BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG
*****
ĐIỀN THỊ PHƢƠNG
MSSV: 48134256

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI SINH
VẬT CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME CELLULASE TỪ RONG
GIẤY TẠI HÕN CHỒNG – NHA TRANG
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GVHD: TS. VŨ NGỌC BỘI
LỜI CẢM ƠN i
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ CELLULASE 3
1.1.1. Giới thiệu về cellulose 3
1.1.2. VSV sinh tổng hợp cellulase 5
1.2. ỨNG DỤNG CỦA ENZYME CELLULASE 6
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ ENZYME CELLULASE 8
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 8
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc 9
CHƢƠNG II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 10
2.1.1. Rong giấy 10
2.1.2. VSV sinh cellulase. 10
2.1.3. Môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật 10
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11
2.2.1. Phƣơng pháp phân lập 11
2.2.2. Phƣơng pháp tuyển chọn chủng VSV sinh cellulase mạnh nhất 13
2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp 13
2.2.4. Phƣơng pháp phân loại chủng vi sinh vật 14
2.2.5. Kiểm tra khả năng lên men các loại đƣờng và khả năng sinh hơi 15
2.2.6. Kiểm tra khả năng chịu muối 15
2.2.7. Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp các enzyme thủy phân khác 15
2.3. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 16
2.4. DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM 16
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17

iii
3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VSV SINH CELLULASE
CAO TỪ RONG GIẤY 17


Bảng 1.1. Một số VSV sản xuất cellulase 6
Bảng 3.1. Hoạt tính cellulase của một số chủng VSV phân lập 17
Bảng 3.2. Hoạt tính cellulase của 4 chủng đã qua sơ tuyển 18
Bảng 3.3. Khả năng lên men các loại đƣờng của hai chủng N3 và N4 30
Bảng 3.4. Khả năng chịu muối của hai chủng N3 và N4 311 v
DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc không gian của phân tử cellulose 3
Hình 1.2. Cấu trúc phân tử celulose 3
Hình 1.3. Cơ chế tác dụng của cellulase 5
Hình 2.1. Quá trình phân lập vi sinh vật sinh cellulase từ rong giấy 13
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp 14
Hình 3.1. Hình ảnh về hai chủng nấm sợi có khả năng sinh cellulase mạnh nhất 19
Hình 3.2. Hoạt tính cellulase của hai chủng N3 và N4 trên CMC 19
Hình 3.3. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase của chủng N3 20
Hình 3.4. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase của chủng N4 20
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới khả năng sinh cellulase của chủng N3 22
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới khả năng sinh cellulase của chủng N4 22
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ chất cảm ứng đến khả năng sinh cellulase của chủng N323
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ chất cảm ứng đến khả năng sinh cellulase của chủng N4233
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến khả năng sinh cellulase của chủng N3 25
Hình 3.10. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến khả năng sinh cellulase của chủng N4 255
Hình 3.11. Hình thái khuẩn lạc của chủng N3 trên đĩa petri 266
Hình 3.12. Hệ sợi nấm N3 ở các độ phóng đại 10X; 40 X 27
Hình 3.13. Hệ sợi nấm N3 ở các độ phóng đại 40 X và 100X 277
Hình 3.14. Hình thái khuẩn lạc chủng N4 trên đĩa petri 277

hình nghiên cứu tại Việt nam, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập và
tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase từ rong
giấy tại Hòn Chồng-Nha Trang” với mục tiêu: thu thập các chủng vi sinh vật chịu
mặn có khả năng sinh cellulase có thể thủy phân rong giấy với họat tính cao làm cơ
sở cho việc sản xuất enzyme cellulase, ứng dụng trong sản xuất cồn từ rong biển -
một hƣớng đang đƣợc toàn thế giới quan tâm.

2

Nội dung của đề tài:
1) Phân lập và tuyển chọn được chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh
cellulase cao từ rong giấy thu tại Hòn Chồng-Nha Trang;
2) Sơ bộ phân loại các chủng vi sinh vật sinh cellulase cao phân lập được;
3) Xác định một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase
của chủng vi sinh tuyển chọn được.
Do thời gian nghiên cứu có hạn nên báo cáo không thể tránh đƣợc các hạn chế.
Em rất mong nhận đƣợc các ý kiến góp ý của những ai quan tâm đến vấn đề này, để
cho báo cáo thêm hoàn thiện. Em xin chân thành cám ơn.

