BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN

s

NGUYỄN VĂN BỐN

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT
SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH

CHITINASE CAO TẠI TỈNH ĐẮK LẮK


NGUYỄN VĂN BỐN

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT
SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH

CHITINASE CAO TẠI TỈNH ĐẮK LẮK

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 604230

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Anh Dũng


Các anh chị em trong lớp Cao học Sinh học thực nghiệm K3 ñã ñoàn kết giúp ñỡ,
chia sẻ và ñộng viên tôi trong suốt 3 năm học cao học.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn sâu sắc những người thân trong gia ñình: Bố, mẹ, Các
anh trai, các chị dâu, các cháu, vợ và con trai, gia ñình bố mẹ vợ ñã là chỗ dựa vững
chắc cho tôi về tình cảm cũng như vật chất cần thiết giúp tôi có nghị lực ñể công tác,
và phấn ñấu.

Nguyễn Văn Bốn
CÁC CHỮ VIẾT TẮT - HTch:
Hoạt tính chung chitinase

- HTr:
Hoạt tính riêng chitinase

- [chitin]:
Nồng ñộ chitin

- ĐC:
Đ
ối chứng- GlcNAc:
N-acetyl glucosamine

-
DNS:


1.2.1. Khái niệm

6
1.2.2. Phân loại chitinase 7
1.2.2.1. Dựa vào cấu trúc phân tử
7
1.2.2.2. Dựa vào trình tự amino acid 7
1.2.2.3. Dựa vào phản ứng phân cắt
9
1.2.3. Các nguồn thu nhận enzyme chitinase
9
1.2.3.1. Chitinase vi khuẩn
9
1.2.3.2. Chitinase nấm 10
1.2.3.3. Chitinase thực vật
10
1.2.3.4. Chitinase ñộng vật 11
1.2.4. Các ñặc tính cơ bản của enzyme chitinase
11
1.2.4.1. Khối lượng phân tử 11
1.2.4.2. Điểm ñẳng ñiện - Phổ hấp thu - Hằng số Michaelis
11
1.2.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ 12
1.2.4.4. Ảnh hưởng của pH 12
1.2.4.5. Chất tăng hoạt, chất ức chế 12
1.2.4.6. Sự ổn ñịnh 14
1.2.5. Các loại cơ chất của enzyme chitinase
14
1.2.5.1. Chitin 14

24
2.3.4. Phương pháp tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 24
2.3.5. Xác ñịnh hoạt ñộ chitinase theo phương pháp ñịnh lượng ñường khử
với thuốc thử DNS
25
2.3.6. Phương pháp ñịnh danh các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 28
2.3.7. Tối ưu hóa môi trường và ñiều kiện nuôi cấy các chủng nấm mốc
tuyển chọn nhằm thu nhận chitinase có hoạt tính cao
28
2.3.8. Nghiên cứu xác ñịnh tác nhân tủa phù hợp
29
2.3.9. Xác ñịnh tính chất cơ bản của chitinase
30
2.3.9. Xử lý số liệu
33
Chương 3. Kết quả và thảo luận

3.1. Kết quả phân lập các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase tại Đăk Lăk 34
3.2. Tuyển chọn và ñịnh danh các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 37
3.2.1. Tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 37
3.2.2. Định danh các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 40
3.3. Tối ưu hóa môi trường và ñiều kiện nuôi cấy các chủng nấm mốc
tuyển chọn nhằm thu nhận chitinase có hoạt tính cao
42
3.3.1. Ảnh hưởng của nồng ñộ chitin trong môi trường nuôi cấy 42
3.3.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy 43
3.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ nuôi cấy 45
3.3.4. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy 46
3.3.5. Ảnh hưởng của tốc ñộ lắc 48
3.3.6. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 49

nhiệt ñộ khác nhau 46
Bảng 3.6. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy ở các
pH khác nhau 47
Bảng 3.7. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy ở các
tốc ñộ lắc khác nhau 48
Bảng 3.8. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy trong
các khoảng thời gian khác nhau 49
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của tác nhân tủa ñến hiệu suất thu hồi và hoạt tính chitinase của
nấm mốc Penicillium janthinellum 51
Bảng 3.10.
Ảnh hưởng của một số ion kim loại ñến hoạt tính chitinase 55
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng ñến hoạt tính chitinase 57
Bảng 3.12. Hàm lượng protein, HTch, HTr trước và sau khi lọc gel 59

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc của chitin 3
Hình 2.1. Phản ứng phân cắt chitin bằng chitinase 25
Hình 2.2. Phản ứng của ñường khử với thuốc thử DNS 25
Hình 3.1 . Hoạt tính chitinase của các chủng nấm mốc phân lập tại Đăk Lăk 39
Hình 3.2 . Ảnh hưởng của nồng ñộ chitin ñến hoạt tính chitinase 43
Hình 3.3 . Ảnh hưởng của nguồn Nitơ ñến hoạt tính chitinase 44
MỞ ĐẦU 1

