1
Mục Lục
Danh mục các chữ viết tắt i
Danh mục các bảng ii
Danh mục các hình iii
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
1.1. Giới thiệu về chất kháng sinh 2
1.1.1. Chất kháng sinh (CKS) 2
1.1.2. Sơ lược lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh 3
1.2. Cơ chế tác động của CKS 5
1.2.1.Ức chế tổng hợp thành tế bào. 6
1.2.2. Ức chế tổng hợp protein 6
1.2.3. Phá hủy màng sinh chất. 6
1.2.4. Ức chế tổng hợp AND 7
1.2.5. Ức chế cạnh tranh 7
1.3. Xạ khuẩn và sự hình thành CKS từ xạ khuẩn. 7
1.3.1. Định nghĩa xạ khuẩn 7
1.3.2. Một số đặc điểm chung của xạ khuẩn 7
1.3.3. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh CKS từ tự nhiên 10
1.3.4. Quá trình hình thành CKS của xạ khuẩn 11
1.3.4.1. Các pha sinh trưởng của vi sinh vật 11
1.3.4.2.Các con đường tổng hợp chất kháng sinh 11
1.4. Phân loại xạ khuẩn 12
1.4.1. Phân loại theo phương pháp truyền thống 12
1.4.2. Phân loại theo phương pháp hiện đại 13
1.5. Một số bệnh do nấm gây ra đối với thực vật 15
1.5.1. Bệnh đạo ôn 15
1.5.2. Bệnh thối rễ 15
1.5.3. Bệnh khô vằn 16
1.5.4. Bệnh mốc sương ở khoai tây và cà chua 16
2.2.5.3. Ảnh hưởng của thời gian 25
3
2.2.5.4. Ảnh hưởng của nguồn cacbon 25
2.2.6.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ 25
2.2.7. Tách chiết chất kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ 25
2.2.8. Tìm hiểu khả năng ứng dụng của chủng xạ khuẩn XK5 26
2.2.8.1. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy của chủng XK5 đến khả năng nảy
mầm của hạt 26
2.2.8.2. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy đến khả năng nảy mầm, sinh trưởng
và phát triển của cây 26
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27
3.1. Phân lập và tuyển chọn 27
3.1.1. Xác định số lượng xạ khuẩn sinh CKS phân lập được 27
3.1.2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh CKS chống nấm có hoạt tính cao
29
3.1.3. Hoạt tính enzyme của 10 chủng xạ khuẩn. 30
3.1.4. Hoạt tính kháng sinh của chủng XK5 32
3.2. Đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại chủng xạ khuẩn XK5 33
3.2.1 Đặc điểm nuôi cấy 33
3.2.2. Đặc điểm hình thái 34
3.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 34
3.3. Xác định trình tự gen mã hóa ARNr 16S 35
3.4. Phân loại 37
3.5. Khả năng tổng hợp CKS của chủng XK5 39
3.5.1. Ảnh hưởng của pH ban đầu 39
3.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ 40
3.5.3. Ảnh hưởng của thời gian 41
3.5.4. Ảnh hưởng của nguồn cacbon khác nhau lên sinh tổng hợp CKS của
chủng xạ khuẩn XK5 42
3.5.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ khác nhau lên sinh tổng hợp CKS của chủng
trong đất làm ô nhiễm môi trường, vừa có khả năng chữa bệnh cho cây trồng là mục
tiêu phấn đấu của một nền nông nghiệp sạch và bền vững. Chất kháng sinh do vi
sinh vật sinh ra là một chất như vậy.
Xuất phát từ mục tiêu trên, chúng tôi tiến hành: “Phân lập và tuyển chọn
một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật
từ các mẫu đất ở Khánh Hòa”. Đồng thời, tiến hành nghiên cứu các yếu tố ảnh
hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của các chủng xạ khuẩn đã được
tuyển chọn, nghiên cứu ảnh hưởng của chất kháng sinh đối với sự nảy mầm của một
số loại hạt và sự phát triển của cây. Bước đầu tiến hành lựa chọn dung môi thích
hợp để tách chiết phục vụ cho những nghiên cứu về khảo sát cấu trúc và bản chất
hóa học của các chất kháng sinh đó.