Cellulase là phức hệ enzyme thủy phân cellulose tạo thành các phân tử đƣờng
β-glucose. Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả, cellulose bị phân hủy dƣới
tác dụng hiệp đồng của phức hệ cellulase bao gồm ba enzyme là Exo-β-(1,4)-
glucananse hay enzyme C
1
, Endo-β- glucananse hay endocellulase còn gọi là
enzyme CMC-ase hay C
x
và β-(1,4)-glucosidase hay cellobioase:
Exo-1,4-gluconase (hay cellobiohydrolase, C1 EC 3.2.1.91) giải phóng
cellobiose hoặc glucose từ đầu không khử của cellulose, tác dụng yếu lên CMC
nhƣng tác dụng mạnh lên cellulose vô định hình hoặc cellulose đã bị phân giải một
phần. Tác dụng lên cellulose kết tinh không rõ nhƣng khi có mặt endoglucanase thì
có tác dụng hiệp đồng rõ rệt.
Endo-1,4-glucanase (hay CMC-ase, Cx, EC 3.2.1.4) thủy phân liên kết ß-1,4-
glucoside và tác động vào chuỗi cellulose một cách tùy tiện, sản phẩm của quá trình
thủy phân là cellobiose và glucose. Do thủy phân CMC hoặc cellulose theo kiểu tùy
tiện nên endo-1,4-glucanase làm giảm nhanh chiều dài chuỗi cellulose và tăng chậm
các nhóm khử, enzyme tác dụng mạnh lên cellodextrin. Enzyme này hoạt động
mạnh ở vùng vô định hình nhƣng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh của cellulose.
ß-1,4-glucosidase (hay cellobiase, EC 3.2.1.21) thủy phân cellobiose và các
cellodextrin khác hòa tan trong nƣớc sinh ra, chúng có hoạt tính cao trên cellobiase,
còn cellodextrin thì hoạt tính thấp và giảm khi chiều dài của chuỗi tăng lên. Chức
năng của ß-glucosidase có lẽ là điều chỉnh sự tích lũy các chất cảm ứng của
cellulase.
Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase
Cellulase là một hệ enzyme phức tạp xúc tác sự thủy phân cellulose thành
cellobiose và cuối cùng thành glucose.
Sự phân giải cellulose dƣới tác dụng của hệ enzyme cellulase xảy ra theo 3
giai đoạn chủ yếu sau:

Vi khuẩn
Aspergillus niger
A.oryzae
A.terreus
A.syndovii
A. flavus
Fusarium culmorum
Fusarium oxysporum
Mucor pusilus
Pen. notatum
Penicillium spp
Trichoderma lignorum
Trichoderma reesei
Trichoderma viride
Trichoderma konongi

Actinomyces aureus
Act.cellulose
Act.diastaticus
Act. roseus
Act.griseus
Act.melamocylas
Act.coelicolor
Act.candidus
Act.chromogenes
Act. hygroscopicus
Act.griseofulvin
Act.ochroleucus
Act.thermofulcus
Act.xanthostrums

