TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
ĐINH THỊ THOA
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG
XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME
CELLULASE TRONG ĐẤT TRỒNG TRỌT KHU VỰC
XUÂN HÒA, PHÚC YÊN, VĨNH PHÚC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung
đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng thí nghiệm Vi sinh, khoa
Sinh- KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã nhiệt tình giúp đỡ.
Tôi chân thành cảm ơn ban Lãnh đạo trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, Ban
chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN, đã tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và hoàn
thành đề tài.
Tôi xin cảm ơn thầy cô và bạn bè đã động viên, tạo mọi điều kiện giúp
đỡ tôi trong suốt thời gian làm đề tài.
Lời cảm ơn sâu sắc nhất tôi xin dành cho gia đình và những ngƣời thân yêu đã
động viên và giúp đỡ tôi.

Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2014
Sinh viên Đinh Thị Thoa
CMC : Cacboxyl Methyl Cellulose
CFU : Colony Forming Unit
Gr
+
: Gram dƣơng
ISP : International Streptomyces Project
HSCC : Hệ sợi cơ chất
HSKS : Hệ sợi khí sinh
m : meso
Nxb : Nhà xuất bản
PG : PeptidoGlycan
rARN : Riboxom Acid RiboNucleic
VSV : Vi sinh vật
DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Công thức hóa học của cellulose 15
Hình 1.2. Mô hình Fringed fibrillar và mô hình chuỗi gập 15
Hình 2.3. Bản đồ khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên,Vĩnh Phúc 22


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài 1
2. Mục đích nghiên cứu 2
3. Nhiệm vụ nghiên cứu 2
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 2
5. Phƣơng pháp nghiên cứu 2
6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn…………………………………………… 3
7. Những đóng góp mới của đề tài 3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Đặc điểm và phân loại xạ khuẩn 4

2.3.3. Phƣơng pháp bảo quản chủng giống 23
2.3.4. Phƣơng pháp quan sát hình thái xạ khuẩn 23
2.3.5. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn 24
2.3.6. Phƣơng pháp xác định hoạt tính cellulase của xạ khuẩn 24
2.3.7. Phƣơng pháp thống kê và xử lý kết quả 25
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 26
3.1. Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn sinh enzyme cellulase từ đất trồng trọt
khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 26
3.1.1. Phân lập xạ khuẩn từ đất trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh
Phúc 26
3.1.1.1. Đặc điểm khuẩn lạc 26
3.1.1.2. Đặc điểm hệ sợi 31
3.1.2. Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn sinh enzyme cellulase trong đất
trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc…………………35
3.2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái cuống sinh bào tử, bào tử của các
chủng xạ khuẩn đã tuyển chọn 40
3.2.1. Cuống sinh bào tử và bào tử của xạ khuẩn 40
3.2.2. Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái cuống sinh bào tử, bào tử của 3
chủng xạ khuẩn X3, X5, X11 41
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

1

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Cellulose là thành phần quan trọng cấu tạo nên lớp thành tế bào thực
vật. Đó là một loại polysaccharide có cấu trúc phức tạp. Việc phân huỷ
cellulose bằng các tác nhân lý hóa gặp nhiều khó khăn, làm ảnh hƣởng đến
tốc độ của nhiều quá trình sản xuất công nghiệp. Enzyme cellulase là nhóm

việc có ý nghĩa hết sức quan trọng trong việc cải tạo đất và bảo vệ môi
trƣờng. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi chọn đề tài: “Phân lập và
tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh enzyme cellulase trong
đất trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc”.
2. Mục đích nghiên cứu
Tuyển chọn đƣợc một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải
cellulose cao góp phần tăng độ phì nhiêu của đất trồng trọt khu vực Xuân
Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
3.1. Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn sinh enzyme cellulase từ đất trồng trọt khu
vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc
3.2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái cuống sinh bào tử, bào tử của các chủng
xạ khuẩn đã tuyển chọn
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
Một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose trong đất trồng trọt
tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc.
5. Phƣơng pháp nghiên cứu
5.1. Phƣơng pháp lấy mẫu
5.2. Phƣơng pháp phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski
5.3. Phƣơng pháp bảo quản chủng giống
3

