TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
TRẦN THỊ DUNG
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG
XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME
CELLULASE TRONG ĐẤT ĐỒI TẠI KHU VỰC
XUÂN HÒA, PHÚC YÊN, VĨNH PHÚC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
HÀ NỘI, 2014
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
TRẦN THỊ DUNG
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG
Sinh viên
Trần Thị Dung
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan khóa luận tốt nghiệp với đề tài “ Phân lập và tuyển
chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh cellulase trong đất đồi tại khu
vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc” là công trình nghiên cứu của riêng tôi
dƣới sự hƣớng dẫn của cô giáo PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung. Các kết quả
nghiên cứu, số liệu đƣợc trình bày trong khóa luận là trung thực và không
trùng với công trình của các tác giả khác.
Hà Nội, ngày 01 tháng 05 năm 2014
Sinh viên
Trần Thị Dung
MỞ ĐẦU 1
1. Lý do chọn đề tài 1
2. Mục tiêu đề tài 2
3. Nội dung nghiên cứu 2
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 2
5. Phƣơng pháp nghiên cứu 2
6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3
7. Điểm mới của đề tài 3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Đặc điểm và phân loại xạ khuẩn 4
1.1.1. Một số phƣơng pháp trong phân loại xạ khuẩn 4
1.1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn 10
1.1.3. Vai trò của xạ khuẩn 14
1.2.1. Cellulose 15
1.2.2. Cellulase 15
1.2.3. Hệ enzyme phân giải cellulose 16
1.3. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn phân giải cellulose ở Việt Nam và
trên thế giới 17
1.3.1. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn phân giải cellulose trên thế giới 17
1.3.2. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn phân giải cellulose ở Việt Nam 17
CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
2.1. Nguyên liệu và vi sinh vật 20
2.1.1. Vi sinh vật 20
2.1.2. Hóa chất và thiết bị 20
2.2. Môi trƣờng 20
2.2.1. Môi trƣờng phân lập 20
2.2.2. Môi trƣờng bảo quản và giữ giông 21
2.2.3. Môi trƣờng thử hoạt tính enzyme 22
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 23
2.3.1. Phƣơng pháp lấy mẫu 23
Hình 3.9. Hình ảnh hệ sợi, hình dạng tế bào và cuống sinh bào tử của
các chủng xạ khuẩn nghiên cứu 45
Hình 3. 10. Hình thái chủng Đ3 46
Hình 3. 11. Hình thái chủng Đ7 47
Hình 3. 12. Hình thái chủng Đ9 48
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Các chủng xạ khuẩn phân lập trong đất đồi Xuân Hòa, Phúc
Yên, Vĩnh Phúc 30
Bảng 3.2. Số lƣợng và sự phân bố của xạ khuẩn theo độ sâu 33
Bảng 3.3. Đặc điểm khuẩn lạc của 18 chủng xạ khuẩn phân lập trong đất
đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 36
Bảng 3.4. Số lƣợng và sự phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu 37
Bảng 3.5. Kết quả thử hoạt tính cellulase trên môi trƣờng chứa CMC 39
Bảng 3.6. Kết quả thử hoạt tính cellulase trên môi trƣờng chứa bột giấy 40
Bảng 3.7. Hoạt tính cellulase của các chủng xạ khuẩn đã phân lập 41
Bảng 3.8. Hình dạng cuống sinh bào tử của các chủng xạ khuẩn 44 1
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Cellulose là thành phần quan trọng cấu tạo nên lớp thành tế bào thực
vật. Đó là một loại polysaccharide có cấu trúc phức tạp. Việc phân huỷ
cellulose bằng các tác nhân lý hóa gặp nhiều khó khăn, làm ảnh hƣởng đến
tốc độ của nhiều quá trình sản xuất công nghiệp.
Enzyme cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên
kết β-1,4-0-glycoside trong phân tử cellulose, olygosaccharide, disaccharide
và một số cơ chất tƣơng tự khác. Hiện nay việc sử dụng các enzyme nhƣ
3.1. Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn trong đất đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc
Yên, Vĩnh Phúc
3.2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái cuống sinh bào tử, bào tử và tính chất
nuôi cấy của các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
Một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh cellulase trong đất đồi tại khu
vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc”.