2
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về chất kháng sinh
1.1.1. Chất kháng sinh (CKS)
Chất kháng sinh (antibiotic) là bất kỳ sản phẩm vi sinh nào mà ngay ở nồng độ
thấp (µg/ml) cũng có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt các VSV khác (vi khuẩn, nấm
men, nấm mốc ) một cách chọn lọc [1], [7], [22].
CKS là một trong các sản phẩm trao đổi chất bậc hai quan trọng nhất, là nhóm
hợp chất thiên nhiên đa dạng về thành phần hóa học. Chúng có thể là một chất
kiềm, axit, trung tính, dễ bay hơi hay một polypeptit, sản phẩm này có thể tiết ra
ngoài môi trường sống hay tích luỹ trong tế bào. Trước đây việc sử dụng CKS
trong điều trị các bệnh nhiễm trùng thường có nguồn gốc từ VSV (như vi khuẩn,
nấm, xạ khuẩn). Những năm gần đây với những tiến bộ về khoa học kỹ thuật, nhiều
CKS đã được tạo ra theo con đường bán tổng hợp (ampixillin) hoặc tổng hợp mới
hoàn toàn (chloramphenicol) [3], [26].
Bảng 1.1. Tỷ lệ các loài có khả năng sinh CKS [11]
Sinh vật sinh CKS
Số lượng loài
100
Việc nghiên cứu sử dụng có hiệu quả CKS đã mang lại hiệu quả lớn lao
trong lĩnh vực y học, hơn thế nữa nó còn có thể ứng dụng trong cả lĩnh vực bảo vệ
thực vật nhằm ức chế tiêu diệt các VSV khác gây bệnh cho cây trồng. CKS có thể
do nhiều VSV tạo ra nhưng chủ yếu vẫn là xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm sợi.
3
Cách đây 1/4 thế kỷ, số lượng CKS biết đến chỉ có vài trăm loại nhưng cho
đến năm 1993 số lượng này đã lên đến 6.000, trong đó 67% do xạ khuẩn sinh ra
(90% có nguồn gốc từ chi Streptomyces), 13% từ nấm, 12% từ vi khuẩn, 1% tách
được từ địa y. Song, con số này đến nay đã tăng lên trên 10.000 trong đó 7000 CKS
có nguồn gốc từ VSV. Đầu thập kỷ này đã phát hiện thêm 2000 các sản phẩm trao
đổi chất có hoạt tính sinh học được tách chiết từ VSV. Ước tính số lượng thực sự
của các chất này phải lên đến trên 15.000 chất [20], [30].
1.1.2. Sơ lược lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh
Vào mùa thu năm 1928, tại St Mary’s Hospital London, Alexander Fleming -
một nhà vi sinh vật học trở lại phòng thí nghiệm sau thời gian nghỉ hè. Quan sát các
hộp nuôi cấy vi sinh cũ còn sót lại trên bàn, ông phát hiện một hộp cấy tụ cầu
Staphylococcus bị nhiễm vi nấm Penicillium, và lấy làm ngạc nhiên vì nấm đã ức
chế sự phát triển của tụ cầu. Fleming nhận thức ngay hiện tượng mới lạ này và sau
một loạt thử nghiệm đã thấy nấm Penicillium ức chế sự phát triển của nhiều vi nấm
gây bệnh như:
- Liên cầu khuẩn Streptococcus (thường trú ở họng).
- Phế cầu khuẩn Diplococcus pneumoniae gây viêm phế quản, viêm phổi,
viêm tai mũi họng.
- Vi khuẩn bạch hầu Corynebacterium diphteriae.
- Cả xoắn khuẩn giang mai Treponema pallidum lây lan qua đường tình dục.
Ông đặt tên hoạt chất được chiết từ nấm là Penicillin.
Nhưng sau đó, công trình của Fleming đã bị lãng quên. Cho đến chiến tranh thế
giới thứ hai, do sự nỗ lực hợp tác của nhiều nhà khoa học Anh- Mỹ, đứng đầu là
Abraham, Chain, Florey thí nghiệm của Fleming đã được lặp lại, đồng thời đã tiến
Ngày 15.6.2005, một kháng sinh mới- Tygacil – của công ty Wyeth, sản xuất
từ sự lên men vi khuẩn được chào đón và hoan nghênh nhiệt liệt. Tygacil được chỉ
định cho các bệnh nhiễm trong khoang bụng và nhiễm trùng da.