5.4. Phƣơng pháp quan sát hình thái xạ khuẩn
5.5. Phƣơng pháp xác định hoạt tính cellulase của xạ khuẩn
5.6. Phƣơng pháp thống kê và xử lý kết quả
6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
6.1. Ý nghĩa khoa học
Các nghiên cứu về xạ khuẩn góp phần đem lại cho con ngƣời những hiểu
biết về đời sống tự nhiên của vi sinh vật nói chung và xạ khuẩn nói riêng.
Đề tài cho phép hiểu rõ hơn vai trò của xạ khuẩn trong môi trƣờng đất, khả

Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 – 2.400.000
mầm xạ khuẩn, chiếm 9 - 45% tổng số VSV [22]. Sự phân bố của xạ khuẩn
còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trƣờng. Chúng có nhiều trong các lớp đất
trung tính và kiềm yếu hoặc acid yếu 6,8 - 7,5. Xạ khuẩn có rất ít trong lớp
đất kiềm hoặc acid và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm, số lƣợng xạ
khuẩn cũng thay đổi theo thời gian trong năm.
Xạ khuẩn tham gia tích cực vào quá trình chuyển hóa nhiều hợp chất
trong đất, nƣớc, dùng để sản xuất nhiều enzyme nhƣ protease, amylase,
cellulase… một số acid amin và acid hữu cơ. Một số xạ khuẩn có thể gây
bệnh cho ngƣời, động vật [5].
1.1.1. Một số phương pháp trong phân loại xạ khuẩn
Cùng với sự phát triển mạnh của sinh học phân tử, hóa sinh học, lý sinh
học … nên việc định tên một chủng xạ khuẩn đƣợc tiến hành tƣơng đối nhanh
chóng và chính xác với nhiều phƣơng pháp nhƣ phân loại số, nghiên cứu
chủng loại phát sinh… Song ngƣời ta vẫn chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình
thái, nuôi cấy đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học và sinh học phân tử.
5

1.1.1.1. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy
Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy là một trong những thông tin
quan trọng để phân loại xạ khuẩn. Để làm cho các chủng xạ khuẩn cần định
loại biểu hiện đầy đủ các đặc điểm, ngƣời ta thƣờng xuyên nuôi cấy chúng
trên môi trƣờng dinh dƣỡng khác nhau trong điều kiện nhiệt độ và thời gian
nhất định. Tiến hành quan sát mô tả chụp ảnh và ghi lại những đặc điểm hình
thái và nuôi cấy của xạ khuẩn, đặc biệt là cơ quan mang bào tử, hình dạng và
bề mặt bào tử. Dựa vào đặc điểm hình thái, ngƣời ta chia xạ khuẩn thành 4
nhóm chính:
Nhóm 1: Gồm các xạ khuẩn mang bào tử rõ rệt, sinh sản bằng bào tử và phân
hóa thành HSKS và HSCC.
Nhóm 2: Gồm các xạ khuẩn có bào tử nang, hệ sợi phân chia theo hƣớng

Type thành phần tế bào dựa trên cơ sở phân tích acid amin trong thành
phần pettide và đƣờng trong thành phần tế bào hay các polysaccaride gắn vào
thành tế bào.
Type peptidoglycan (PG) dựa vào các thông tin về thành phần và cấu
trúc của mạch tetrapeptide của PG cầu nối peptide và các liên kết giữa các
mắt xích của PG.
Acid mycolic là các phần tử có mạch dài phân nhánh thuộc chi
Nocardia, Rhodococus, Mycobacterium và Cornebacter. Đây là đặc điểm
phân loại cơ bản cho các chi đó.
Acid béo thƣờng đƣợc sử dụng trong phân loại là acid béo bão hòa
mạch thẳng và không bão hòa với mạch phân nhánh kiểu iso và enteiso metyl
hóa ở nguyên tử cacbon thứ 10. Sự có mặt của acid 10 – metylloctade canoit
(acid tubereulostearinoic) là đặc điểm để phân loại đến chi [8].
7