2

1
1. Đặt vấn ñề
Oligo N – acetyl – Glucosamine (một sản phẩm của quá trình thủy phân chitin)
ñã ñược biết ñến như một loại thuốc quý, một loại thuốc ña hiệu ñược sử dụng ñể
chữa trị nhiều bệnh như: bệnh khớp, bệnh viêm phổi, bệnh viêm dạ dày, Ngoài ra,
Oligo N- acetyl – Glucosamine còn có khả năng chống khối u, kháng nấm và
kháng vi khuẩn [1]. Chính vì có ñặc tính quý như vậy mà việc sản xuất Oligo N –
acetyl – Glucosamine ñang ñược quan tâm.
Oligo N – acetyl – Glucosamine ñược thu nhận bằng cách thủy phân chitin dưới
sự xúc tác của enzyme chitinase. Trong tự nhiên, chitinase có thể ñược tách chiết
từ nhiều nguồn khác nhau: ñộng vật (tuyến tuỵ, và dịch dạ dày cá; dịch ruột của ốc
sên; ), thực vật (mủ cao su, thuốc lá, lúa mì, cà rốt, ), các loài chân khớp
(arthropods) [17] Tuy nhiên, quy trình thu nhận chitinase từ các nguồn này khá
phức tạp, không thể tiến hành tự ñộng hoá [25][26], do ñó giá thành chế phẩm cao
và cũng không thể ñáp ứng ñủ nhu cầu thực tế .
Trong tự nhiên, còn có một nguồn quý giá và vô tận ñể thu nhận enzyme. Đó
chính là vi sinh vật. Trong số các ñối tượng vi sinh vật, nấm mốc là một nguồn khá
phổ biến ñể thu nhận nhiều loại enzyme, trong ñó có chitinase [25].

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

23
Hình 1.1
.

C
ấu trúc của chitin

1.1. Tổng quan về chitin và chitinase
1.1.1. Chitin [17][23]
1.1.1.1. Cấu tạo chitin
Chitin có công thức hóa học (C
8
H
13
NO

hiện ở sự sắp xếp các chuỗi. Ở α-chitin các chuỗi xuôi và ngược xen kẽ nhau, ở
β
-
chitin thì cùng hướng và ở
δ
-chitin có 2 chuỗi xuôi xen kẽ với 2 chuỗi ngược. Dạng
chiếm nhiều nhất là α-chitin.
1.1.1.2. Phân bố và số lượng
Chitin có mặt ở nhiều nhóm sinh vật khác nhau. Ở nấm, chitin là thành phần
chính yếu và kết hợp với các hợp chất khác tạo ra thành của khuẩn ty và bào tử
nấm sợi như: Chytridiaceae, Blastodiaceae, Ascomycetes, Basidiomycetes. Ở
những loài ñộng vật không xương sống như: Crustacea (giáp xác), Onychophora
(nhóm có móng), Myriapoda (ña túc) và Arachnida (nhện), chitin ñóng vai trò là

4
bộ xương ngoài dưới dạng phức hợp chitin-protein. Tỉ lệ chitin : protein thông
thường khoảng 55 : 45 và tỉ lệ này thay ñổi trong suốt quá trình phát triển và khác
nhau giữa các loài. Ở Insecta (côn trùng), chitin là vỏ bọc cơ thể và màng bao chất
dinh dưỡng. Ngoài ra, chitin còn có ở tảo lục và nhuyễn thể (Mollusca), trùng ñốt
(Annelida), ruột khoang (Coelenterata-Cnidaria). Ở các loài thực vật, chitin và
ñường amin ñóng vai trò không quan trọng trong quá trình trao ñổi chất hay về cấu
trúc hình thái.
Về số lượng, chitin là một trong ba loại polysaccharide phong phú nhất
trong thiên nhiên (cellulose, tinh bột và chitin). Chitin ñứng ở vị trí thứ hai sau
cellulose. Chitin và cellulose tương ứng với nhau về nhiều ñiểm về cấu tạo và chức
năng. Về chức năng, chúng ñều là những polysaccharide cấu trúc. Về cấu trúc
phân tử, chitin có cấu trúc tương tự cellulose ngoại trừ nhóm -OH ở C
2
ñược thay
thế bằng một nhóm acetylamine. Chitin có thể thay thế một phần hay toàn bộ