Một trong những nguyên nhân kháng thuốc là sử dụng ồ ạt kháng sinh trong
chăn nuôi để chữa bệnh và bổ sung vào thức ăn tăng trưởng gia súc nên năm 1974,
châu Âu đã cấm sử dụng penicillin, tetracyclin, và nhiều kháng sinh khác để nuôi
thúc súc vật. Sự xuất hiện ngày càng nhiều các vi khuẩn đa kháng thuốc và sự thiếu
hụt các nhóm kháng sinh mới làm cho chúng ta đang phải đối mặt với thời kì “ hậu
kháng sinh”,[16]. Chính vì thế nhiệm vụ đặt ra của ngành công nghệ sản xuất kháng
sinh là: một mặt cải biến các chất kháng sinh cũ để tránh tình trạng kháng thuốc,
mặt khác phải thúc đẩy nghiên cứu và phát triển ( R$ D) để tìm ra chất kháng sinh
mới với cơ chế tác động mới hoàn toàn [27].
Như vậy sau hơn 70 năm kể từ khi khám phá ra chất kháng sinh, đến nay số
lượng chất kháng sinh được phát hiện lên tới trên 17.000 chất [21]. Tuy nhiên chỉ có
1-2% CKS được sử dụng rộng rãi trong thực tiễn y học. Thị trường CKS trên thế
giới, theo thống kê năm 2002 đã đạt doanh số 26 tỷ đôla [35], và sẽ vẫn còn tăng
khoảng 0,6%, từ năm 2002-2008. Con số này cho thấy tiềm năng to lớn của CKS
của ngành công nghệ kháng sinh trong nền kinh tế quốc dân. Có thể nói ngành công
nghệ sản xuất CKS vẫn đang là một trong những hướng phát triển mạnh mẽ nhất
trong công nghệ sinh học. Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của các ngành Vi sinh
vật học, Hoá sinh học, Di truyền học phân tử và đặc biệt là sự ra đời của CNSH
(1975) đã đạt được những thành tựu lớn lao.
1.2. Cơ chế tác động của CKS
Cơ chế tác dụng của CKS là những cách thức mà CKS tác động lên những vị
trí đích khác nhau trong tế bào, qua đó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của VSV. Sự
tác động của các CKS lên tế bào vi sinh vật phụ thuộc vào bản chất hóa học, nồng
độ CKS và cấu trúc hiển vi của tế bào vi sinh vật . Ngoài ra cùng một CKS như
6
nhau nhưng trong các điều kiện khác nhau thì cơ chế cũng có thể khác nhau. Nhìn
chung CKS có các cơ chế tác động sau [1].
chất rò rỉ ra ngoài tế bào, tế bào chết. Các CKS nhóm polyen tác động lên thành
phần sterol và estergosterol của màng hơn là photpholipit tạo lên các lỗ trên màng
làm thất thoát các phân tử nhỏ gây chết tế bào, cho nên các CKS thuộc nhóm polyen
có hiệu quả rất lớn trong việc chống nấm.
1.2.4. Ức chế tổng hợp AND
Các CKS tác động theo cơ chế này có thể gắn với acid nucleic tạo thành
phức phân tử bất hoạt, ngăn chặn sự sao chép của các phân tử acid nucleic. Các
CKS như là actynomixin, mitomixin-D,nhóm quinoton.
1.2.5. Ức chế cạnh tranh
Một số CKS về mặt cấu trúc gần giống với chất trao đổi chất bình thường
nên chúng có thể tranh chấp enzyme hoặc có thể thay thể chất trao đổi, do đó ảnh
hưởng đến trao đổi chất của vi sinh vật. Chất CKS này gọi là chất kháng sinh trao
đổi chất, tác động theo kiểu ức chế cạnh tranh.