Phospholipid có 5 type (P
I
, P
II
, P
III
, P
IV
, P
V
) có thành phần đặc trƣng, có ý
nghĩa cho phân loại xạ khuẩn.
Trong phân loại xạ khuẩn thì type thành tế bào là đặc điểm quan trọng
nhất. Khi muốn đƣa một loài mới hoặc mô tả một loài có ý nghĩa nào đó,
ngƣời ta không thể nào không xác định thành tế bào.

s-
+ N
d
)

Trong đó: S
SM (AB)
: Mức độ giống nhau giữa hai cá thể A, B (%).
N
s +
: Số các tính trạng giống nhau.
8

N
d
: Số các tính trạng khác nhau.
N
s-
: Số các tính trạng đối lập nhau.
Công thức của Jacard (S
J
)
S
J(AB)
= N
s
* 100/ (N
s
+ N
d

9

Thƣờng trên môi trƣờng có nguồn đạm vô cơ và glucose, các bào tử
biểu hiện các đặc điểm rất rõ. Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sợi khí sinh cũng
rất khác nhau tùy theo nhóm Streptomyces, màu sắc này cũng có thể biến đổi
khi nuôi cấy trên môi trƣờng khác nhau. Vì vậy, Ủy ban Quốc tế về phân loại
xạ khuẩn ISP đã nêu ra các môi trƣờng và phƣơng pháp chung để phân loại
nhóm VSV này.
Các loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn
Gr
+
, hiếu khí, dị dƣỡng các chất hữu cơ. Nhiệt độ tối ƣu thƣờng là 25 - 30
o
C,
pH tối ƣu 6,5 – 8,0. Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp
hơn (xạ khuẩn ƣa nhiệt và ƣa lạnh).
Bên cạnh các đặc điểm hình thái, nuôi cấy trên xạ khuẩn thuộc chi này còn có
đặc điểm hóa phân loại sau:
Type thành tế bào: Type I dạng L- ADP và glixin
Type Peptidoglycan
Axit béo: mạch thẳng bão hòa, đồng phân nhánh 15 - 17 C với số lƣợng ít và
số lƣợng lớn các axit phân nhánh 16 Ciso và 15 - 17 Canteiso
Dạng menaquinon: MK-9 (H
6
) hoặc MK-9 (H
9
)
Dạng photpholipit : P
II


phẩm trong quá trình trao đổi chất nhƣ: chất kháng sinh, độc tố, enzyme,
vitamin, acid hữu cơ có thể đƣợc tích lũy trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn
hay đƣợc tiết ra trong môi trƣờng.
* Khuẩn ty
Trên môi trƣờng đặc biệt, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại:
một loại cắm sâu vào trong môi trƣờng gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất
substrate mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dƣỡng. Một loại phát triển
11

trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty sinh khí aerial mycelium)
với chức năng chủ yếu là sinh sản.
Nhiều loại chỉ có hệ sợi cơ chất nhƣng cũng có loại (nhƣ chi
Sporichthya) lại chỉ có hệ sợi khí sinh. Khi đó HSKS vừa làm nhiệm vụ sinh
sản vừa làm nhiệm vụ dinh dƣỡng.
1.1.2.2. Cấu tạo của xạ khuẩn
Xạ khuấn có cấu trúc tế bào tƣơng tự nhƣ vi khuẩn Gr
+
, toàn bộ cơ thể
chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất,
nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập.
Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lƣới, dày 10 – 20 nm có tác
dụng duy trì hình dạng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào. Thành tế bào gồm 3 lớp:
lớp ngoài cùng dày 60 - 120A
o
, khi già có thể đạt tới 150 – 200A
o
, lớp giữa rắn
chắc, dày khoảng 50A
o
, lớp trong dày khoảng 50A