5. Phƣơng pháp nghiên cứu
5.1. Phƣơng pháp lấy mẫu
5.2. Phƣơng pháp phân lập xạ khuẩn
5.3. Phƣơng pháp bảo quản chủng giống
5.4. Phƣơng pháp quan sát hình thái xạ khuẩn
5.5. Phƣơng pháp xác định hoạt tính cellulase của xạ khuẩn
5.6. Phƣơng pháp thống kê và xử lý kết quả
3
6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
6.1. Ý nghĩa khoa học
Các kết quả nghiên cứu vê xạ khuân góp phần đem lại cho con ngƣời
những hiểu biết về đời sống tự nhiên của vi sinh vật nói chung và xạ khuẩn
nói riêng. Đề tài cho phép hiểu rõ hơn vai trò của xạ khuẩn trong môi trƣờng
đất, khả năng phân giải cellulose của xạ khuẩn. Từ đó tạo cơ sở khoa học cho
các phƣơng thức canh tác (cày xới, cải tạo đất, bón phân…) theo hƣớng lợi
dụng vi sinh vật phân giải cellulose tăng cƣờng các quá trình phân giải hợp
chất hữu cơ để làm giàu dinh dƣỡng cho đất, tăng năng suất cây trồng.
6.2. Ý nghĩa thực tiễn
Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính cellulase cao, ứng
dụng các chủng xạ khuẩn này vào đời sống (trong chăn nuôi, môi trƣờng). Từ
các chủng xạ khuẩn có hoạt tính cellulase cao này có thể tạo ra các chế phẩm
vi sinh vật phục vụ cho việc xử lý rác thải (ủ rác thải sinh hoạt), chế biến thức
sinh học … nên việc định tên một chủng xạ khuẩn đƣợc tiến hành tƣơng đối
nhanh chóng và chính xác với nhiều phƣơng pháp nhƣ phân loại số, nghiên
cứu chủng loại phát sinh… Song ngƣời ta vẫn chủ yếu dựa vào các đặc điểm
hình thái, nuôi cấy đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học và sinh học
phân tử.
5
1.1.1.1. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy
Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy là một trong những thông tin
quan trọng để phân loại xạ khuẩn. Để làm cho các chủng xạ khuẩn cần định
loại biểu hiện đầy đủ các đặc điểm, ngƣời ta thƣờng xuyên nuôi cấy chúng
trên môi trƣờng dinh dƣỡng khác nhau trong điều kiện nhiệt độ và thời gian
nhất định. Tiến hành quan sát mô tả chụp ảnh và ghi lại những đặc điểm hình
thái và nuôi cấy của xạ khuẩn, đặc biệt là cơ quan mang bào tử, hình dạng và
bề mặt bào tử. Dựa vào đặc điểm hình thái, ngƣời ta chia xạ khuẩn thành 4
nhóm chính:
Nhóm 1: Gồm các xạ khuẩn mang bào tử rõ rệt, sinh sản bằng bào tử và
phân hóa thành HSKS và HSCC.
Nhóm 2: Gồm các xạ khuẩn có bào tử nang, hệ sợi phân chia theo
hƣớng vuông góc với nhau tạo thành các cấu trúc tƣơng tự nang bào tử.
Nhóm 3: Gồm các xạ khuẩn có dạng Nocardia, sinh sản bằng cách phân
đốt hệ sợi.
Nhóm 4: Gồm các xạ khuẩn có dạng Corynebacter và dạng cầu, tế bào
có hình chữ V,T thƣờng không có hệ sợi.
Dựa vào nghiên cứu các xạ khuẩn trên các môi trƣờng khác nhau,
ngƣời ta chia hình chuỗi bào tử thành 6 kiểu:
+ Kiểu S (Spira): chuỗi bào tử xoắn.
+ Kiểu SRA (Spira Rectinaculum Apertum): chuỗi bào tử xoắn có dạng
móc câu hay xoắn không hoàn toàn.
+ Kiểu SRF (Spira Rectus Flexibilis): chuỗi bào tử xoắn, cong đến
mạch thẳng và không bão hòa với mạch phân nhánh kiểu iso và enteiso metyl
hóa ở nguyên tử cacbon thứ 10. Sự có mặt của acid 10 – metylloctade canoit
(acid tubereulostearinoic) là đặc điểm để phân loại đến chi [3].
7
Phospholipid có 5 type (P
I
, P
II
, P
III
, P
IV
, P
V
) có thành phần đặc trƣng, có
ý nghĩa cho phân loại xạ khuẩn.
Trong phân loại xạ khuẩn thì type thành tế bào là đặc điểm quan trọng
nhất. Khi muốn đƣa một loài mới hoặc mô tả một loài có ý nghĩa nào đó,
ngƣời ta không thể nào không xác định thành tế bào.