1.3. Xạ khuẩn và sự hình thành CKS từ xạ khuẩn.
1.3.1. Định nghĩa xạ khuẩn
Xạ khuẩn(Actinomycetes) là nhóm vi khuẩn Gram (+), đặc biệt khác với
VSV nhân sơ là có tỷ lệ G+C cao (69-78%), trong khi đó ở vi khuẩn là 25- 45%.
1.3.2. Một số đặc điểm chung của xạ khuẩn
Xạ khuẩn là một nhóm vi sinh vật đơn bào, phân bố rộng rãi và đóng vai trò
quan trọng trong tự nhiên. Chúng phân bố rộng rãi trong môt gam đất nói chung
gồm có trên 1 triệu mầm xạ khuẩn [2]. Phần lớn xạ khuẩn là các vi khuẩn Gram (+);
hiếu khí hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh (khuẩn ty), không có vách ngăn
ngang. Các vách ngăn thường chia hệ sợi thành các tế bào dài (20
m hoặc hơn)
chứa một số nhân, đường kính thay đổi trong khoảng 0,2-1nm đến 2-3nm, chỉ bằng
một phần mười lần khuẩn ty của nấm [5]. Đôi khi tạo ra các đám tế bào giống mô
gọi là tản (thallus). Khoảng 60-70% xạ khuẩn phân lập từ đất có khả năng sinh
CKS. Trong số 17.000 CKS được phát hiên trên thế giới thì có trên 80% có nguồn
gốc từ xạ khuẩn [1],[2].
9
Bảng 1.2. Các loại typ thành tế bào khác nhau ở Actinomycetes
Typ
thành
tế bào
Meso-
DAP
LL-
DAP
Glyxin
Arabinoza
Galactoza
Chi đại diện
I
+
+ *
Streptomyces
II
+
+ **
Micromonospora,
Actinoplane
III
+
Actinomadura,
Microbispora
IV
+
+ ***
+***
bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài. Hiện nay, 500 loài đã được công bố thuộc chi
Streptomyces và hơn 500 loài thuộc tất cả các chi còn lại và được xếp vào nhóm xạ
khuẩn hiếm.
Streptomyces là một chi lớn, gồm khoảng 500 loài, là chi có tầm quan trọng
về mặt sinh thái và dược học, là nhóm xạ khuẩn có khả năng tổng hợp CKS mạnh
nhất. Chúng phân bố rộng rãi trong đất, đóng vai trò quan trọng trong quá trình
khoáng hoá các hợp chất hữu cơ. Có khả năng phân huỷ pectin, lignin, kitin, keratin
và các hợp chất vòng thơm. Đa phần các loài thuộc chi này không gây hại, trừ một
số gây bệnh cho thực vật và động vật. Ví dụ, S. scabies gây bệnh sùi ở khoai tây và
củ cải, S. somaliensis là loài duy nhất gây bệnh cho người. Các loài này được tập
trung vào một nhóm được gọi là Actinomycetoma. Chúng gây bệnh tại các mô dưới
da làm tổn thương dẫn tới tạo thành khối u, áp-xe, thậm trí gây tổn thương tới cấu
trúc của xương nếu không điều trị kịp thời [3].
1.3.3. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh CKS từ tự nhiên
Tuyển chọn xạ khuẩn sinh kháng sinh bao gồm các bước sau: [7]
Thu thập các mẫu đất, bùn, nước, lá, cát,… từ các loại môi trường khác
nhau, phân lập và thuần khiết các chủng từ các mẫu đó.
Thử khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật kiểm định của các chủng đã
thuần khiết.
Chọn lựa các chủng thuần khiết có hoạt tính sinh học: kháng khuẩn, kháng
nấm, kháng u dùng trong y học, trong nông nghiệp, và trong thú y. Để định
hướng cho các nghiên cứu tiếp theo.
11
1.3.4. Quá trình hình thành CKS của xạ khuẩn
1.3.4.1. Các pha sinh trưởng của vi sinh vật
Pha tiềm phát: Là pha thích ứng của vi khuẩn đối với môi trường nuôi cấy.
Các enzyme cảm ứng được hình thành để phân giải cơ chất, tế bào vi khuẩn
được hoạt hóa để chuẩn bị cho pha sinh trưởng.