cellulase, thành tế bào của hạt đại mạch bị phá hủy tạo điều kiện tốt cho tác động
của protease và quá trình đƣờng hóa.
Trong sản xuất agar-agar, sử dụng cellulase xúc tác để xử lý rong thu agar-
agar có chất lƣợng cao hơn so với phƣơng pháp dùng acid để phá vỡ thành tế bào.
Mặt khác khi sử dụng cellulase để xử lý rong thu agar-agar lại giúp hạn chế ô nhiễm
môi trƣờng so với phƣơng pháp sử dụng acid vốn gây ô nhiễm môi trƣờng.
Cellulase ứng dụng trong xử lý môi trƣờng: enzyme cellulase đóng một vai trò
vô cùng quan trọng trong việc phân hủy cellulose có trong chất thải, sự có mặt của
enzyme cellulase sẽ giúp cho sự phân hủy cellulose trong tự nhiên dễ dàng và hiệu
quả hơn. Hiện nay enzyme cellulase là thành phần quan trọng của chế phẩm sinh
học (các chế phẩm EM) trong xử lý ô nhiễm môi trƣờng.
Trong nông nghiệp, cellulase đƣợc dùng để phân hủy cellulose từ các phế phụ
phẩm để sản xuất phân bón hữu cơ thay thế cho các loại phân bón hóa học truyền
thống làm giảm ô nhiễm môi trƣờng cũng nhƣ sự thoái hóa đất.
Trong ngành công nghệ sản xuất bột giặt enzyme cellulase đƣợc sử dụng nhƣ
một tác nhân nhằm làm hoàn thiện cho bột giặt (tẩy sạch vết bẩn, vải rờ mịn tay, sợi
vải sáng bóng hơn và không làm hại da tay).
Cellulase đƣợc ứng dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Sự phá vỡ màng
tế bào là một việc đòi hỏi các kỹ thuật công phu và tốn kém. Ngƣời ta có thể thu
nhận các tế bào trần bằng phƣơng pháp xử lý qua enzyme cellulase. Khi đó ta sẽ thu
đƣợc tế bào trần của thực vật (protoplast) và tế bào trần nấm men (spheroplast).
Chế phẩm cellulase tinh khiết đƣợc ứng dụng trong kỹ thuật di truyền. Trong
kỹ thuật tạo tế bào trần (protoplas), ngƣời ta thƣờng dùng chế phẩm cellulase tinh
khiết để phá vỡ thành tế bào thực vật. Ứng dụng cellulase phá vỡ thành tế bào thực

8
vật không làm tổn thƣơng các cơ quan bên trong tế bào, đảm bảo sự nguyên vẹn các
nhân tố di truyền.
Ngoài ra, việc sản xuất enzyme cellulase có hoạt độ cao để phân hủy cellulose
thành các nguồn nhiên liệu sinh học đang đƣợc quan tâm đặc biệt trong ngành công

phân hủy cellulose và cellulase (Đặng Minh Hằng, 1999; Hoàng Quốc Khánh và
cộng sự, 2003; Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007; Nghiêm Ngọc Minh và cộng sự,
2006). Những nghiên cứu này chủ yếu đề cập vấn đề phân lập các chủng vi sinh vật
và đánh giá ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng đến khả năng sinh tổng hợp
cellulase nhƣ: tuyển chọn, nghiên cứu ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng lên khả
năng sinh tổng hợp cellulase và tinh sạch, đánh giá tính chất hóa lý của cellulase từ
chủng penicillium sp. DTQ - HK1 (Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007). Nghiên cứu
phân loại và xác định hoạt tính cellulase của chủng xạ khuẩn ƣa nhiệt XKS
2
(Nghiêm Ngọc Minh và cộng sự, 2006).
Từ các phân tích ở trên cho thấy hiện ở Việt Nam chƣa có công trình nào công
bố về việc phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh vật sinh enzyme celluase từ rong
giấy. Vì thế việc “Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh
enzyme cellulase từ rong giấy tại Hòn Chồng-Nha Trang” là cần thiết nhằm thu
thập các chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh cellulase có thể thủy phân
rong giấy với họat tính cao làm cơ sở cho việc sản xuất enzyme cellulase ứng dụng
trong sản xuất cồn từ rong biển - một hƣớng đang đƣợc toàn thế giới quan tâm.
10
CHƢƠNG II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU
2.1.1. Rong giấy:
Mẫu rong giấy mục đƣợc lấy từ bãi biển Hòn Chồng - Nha Trang. Rong Giấy
có tên khoa học là: Ulva retieulata, Thuộc ngành: Chlorophyta, lớp:
Chlorophyceae, bộ: Ulvales.
2.1.2. VSV sinh cellulase:
Bao gồm cả nấm mốc, xạ khuẩn và vi khuẩn hiện diện trên rong giấy.
2.1.3. Môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật

Agar 15 g
Nƣớc 1 lít
pH 6 - 7
* Môi trƣờng Capek - dox (g/l):
NaNO
3
3 g
KH
2
PO
4
1 g
MgSO
4
.7H
2
O 0,5 g
KCl 0,5 g
Saccarose 30 g
Agar 20 g

