm men sinh sôi nảy nở nhanh, quan sát dưới kính hiển vi thấy hầu như
tế bào nấm men nào cũng nảy chồi. Khi chồi xuất hiện, các enzyme thủy phân sẽ
phân giải phần polysaccharide của thành tế bào làm cho chồi chui ra khỏi tế bào
mẹ. Vật chất mới được tổng hợp sẽ được huy động đến chồi và làm chồi phình to
dần lên, khi đó sẽ xuất hiện một vách ngăn giữa chồi và tế bào mẹ, tại chỗ tách ra
còn giữ lại một vết sẹo của chồi, trên tế bào con cũng mang một vết sẹo. Tại vết
sẹo này tế bào mẹ sẽ không bao giờ tạo ra một chồi non mới.
 Các quá trình sinh lý của tế bào nấm men
 Sinh dưỡng của nấm men:
Cấu tạo của tế bào nấm men thay đổi khác nhau tùy theo loài, độ tuổi và môi
trường sống, nhưng nhìn chung bao gồm:
- Nước: 75 – 85%
- Chất khô: 15 – 25% . Trong đó chất khoáng chiếm 2 – 14% hàm lượng chất
khô.
Chủ yếu là cacbon, chiếm ít hơn 50% chất khô. Các nguyên tố chính khác như
oxy (30 – 35%), nitơ (35%), hydro (5%) và photpho (1%). Hàm lượng chất khoáng
tổng số khoảng 5 – 10% chất khô của tế bào. Trong tế bào còn bao gồm rất nhiều
vết các thành phần khác như nhôm, canxi, đồng, crôm, sắt, chì, natri, kali, lưu
huỳnh, lagine, niken,…
Các nhóm thành phần chính gồm các chất cao phân tử, đó là các protein (40-
45% chất khô), cacbonhydrat ( 30- 35%), acid nucleic (6-8%) và lipid (4-5%).

14

Thành phần chính xác của các nhóm cao phân tử trong mỗi chủng nấm men khác
nhau do điều kiện nuôi cấy, do pha phát triển.
Nấm men cũng như các sinh vật sống khác cần oxy, hydro, carbon, nitơ,
phospho, kali, magiê,…
- Dinh dưỡng carbon: nguồn carbon cung cấp là các loại đường khác nhau:
saccharose, maltose, lactose, glucose…
Hô hấp hiếu khí: C
6
H
12
0
6
+ 6O

+ Lưu huỳnh: tham gia vào thành phần một số acid amin, albumin, vitamin và
enzyme.
+ Magiê: tham gia vào nhiều phản ứng trung gian của sự lên men.
+ Sắt: tham gia vào các thành phần enzyme, sự hô hấp và các quá trình khác.
+ Kali: chứa nhiều trong nấm men, nó thúc đẩy sự phát triển của nấm men,
tham gia vào sự lên men rượu, tạo điều kiện phục hồi phosphorin hóa của acid
pyruvic.
+ Mangan: đóng vai trò tương tự như magiê.
 Cơ chế vận chuyển các chất dinh dưỡng vào trong tế bào nấm men
Nấm men hoàn toàn không có cơ quan dinh dưỡng riêng biệt, các chất dinh
dưỡng mà nó sử dụng chủ yếu được vận chuyển qua thành tế bào theo hai con
đường cơ bản:
- Thẩm thấu bị động: trên thành tế bào nấm men có những lỗ nhỏ, những lỗ
này có tác dụng làm cho chất dinh dưỡng vận chuyển vào trong tế bào từ môi
trường bên ngoài nhờ áp suất thẩm thấu, ngược lại chất thải trong quá trình trao đổi
cũng được thải ra theo con đường này.

15

- Hấp thu chủ động: các thành phần dinh dưỡng khác cần thiết cho nấm men
nhưng không có khả năng xâm nhập vào tế bào theo con đường thứ nhất thì lập tức
có hệ permease hoạt hóa. Permease là một protid hoạt động, chúng liên kết với chất
dinh dưỡng tạo thành hợp chất và hợp chất này đi qua thành tế bào trong, tại đây
chúng lại tách ra và permease lại tiếp tục vận chuyển tiếp.
 Quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men
- Sự sinh trưởng:
Trong quá trình nuôi cấy, trong điều kiện dinh dưỡng đầy đủ, tế bào nấm men
tăng nhanh về kích thước và đồng thời sinh khối được tích lũy nhiều.
- Sự phát triển:
Các nấm men sinh sản bằng phương pháp nhân đôi thường cho lượng sinh

tế bào nấm men giảm dần.
 Các hình thức hô hấp của nấm men
Ở nấm men hô hấp là quá trình khá phức tạp, nó xảy ra theo hai chiều hướng
khác nhau. Vì thế người ta phân thành 2 loại hô hấp: hô hấp hiếu khí và lên men.
d. Lên men rượu vang bằng vi sinh vật tự nhiên [9, 14]
Ở những nước có nghề sản xuất rượu vang truyền thống, người ta thường sử
dụng hệ vi sinh vật tự nhiên có ở quả. Phương pháp này có ưu điểm là:
Không cần có giống vi sinh vật thuần khiết, do đó không đòi hỏi kỹ thuật cao.
Không cần đầu tư nhiều cho quá trình sản xuất, tận dụng được nguồn nguyên
liệu tại chỗ, nguồn nhân công nông nhân, sử dụng các phương pháp sản xuất theo
kinh nghiệm đã được truyền từ đời này sang đời khác và tạo ra sản phẩm với giá
thành thấp cung cấp cho gia đình và dân địa phương.
Sản phẩm khá đặc biệt vì quá trình tích lũy hương cho sản phẩm không chỉ lấy
từ nguồn trái cây mà còn được tạo bởi vi sinh vật tự nhiên có ở trái cây đó và theo
vào quá trình lên men.
Tuy nhiên, việc sử dụng vi sinh vật từ tự nhiên cũng có rất nhiều nhược điểm:
Chất lượng sản phẩm thường không ổn định vì không kiểm soát được chất
lượng giống vi sinh vật ban đầu khi đưa lên men.
Ở những nước có truyền thống sản xuất rượu vang nổi tiếng họ vẫn dùng vi
sinh vật tự nhiên để lên men. Tuy nhiên chất lượng sản phẩm phụ thuộc phần lớn