1.1.1.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Để phân loại xạ khuẩn đến loài, ngƣời ta sử dụng hàng loạt các đặc
điểm sinh lý, sinh hóa khác nhau nhƣ khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và
nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trƣởng, khả năng biến đổi các chất khác
nhau nhờ hệ thống ezyme. Nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ƣu, khả
năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trƣờng, mối quan hệ với chất kìm
hãm sinh trƣởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với
chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi
chất đặc trƣng khác của xạ khuẩn.
Hopwood (1997) khẳng định rằng phần lớn các đặc điểm sinh lý, sinh
)
Trong đó: S
SM (AB)
: Mức độ giống nhau giữa hai cá thể A, B (%).
N
s +
: Số các tính trạng giống nhau
N
d
: Số các tính trạng khác nhau
N
s-
: Số các tính trạng đối lập nhau
Công thức của Jacard (S
J
)
S
J(AB)
= N
s
* 100/ (N
s
+ N
d
)
Trong đó: S
J(AB)
: mức độ giống nhau giữa hai chủng A, B (%).
N
khi nuôi cấy trên môi trƣờng khác nhau. Vì vậy, Ủy ban Quốc tế về phân loại
xạ khuẩn ISP đã nêu ra các môi trƣờng và phƣơng pháp chung để phân loại
nhóm VSV này.
Các loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn
Gr
+
, hiếu khí, dị dƣỡng các chất hữu cơ. Nhiệt độ tối ƣu thƣờng là 25 - 30
o
C,
pH tối ƣu 6,5 – 8,0. Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp
hơn (xạ khuẩn ƣa nhiệt và ƣa lạnh).
Bên cạnh các đặc điểm hình thái, nuôi cấy trên xạ khuẩn thuộc chi này
còn có đặc điểm hóa phân loại sau:
Type thành tế bào: Type I dạng L- ADP và glixin
Type Peptidoglycan
Axit béo: mạch thẳng bão hòa, đồng phân nhánh 15 - 17 C với số lƣợng
ít và số lƣợng lớn các axit phân nhánh 16 Ciso và 15 - 17 Canteiso
Dạng menaquinon: MK-9 (H
6
) hoặc MK-9 (H
9
)
Dạng photpholipit : P
II
Không có axit mycolic [5].
Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lƣợng lớn các chất kháng
sinh ức chế vi khuẩn, nấm sợi, các tế bào ung thƣ, virus và nguyên sinh động
10
Trên môi trƣờng đặc biệt, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại:
một loại cắm sâu vào trong môi trƣờng gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất
substrate mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dƣỡng. Một loại phát triển
trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty sinh khí aerial mycelium)
với chức năng chủ yếu là sinh sản.
Nhiều loại chỉ có hệ sợi cơ chất nhƣng cũng có loại (nhƣ chi
Sporichthya) lại chỉ có hệ sợi khí sinh. Khi đó HSKS vừa làm nhiệm vụ sinh
sản vừa làm nhiệm vụ dinh dƣỡng.
1.1.2.2. Cấu tạo xạ khuẩn
Xạ khuẩn có cấu tạo tƣơng đối giống vi khuẩn gồm có thành tế bào,
màng tế bào, vật chất nhân sơ, các hạt dữ trữ. Xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh
vật Gram ( +). Thành tế bào đà khoảng 20 nm có vai trò duy trì hình dạng hệ
sợi và bảo vệ tế bào, đƣợc cấu tạo chủ yếu gồm các lớp glucopeptide gồm các
gốc N-Acetylglucosamine liên kết với N-Acetylmuramic ( hoặc N-
Glycolylmuramic, ví
Căn cứ vào kết cấu hóa học có thể chia thành tế bào xạ khuẩn thành 4
nhóm sau:
Nhóm 1 (Type I ): có chứa L- ADP (L- diaminopimelic và glixin). Gồm các
chi Streptomyces, Norcarsioider
Nhóm 2 (Type II): có chứa m- ADP (meso- diaminopimelic) và glixin. Gồm
các chi Micromospora, Actinoplans, Ampullariella
Nhóm 3 ( Type III): có chứa m- ADP (meso- diaminopimelic). Gồm có
Actinomadura, Actinobigfida, Micromobispora
Nhóm 4 ( Type IV): có chứa m- ADP (meso- diaminopimelic), đƣờng
araninose, galactose. Gồm có Norcardia, Pseudonocardia, Microbacterium
Cấu tạo tế bào xạ khuẩn
12
Khuẩn lạc xạ khuẩn tuy có dạng sợi phân nhánh phức tạp đan xen nhau
nhƣng toàn bộ hệ sợi chỉ là một tế bào có nhiều nhân, không có vách ngăn
khi không thấm nƣớc. Chuỗi bào tử đƣợc tạo thành trên cuống sinh bào tử,
chúng có thể thẳng, lƣợn song hoặc xoắn. Bề mặt bào tử có thể nhẵn, xù xì,
có thể long hoặc có gai. Xạ khuẩn có khả năng tạo thành các loại sắc tố khác
nhau, sắc tố này có thể nhuộm màu HSKS, HSCC, đôi khi nhuộm màu môi
trƣờng.