11
Nƣớc cất 1 lít
pH 5 - 6
* Môi trƣờng thạch thƣờng (g/l):
Nƣớc mắm 10 ml
Pepton 10 g
Agar 15 - 20 g
Nƣớc 1 lít
pH 7

nhiều hay ít mà ta cho nồng độ cấy thích hợp (thƣờng từ 10
-3
– 10
-8
).
Dùng môi trƣờng thạch thƣờng để phân lập các chủng vi khuẩn, môi trƣờng
Capek để phân lập các chủng nấm và môi trƣờng ISP
4
để phân lập các chủng xạ
khuẩn. Các môi trƣờng đƣợc hấp khử trùng rồi phân phối vào các đĩa peptri. Dùng
pipet man hút 0.1 ml dịch đã pha loãng nhỏ vào đĩa thạch đã ghi tên mẫu, nồng độ
và ngày phân lập. Dùng que cấy tran trang đều dịch mẫu trên mặt thạch. Sau đó cất
và nuôi cấy mẫu phân lập ở 37
0
C. Sau khoảng 24 h vi khuẩn đã phát triển trên đĩa
thạch tiến hành quan sát, tách và thuần khiết khuẩn lạc đối với vi khuẩn. Sau 2 - 3
ngày đối với nấm và 5 - 7 ngày đối với xạ khuẩn.
+ Đối với vi khuẩn: bề mặt nhẵn, ƣớt, khi dùng que gạt không còn lại trong
thạch.
+ Đối với xạ khuẩn: bề mặt khô xù xì, có hình tròn.
+ Đối với nấm: có hệ sợi.
Tách và thuần khiết khuẩn lạc: Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ trên đĩa peptri
cấy rồi cấy vào ống nghiệm, mỗi khuẩn lạc cấy vào một ống (ghi kí hiệu đầy đủ để
cho các bƣớc nghiên cứu tiếp theo), đặt vào tủ ấm 37
0
C. Sau các khoảng thời gian
thích hợp cấy ziczac ra đĩa petri để tinh sạch các chủng VSV, tiến hành tinh sạch
nhiều lần. Kiểm tra độ thuần khiết của giống bằng cách kiểm tra vết cấy, kiểm tra
độ thuần chủng của các khuẩn lạc và kiểm tra tế bào dƣới kính hiển vi. Khi đƣợc
khuẩn lạc thuần nhất và tách rời trên đĩa thạch thì cấy vào ống nghiệm giữ giống

o
C. Sau 36 - 48 h sấy ở nhiệt độ 50
0
C, đem nghiền mịn bằng máy nghiền
bi rồi cho vào đó một lƣợng nƣớc gấp 4 - 5 lần khối lƣợng canh trƣờng để hòa tan

14
protein-enzyme từ khối canh trƣờng nấm sợi. Sau đó đem xác định hoạt độ enzyme
cellulase bằng phƣơng pháp đổ dịch.
* Phƣơng pháp xác định nồng độ chất cảm ứng thích hợp
Nấm mốc đƣợc nuôi cấy lỏng lắc 200 vòng/phút trong môi trƣờng có chứa
nồng độ chất cảm ứng (rơm và rong) ở các nồng độ từ 1% - 8%. Sau 36 - 48 h thu
dịch lọc và xác định hoạt tính enzyme cellulase.
* Phƣơng pháp xác định pH môi trƣờng nuôi cấy thích hợp
Nấm mốc đƣợc nuôi cấy lắc 200 vòng/phút trong môi trƣờng có pH là :
3,4,5,6,7,8 ở nhiệt độ phòng. Sau 36 - 48 h đem xác định hoạt tính enzyme.

Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp
2.2.4. Phƣơng pháp phân loại chủng VSV (phân loại theo phƣơng pháp
truyền thống)
Phân loại theo phƣơng pháp truyền thống là phƣơng pháp phân loại chủng
VSV dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa. Dựa vào đó ngƣời ta phân

15
loại chúng và các chi. Đối với nấm sợi chúng tôi tiến hành phân loại bằng phƣơng
pháp quan sát đặc điểm hình thái đặc trƣng trên kính hiển vi.
Nguyên lý:
Nấm thƣờng đƣợc nhận diện bằng các đặc điểm hình thái đặc trƣng quan sát
đƣợc dƣới kính hiển vi. Tế bào nấm thƣờng phát triển thành hệ sợi gọi là khuẩn ty
thể. Sợi nấm có thể có hay không có vách ngăn. Khuẩn ty mọc lên trên bề mặt cơ

C trong 24 h rồi đổ lugol và xác định hoạt tính
enzyme bằng cách đo vòng thủy phân.
2.3. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Xử lý số liệu nghiên cứu theo phƣơng pháp thống kê sinh học. Mỗi thí nghiệm
đều tiến hành 3 lần, mỗi lần 3 mẫu và kết quả là trung bình cộng của các lần thí
nghiệm.
Số liệu đƣợc xử lý đƣợc vẽ trên phần mềm Ecxel với hệ số tƣơng quan R ≥ 0,95.
2.4. DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM
Sử dụng các thiết bị hiện đại có tại phòng thí nghiệm CNSH: thiết bị ly tâm
(Eppendorf Centrifuge 5417R - Mỹ), máy vortex (máy trộn mẫu BE34), tủ lạnh
(NANO Silver, Việt Nam), kính hiển vi 3 mắt ngắm có camera và máy tính (Motic
BA 300 - Mỹ), máy lắc (GFL 3005 - Đức), tủ cấy (Telstar AV 100 - Tây Ban Nha),
tủ sấy (Binder - Đức), tủ ấm Memmert - Đức,
17
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VSV SINH
CELLULASE CAO TỪ RONG GIẤY
Để tuyển chọn các chủng VSV có khả năng sinh enzyme cellulase thủy phân
cellulose, chúng tôi tiến hành phân lập VSV từ các mẫu rong giấy đã mục thu tại bãi
biển Hòn Chồng - Nha Trang. Sử dụng môi trƣờng thạch thƣờng để phân lập vi
khuẩn, môi trƣờng Capek để phân lập nấm mốc và môi trƣờng ISP
4
để phân lập xạ
khuẩn. Sơ tuyển VSV bằng phƣơng pháp đặt thỏi thạch trên môi trƣờng CMC và

9
N2
36
10
N3
48
11
N4
40
12
N5
31
13
XK1
24
14
XK2
26
15
XK3
31
16
XK4
30 18
Nhận xét:
Kết quả phân lập ở bảng 3.1 cho thấy đã phân lập đƣợc 16 chủng VSV có khả
năng sản xuất enzyme cellulase, trong đó có 14 chủng VSV có hoạt tính enzyme

32
0,192
0,182
XK4
25
x
x

Ghi chú: x coi nhƣ không có hoạt tính (lƣợng dịch enzyme không đủ làm
chuyển màu của methylene xanh (phụ lục 02)).
Qua bảng kết quả xác định họat tính cellulase, chúng tôi chọn đƣợc hai chủng
nấm sợi N3 và N4 là hai chủng phân lập đƣợc từ rong giấy đã ủ mục tại bãi biển
Hòn Chồng - Nha Trang là những chủng sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất (hình
3.1 và 3.2). Hai chủng này đƣợc đem bảo quản và phục vụ cho các thí nghiệm về
sau.

19

Hình 3.1. Hình ảnh về hai chủng nấm sợi có khả năng sinh cellulase mạnh nhất
(N3 và N4) đƣợc tuyển chọn

Hình 3.2. Hoạt tính cellulase của hai chủng N3 và N4 trên CMC
3.2. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG
SINH TỔNG HỢP ENZYME CELLULASE CỦA CÁC CHỦNG N3 VÀ N4
TUYỂN CHỌN ĐƢỢC
3.2.1. Ảnh hƣởng của thời gian
Tiến hành nuôi cấy hai chủng N3 và N4 trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút
trong môi trƣờng Capek, sau các khoảng thời gian: 6; 12; 18; 24; 30; 36; 42; 48; 54;
60 h lấy mẫu để xác định hoạt tính của enzyme cellulase và đo sinh khối tế bào. Kết
quả nghiên cứu đƣợc thể hiện ở phụ lục 01, hình 3.3 và hình 3.4.