C rất cao trong ADN, thƣờng lớn hơn 55%, trong đó ở vi
khuẩn tỷ lệ này chỉ là 25 – 45% [8].
Xạ khuẩn thuộc loại vi khuẩn Gr
+
nên ngoài yếu tố di truyền trong nhiễm
sắc thể còn có các yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể, chúng có thể tự nhân
lên, đƣợc Lederberg gọi là plasmid. Các plasmid đem lại cho tế bào nhiều đặc
tính chọn lọc quý giá nhƣ có thêm khả năng phân giải một số hợp chất, chống
chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với các kháng sinh, chuyển gene, sản xuất
chất kháng sinh trong đất và môi trƣờng tuyển chọn [2].
Xạ khuẩn thuộc loại cơ thể dị dƣỡng, nguồn cacbon chúng thƣờng dùng
là đƣờng, tinh bột, rƣợu và nhiều chất hữu cơ khác. Nguồn nitơ hữu cơ là
protein, pepton, cao ngô, cao nấm men. Nguồn nitơ vô cơ là nitrat, muối
amon… Khả năng đồng hóa các chất ở các loài hay chủng xạ khuẩn khác
nhau là khác nhau.
1.1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn
Xạ khuẩn là một nhóm cơ thể dị dƣỡng, chúng sử dụng đƣờng, rƣợu,
acid hữu cơ, lipid, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác làm nguồn cacbon.
13

Còn nitrat, nitrit, muối amon, ure, pepton, cao thịt… để làm nguồn nitơ. Các
loài khác nhau thì cách hấp thụ các hợp chất này là khác nhau. Phần lớn xạ
khuẩn là vi sinh vật hiếu khí, ƣa ẩm, nhiệt độ cho sinh trƣởng và phát triển là
25 – 30
0
C. Đa số xạ khuẩn phát triển tốt trong môi trƣờng có pH là 6,8 – 7,
một số ít có khả năng phát triển tốt trong môi trƣờng kiềm [17].
Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gr
+
, đặc biệt khác với các sinh vật khác

mùn, kitin, keratin, lignin [10].
Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì
có tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra [8]. Trong đó có trên 15% có nguồn gốc từ
các xạ khuẩn hiếm nhƣ Actinomadura, Micromonospora, Actinoplanes,,
Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn hiếm đã cung cấp nhiều chất kháng sinh có
giá trị đang dùng trong y học, thú y học, bảo vệ thực vật nhƣ gentamycin,
tobramycin, vancomycin, rosamycin, tetraxycline Bên cạnh đó trong quá
trình trao đổi chất, xạ khuẩn có thể sản sinh ra nhiều chất hữu cơ. Trong đó,
điển hình là các enzyme ngoại bào (cellulase, protease ), vitamin nhóm B
(B
1
, B
2
, B
5
,B
6,
B
12
), một số acid hữu cơ (acid lactate, acid acetate ) [10].
Ngày nay xạ khuẩn còn đƣợc ứng dụng rộng rãi trong ngành công
nghiệp lên men, chế tạo các sản phẩm enzyme, ứng dụng các chế phẩm này
vào đời sống do một số xạ khuẩn có khả năng sinh ra nhiều enzyme ngoại bào
nhƣ protease, amylase, kitinase Một số khác còn có khả năng tạo thành
chất kích thích sinh trƣởng cho thực vật.
1.2. Cellulose và cellulase
1.2.1. Cellulose
Cellulose là hợp chất hữu cơ có công thức cấu tạo (C
6
H

và xếp xen kẽ
với vùng vô định hình.

Trích đoạn Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn

---