Pha sinh trưởng (trophophase): VSV sử dụng các thành phần dinh dưỡng của
môi trường để tăng sinh khối. Cuối pha này VSV bắt đầu tổng hợp CKS.
cấy là một khâu hết sức quan trọng trong lĩnh vực nghiên cứu và sản xuất CKS.
1.4. Phân loại xạ khuẩn
Trong phân loại xạ khuẩn người ta dựa trên các đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh
lý, sinh hóa.
1.4.1. Phân loại theo phương pháp truyền thống
Hệ thống phân loại chi Streptomyces dùng trong đề tài
Đó là hệ thống phân loại và định danh các loài Streptomyces của đề án phân
loại xạ khuẩn quốc tế ISP (Intenational Streptomyces Project). Hệ thống phân loại
của ISP dựa trên các tiêu chuẩn sau:
Màu sắc khuẩn lạc: Màu sắc khuẩn lạc được chia thành các màu: màu trắng
(White-W), màu xám (Gray-Gy), màu đỏ (Red-R), màu vàng (Yellow-Y),
màu xanh lá cây (Green-Gn), màu xanh da trời (Blue-B), màu tím (Violet).
Trong trường hợp mà màu sắc khuẩn lạc rơi vào giữa hai màu thì cả hai màu
đó đều được ghi nhận (chẳng hạn, GyW).
Sắc tố melanin: Xạ khuẩn được chia thành hai nhóm có hoặc không có khả
năng sinh melanin.
Sắc tố khuẩn ty cơ chất: Cũng được chia thành hai nhóm là nhóm xác định
được và nhóm không xác định được. Trường hợp mà màu sắc nhạt như vàng
nhạt, vàng dầu hoặc là xám vàng được xếp vào nhóm không xác định.
Sắc tố hòa tan: Các loại xạ khuẩn được chia thành hai nhóm, nhóm sinh sắc
tố hoà tan và nhóm không sinh sắc tố hòa tan.
Hình thái cuống sinh bào tử: Các loài trong chi Streptomyces được chia thành
ba nhóm: Rectiflexibiles (RF)-cuống bào tử thẳng hay lượn sóng,
13
Retinaculiaperti (RA)-cuống bào tử xoắn đơn hình móc câu, và Spirales (S)-
cuống bào tử xoắn lò xo.
Bề mặt bào tử: Dựa trên kết cấu bề mặt bào tử, xạ khuẩn được phân thành
các nhóm: nhẵn (Smooth-Sm), gai (Spiny-Sp), mụn cóc (Warty-Wa), và lông
(Hairy-Ha).
Khả năng sử dụng nguồn cacbon: Có khả năng sử dụng nguồn cacbon là
quá trình tiến hoá, các vùng gen đó có thể có những đột biến nhất định, nhưng chọn
lọc tự nhiên chỉ giữ lại những đột biến trung tính, ít ảnh hưởng tới sự tổng hợp
protein của sinh vật, còn những đột biến trong những vùng không gian quan trọng
làm ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protein của cơ thể thì ngay lập tức sẽ bị
chọn lọc tự nhiên đào thải.
Dựa vào những vùng bảo thủ trong gen mã hoá cho ARNr các nhà khoa học đã
thiết kế các cặp mồi vạn năng để có thể khuếch đại các vùng biến đổi. So sánh sự
khác biệt giữa các vùng này, người ta có thể chỉ ra được những sự khác biệt giữa
các loài gần gũi [15].
Theo các nhà khoa học thì dung lượng phát sinh loài của phân tử ARNr 23S là
lớn hơn so với phân tử ARNr 16S. Tuy nhiên trình tự đã được xác định hoàn chỉnh
của gen ARNr 23S là rất ít trong khi đó trình tự của gen ARNr 16S là khá phong
phú và được công bố rộng rãi trên ngân hàng gen quốc tế. Chính vì vậy phương
pháp giải trình tự gen mã hoá ARNr 16S đã làm sáng tỏ mối quan hệ phát sinh
chủng loại của VSV vẫn là lý tưởng nhất. Lần xuất bản thứ nhất của cả “Bergey’s
Manual of Systemmatic Bacteriology” và “The Prokaryote” đều dựa vào tiêu chuẩn
ARNr 16S làm tiêu chuẩn phát sinh loài tương ứng của VSV. Chính vì vậy có thể
nói phương pháp xác định trình tự ARNr 16S là phương pháp phân tử phổ biến nhất
được dùng để định loại vi khuẩn [32].