Các loài thuộc chi Streptomyces có cấu tạo thành giống thành của vi
khuẩn Gram (+), là vi sinh vật hiếu khí, dị dƣỡng. Nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu
từ 25- 30
0
C, pH tối ƣu là 6,5 – 8. Một số loài có thể sinh trƣởng ở nhiệt độ
cao hơn hoặc thấp hơn ( xạ khuẩn ƣa nhiệt và xạ khuẩn ƣa ẩm). Bên cạnh các
đặc điểm hình thái, nuôi cấy trên xạ khuẩn thuộc chi này còn có đặc điểm hóa
phân loại sau:
Type thành tế bào: Type I dạng L- ADP và glixin
Type Peptidoglucan: A
3
Axit béo: mạch thẳng bão hòa, đồng phân nhánh 15- 17 C với số lƣợng ít và
số lƣợng lớn các axit phân nhánh 16 Ciso và 15- 17 Canteiso
Dạng menaquinon: MK-9 (H
6
) hoặc MK-9 (H
9
)
Dạng photpholipit : P
II
Không có axit mycolic [13].
1.1.2.4. Sinh sản của xạ khuẩn
Xạ khuẩn sinh sản sinh dƣỡng bằng bào tử. Bào tử đƣợc hình thành trên
5
,B
6,
B
12
), một số acid hữu cơ (acid lactate, acid acetate ) [5].
Ngày nay xạ khuẩn còn đƣợc ứng dụng rộng rãi trong ngành công
nghiệp lên men, chế tạo các sản phẩm enzyme, ứng dụng các chế phẩm này
vào đời sống do một số xạ khuẩn có khả năng sinh ra nhiều enzyme ngoại bào
nhƣ protease, amylase, kitinase Một số khác còn có khả năng tạo thành
chất kích thích sinh trƣởng cho thực vật.
15
1.2. Cellulose và Cellulase
1.2.1. Cellulose
Cellulose là một polysaccarite mạch thẳng gồm từ 1400 – 12000 gốc β-
D- glucose liên kết với nhau bởi các liên kết β- 1,4- glucozit. Trong phân tử
cellulose các phan tử β- D- glucose có cấu trúc không gian dạng ghế bành.
Hai phân tử khác nhau góc quay 180
0
. Cellulose là loại hợp chất hữu cơ dồi
dào trong tự nhiên chiếm tới 40-50% hydratcacbon.
Cellulose có cấu trúc dạng sợi song song, dài khoảng 5μm với đƣờng
kính 3nm. Các sợi này liên kết với nhau bởi các liên kết hydro và các liên kết
Vandervan tạo thành các bó sợi nhỏ có đƣờng kính 10 - 40nm gọi là các vi sợi
(microfibrin). Các vi sợi có cấu trúc không đồng nhất tạo nên cấu trúc mixen
của cellulose. Cellulose dạng mixen gồm 2 vùng:
Vùng kết tinh (Crystolline regions): có các sợi chặt chẽ, đậm đặc ngăn cản
sự hấp thụ nƣớc và ít chịu tác động phân giải. Vùng này chiếm ¾ cấu trúc
Đầu tiên enzyme cellobiohydrolase có tác dụng cắt đứt liên kết hydro, biến
cellulose tự nhiên có cấu hình không gian dạng cellulose vô định hình không
có cấu trúc lớp.
Enzyme thứ hai là endogluconase có khả năng cắt đứt liên kết β-1,4-
glucozit tạo thành những chuỗi dài.
Enzyme thứ ba là exogluconase tiến hành phân giải các chuỗi trên thành
di saccarit gọi là cellbinose.
Enzyme thứ tƣ là β- glucosidase tiến hành thủy phân cellobinose thành
glucose.
Hệ enzyme cellulase còn gọi là enzyme thủy phân vì nó tiến hành thủy
phân cellulose. Mặt khác nó còn đƣợc goi là enzyme ngoại bào, vì trong quá
trình sống của vi sinh vật phân giải cellulose, enzyme này đƣợc tổng hợp bên
trong tế bào và đƣợc tiết ra bên ngoài, tiến hành thủy phân cellulose bên ngoài
Copyright: Tài liệu đại học ©