người ta có thể tạo thành chitin từ Uridin-diphosphate-N-acetyl-D-Glucosamine
nhờ enzyme chitin synthetase (EC 2.4.1.16) ly trích từ nấm.
1.1.1.4. Ứng dụng
Với kỹ thuật chế biến hiện ñại, chitin và các dẫn xuất của chúng có một tiềm
năng to lớn ñặc biệt là trong các lĩnh vực như y sinh học, dinh dưỡng, chế biến
thực phẩm, dược phẩm, vi sinh, nông nghiệp và mỹ phẩm.
Chitin có thể ứng dụng làm chất phụ gia trong thực phẩm, tạo ñộ bền dai cho
thực phẩm thay thế một số chất không cho phép (như hàn the…). Chitin làm chất
mang trong cố ñịnh enzyme hay cố ñịnh tế bào, làm chất mang tạo các giá thể
trồng cây cảnh. Còn chitosan, dẫn xuất của chitin, có ñộ bền dai, ñàn hồi, có thể tạo
thành các màng mỏng gần như trong suốt, sử dụng các màng chitosan ñể bảo quản
các loại trái cây, làm màng bao thuốc, màng bao thực phẩm (thịt nguội, lạp
xưởng…) còn làm nguyên liệu ñể cố ñịnh enzyme hay cố ñịnh tế bào vi sinh vật.
Chitosan ñược ñánh giá cao trong hàng loạt những ứng dụng trong y học như: băng
bó và làm lành vết thương, màng thẩm tích, chỉ khâu vết thương tự tiêu huỷ, nhân
tố ổn ñịnh liposome, diệt vi khuẩn, diệt virus, chống ung thư, chất làm giảm lượng
cholesterol trong máu, chất kích thích của hệ thống miễn dịch.
Sự phân hủy tự nhiên của chitin rất quan trọng không chỉ trong chu trình
tuần hoàn của carbon và nitơ mà còn tạo ra các chất phản ứng hóa học quan trọng.
Các ñơn phân của chitin và chitosan là N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) và
glucosamine, là những tác nhân chữa bệnh viêm khớp xương mãn tính, viêm ruột
và viêm dạ dày. Các oligomer có nguồn gốc từ chitin cũng có hoạt tính kháng khối
u, kháng nấm, kháng khuẩn, là thành phần tạo nên glycolipid và glycoprotein có
vai trò quan trọng trong sinh học và nhiều ứng dụng khác.
Hàng ngàn bài báo về chitin và các dẫn xuất của chúng ñã ñược xuất bản
cùng với khoảng gần 200 bằng sáng chế ñã ñược lưu hành tại Mỹ. Các công trình
nghiên cứu và bằng sáng chế về các chế phẩm này cũng ñã xuất hiện ở nhiều nước
trên thế giới. Các nhà khoa học từ hàng chục nước trên thế giới trong ñó có Mỹ và
Nga ñã tập trung lại 3 năm một lần ñể trao ñổi các bài báo, nghiên cứu khoa học
mới nhất về chitin và các dẫn xuất của chúng. Những ñiều ñó cho thấy chitin và


7
1.2.2. Phân loại chitinase
1.2.2.1. Dựa vào cấu trúc phân tử
Chitinase ñược sắp xếp vào 2 họ Glycohydrolase (enzyme thủy phân ñường):
- Họ glycohydrolase 18: là họ chitinase lớn nhất với khoảng 180 chi, có cấu
trúc xác ñịnh gồm 8 xoắn α/β cuộn tròn, ñược tìm thấy ở nhiều loại sinh vật như vi
khuẩn, nấm, thực vật, côn trùng, hữu nhũ và virus. Họ này bao gồm chủ yếu là
enzyme chitinase, ngoài ra còn có các enzyme khác như chitodextrinase, chitobiase
và N-acetylglucosamineidase. Trong họ này, chitinase từ các prokaryote chỉ có 2
motif trình tự ngắn ñược bảo tồn cao (bao gồm 1 gốc acid glutamic ñược bảo tồn)
giống với enzyme của eukaryote (10% của toàn bộ các gốc giống nhau). Tuy
nhiên, cả 2 loại chitinase ñều có cùng domain xúc tác barrel (βα)
8
. Trong cả 2
enzyme, rãnh gắn cơ chất ñều nằm ở ñầu C của sợi trong cấu trúc barrel (βα)
8
và
gốc acid glutamic cho proton xúc tác có 1 vị trí tương ñương. Không giống với các
glycoside hydrolase khác, chitinase họ 18 có cơ chế phản ứng bất thường bao gồm
việc tác ñộng lên nhóm N-acetyl của cơ chất trên nguyên tử C anomer. Việc này
dẫn ñến việc tạo ra chất trung gian bao gồm vòng pyranose của glucosamine kết
hợp với vòng 5 oxazoline.
- Họ glycohydrolase 19: họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở
thực vật như cà chua (Solanum tuberosum), cải (Arabidopsis thaliana), ñậu Hà Lan
(Pisum sativum), ngoài ra còn có ở xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn
Haemophilus influenzae… Chúng có cấu trúc hình cầu có cuộn giống lysozyme
(EC 3.2.1.17) của ñộng vật và phage, bao gồm motif cuộn α+β và hoạt ñộng thông
qua cơ chế nghịch chuyển.
Thực vật và vi sinh vật như Streptomyces tạo chitinase thuộc cả 2 họ, trong khi

47% trình tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I và
khá giống với chitinase vi khuẩn. Trong phân tử cũng có ñoạn giàu cysteine nhưng
kích thước phân tử nhỏ hơn ñáng kể so với chitinase nhóm I.
- Nhóm V: dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn
chitin (vùng giàu cysteine) có thể ñã giảm ñi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở
thực vật bậc cao.