Cây phát sinh chủng loại (cây phả hệ) được xây dựng dựa trên các khoảng cách
đã tính toán. Nó đang trở thành một công cụ đắc lực cho nghiên cứu phân loại ở các
cấp độ cao hơn chi [16]. Sự tương đồng giữa phép phân loại dựa trên các đặc điểm
kiểu hình (phenotyp) và cây phát sinh đã và đang được nghiên cứu một cách rộng
rãi. Nhìn chung các đặc điểm hoá phân loại đã đề cập ở trên cho thấy mối tương
quan tốt với cây phát sinh chủng loại.
15
Đặc biệt hóa phân loại là rất quan trọng trong việc phân loại xạ khuẩn. Chúng
rất có ích trong phân loại ở mức độ đến chi. Đó là những đặc điểm sau: đường, loại
acetyl, axit mycolic trong thành tế bào, menaquinone, photpholipit, axit béo và tỷ lệ
GC trong ADN.
Ngoài ra, Fusarium oxysporium còn gây bệnh khác như bệnh héo vàng trên
cây chuối, cà chua, cây dưa và bầu bí, bệnh mốc hồng và bệnh thối thân ở cây ngô
[13]. Nấm Fusarium oxysporum còn gây bệnh chết héo và bệnh thối rễ ở nhiều loại
cây lương thực, cây công nghiệp và cây rau.
1.5.3. Bệnh khô vằn
Bệnh do nấm Rhizoctonia solani, địa bàn phân bố của nấm khá rộng rãi ở các
nước trồng lúa vùng châu Á và các châu lục khác. Lúa có thể giảm năng suất từ 20
– 25 % khi bị bệnh phát triển lên đến lá đòng (Hori, 1969). Bệnh khô vằn gây hại
chủ yếu ở một số bộ phận của cây như bẹ lá, phiến lá, và cổ bông.
1.5.4. Bệnh mốc sương ở khoai tây và cà chua
Bệnh có nguồn gốc phát triển đầu tiên ở Nam Mỹ, do nấm Phytophthora
infestans gây ra. Bệnh cũng phá hoại nghiêm trọng, gây thiệt hại kinh tế khá lớn đối
với nhiều nước trồng khoai tây trên thế giới. Bệnh mốc sương gây hại ở tất cả các
bộ phận của cây [14].
1.6. Sử dụng CKS và xạ khuẩn trong bảo vệ thực vật
1.6.1. Sử dụng xạ khuẩn chống nấm gây bệnh thực vật
Sự đối kháng của các vi sinh vật trong đất là cơ sở của biện pháp đấu tranh
sinh học phòng chống bệnh cây. Do vậy, đã từ lâu các nhà khoa học trên thế giới đã
nghiên cứu và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng ức chế nấm gây bệnh
thực vật. Nơi nào có mặt vi sinh vật đối kháng trong đất thì tỷ lệ cây bị bệnh giảm
đi rõ rệt. Sự có mặt của xạ khuẩn đối kháng trong đất làm giảm rõ rệt tỷ lệ mắc bệnh
của cây [13]. Khi điều tra về xạ khuẩn đối kháng trong đất ở Nhật Bản Kuradu nhận
thấy nơi nào có nhiều xạ khuẩn trong đất thì ở đó các chủng Fusarium bị biến mất
nhanh chóng [35].
Thông thường một loài xạ khuẩn đối kháng có thể ức chế, hoặc tiêu diệt một
vài loại nấm gây bệnh, nhưng cũng có loài có phổ rộng. Tuy nhiên việc sử dụng các
17
chủng có phổ rộng phải thận trọng để tránh làm ức chế các khu hệ vi sinh vật có lợi
trong vùng rễ.
Xạ khuẩn chống nấm ngoài việc tiết ra các CKS, còn tác động lên khu hệ vi
chế phẩm sinh học còn đắt. Do đó cần có sự phối hợp một cách có kế hoạch trong
việc tìm kiếm CKS mới và xây dựng biện pháp đấu tranh sinh học, phối hợp với các
biện pháp hóa học để đem lại những hiệu quả to lớn trong phòng chống bệnh và
nâng cao hiệu suất cây trồng, bảo vệ môi trường, sức khỏe cộng đồng cũng như
nâng cao hiệu quả kinh tế.
19
CHƯƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Chủng giống
Các chủng xạ khuẩn được phân lập từ các mẫu đất ở Khánh Hòa: Hồ cá Trí
Nguyên, suối nước nóng Ninh Hòa, hòn Chồng, bãi Dương, Trường Xuân- Ninh
Hòa, hòn Mun, hòn Một.
Các chủng VSV kiểm định: Fusarium moniliform; Shigella flexneri;
P.enteridis; Pseudomonas aeruginosa; Rhizoctonia solani; Bacillus subtilis; Sarcina
lutea; Pyricularia oryzae; Klebsiella sp; Ralstonia solanacearum; E.coli; Candida
albicans; Staphylococcus aureus; Fusarium oxysporum; Proteus mirabilis;
Salmonella typhi; Phytopthra capcisi của Bảo tàng Giống chuẩn VSV, Trung tâm
Công nghệ Sinh học- ĐHQGHN và Viện Bảo vệ Thực vật cung cấp.
- Nội dung nghiên cứu
1. Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh từ
môi trường tự nhiên ở Khánh Hòa.
2. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học của các chủng đã tuyển chọn.
3. Thăm dò khả năng ứng dụng của một số chủng có hoạt tính kháng sinh nhằm
định hướng nghiên cứu trong bảo vệ thực vật.
4. Bước đầu tiến hành lựa chọn dung môi thích hợp để tách chiết chất kháng
sinh.
2.1.2. Hóa chất và dụng cụ
2.1.2.1. Hóa chất
Các hóa chất làm môi trường: pepton, tinh bột tan, thạch, cao men, các loại
C. Sau 3-5 ngày lấy ra quan sát và tách các khuẩn lạc mọc riêng rẽ
(tinh sạch), rồi cấy chuyền sang các ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng
ISP
4
và tiếp tục nuôi ở điều kiện trên trong 10- 14 ngày. Theo ISP màu sắc khuẩn ty
khí sinh của các chủng xạ khuẩn được chia thành 8 nhóm màu: nhóm trắng (W),
nhóm xám (G
y
), nhóm đỏ (R), nhóm vàng (Y), nhóm lục (G
n
), nhóm xanh da trời
(B), nhóm tím (V), và nhóm không xác định (X) [23]
2.2.1.2. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh (HTKS)
a. Phương pháp thỏi thạch để sơ tuyển xạ khuẩn [7]
Xạ khuẩn được nuôi trên ISP_4 trong các đĩa Petri. Sau 7 ngày, dùng khoan
nút chai khoan các thỏi thạch đặt vào môi trường đã cấy VSV kiểm định. Để trong
tủ lạnh từ 4-8 giờ cho CKS khuếch tán vào môi trường, rồi đặt vào tủ ấm. Vi khuẩn
kiểm định nuôi ở 37
0
C, nấm men và nấm mốc nuôi ở 28- 30
0
C, đọc kết quả sau một
ngày đối với vi khuẩn, 3 ngày đối với nấm. HTKS được xác định bằng kích thước
vòng vô khuẩn (D-d, mm). D là kích thước vòng vô khuẩn, d là kích thước thỏi
thạch.
21
b. Phương pháp đục lỗ - xác định HTKS trong môi trường dịch thể
Dùng khoan nút chai đục các lỗ trên môi trường thạch đã cấy VSV kiểm định
trong đĩa Petri. Nhỏ dịch lọc sau nuôi cấy. Các bước tiếp theo tiến hành như phương
pháp thỏi thạch.
[23].
2.2.4.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
- Khả năng hình thành enzym ngoại bào: Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy lắc
trên môi trường thích hợp, sau 3 ngày lọc dịch nuôi và xác định hoạt tính enzym
Copyright: Tài liệu đại học ©