LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành Đồ án này
Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nha Trang,
Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Phòng Đào tạo Đại
học và Sau đại học niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại trường trong
những năm qua.
Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho thầy: TS. Vũ Ngọc Bội -
Phó Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học
Nha Trang đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực
hiện đồ án tốt nghiệp này.
Xin cám ơn: PGS. TS. Ngô Đăng Nghĩa - Giám đốc Viện Công nghệ
Sinh học và Môi trường, ThS. Khúc Thị An - Quyền Trưởng Bộ môn Công
nghệ Sinh học và các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu
để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng.
Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo
trong Bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường
- Trường Đại học Nha Trang, Phòng thí nghiệm CNSH đã giúp đỡ nhiệt tình
và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án này.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều
kiện, động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập
vừa qua.
i
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
11. William MF, Catherine TK, (1990), “Microbial enzymes and biotechnology”. Elsevier
Science Publishing CO, INC, p. 1-70 45
26. John RW (2002), “Handbook of Enzymology”. Marcel Dekker Inc, p. 707-718, 761-
789, 879-915, 993-1018 47
DANH MỤC BẢNG
LỜI CẢM ƠN i
11. William MF, Catherine TK, (1990), “Microbial enzymes and biotechnology”. Elsevier

trên và tình hình nghiên cứu tại Việt nam, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài:
“Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase từ
rong giấy tại Hòn Chồng-Nha Trang” với mục tiêu: thu thập các chủng vi sinh vật
chịu mặn có khả năng sinh cellulase có thể thủy phân rong giấy với họat tính cao
làm cơ sở cho việc sản xuất enzyme cellulase, ứng dụng trong sản xuất cồn từ rong
biển - một hướng đang được toàn thế giới quan tâm.
Nội dung của đề tài:
1) Phân lập và tuyển chọn được chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh
cellulase cao từ rong giấy thu tại Hòn Chồng-Nha Trang;
1
2) Sơ bộ phân loại các chủng vi sinh vật sinh cellulase cao phân lập được;
3) Xác định một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase
của chủng vi sinh tuyển chọn được.
Do thời gian nghiên cứu có hạn nên báo cáo không thể tránh được các hạn
chế. Em rất mong nhận được các ý kiến góp ý của những ai quan tâm đến vấn đề
này, để cho báo cáo thêm hoàn thiện. Em xin chân thành cám ơn.
2
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ CELLULASE
1.1.1. Giới thiệu về cellulose
Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật. Ngoài ra, người ta còn thấy chúng
có nhiều ở tế bào một số loài vi sinh vật (VSV). Ở tế bào thực vật và một số tế bào
vi sinh vật, chúng tồn tại ở dạng sợi.
Hình 1.1. Cấu trúc không gian của phân tử cellulose
Cellulose không có trong tế bào động vật. Chúng là một homopolimer mạch
thẳng, được cấu tạo bởi các β-D-glucose-pyranose. Các thành phần này liên kết với
nhau bởi liên kết glucose, liên kết các glucose này với nhau bằng liên kết α-1,4
glucoside. Các gốc glucose trong cellulose thường lệch nhau một góc 180
o
và có

tiện nên endo-1,4-glucanase làm giảm nhanh chiều dài chuỗi cellulose và tăng chậm
các nhóm khử, enzyme tác dụng mạnh lên cellodextrin. Enzyme này hoạt động
mạnh ở vùng vô định hình nhưng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh của cellulose.
• ß-1,4-glucosidase (hay cellobiase, EC 3.2.1.21) thủy phân cellobiose và các
4
cellodextrin khác hòa tan trong nước sinh ra, chúng có hoạt tính cao trên cellobiase,
còn cellodextrin thì hoạt tính thấp và giảm khi chiều dài của chuỗi tăng lên. Chức
năng của ß-glucosidase có lẽ là điều chỉnh sự tích lũy các chất cảm ứng của
cellulase.
Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase
Cellulase là một hệ enzyme phức tạp xúc tác sự thủy phân cellulose thành
cellobiose và cuối cùng thành glucose.
Sự phân giải cellulose dưới tác dụng của hệ enzyme cellulase xảy ra theo 3
giai đoạn chủ yếu sau:
Trong giai đoạn thứ nhất, dưới tác dụng của tác nhân C
1
, cellulose bị thủy phân
thành cellulose hòa tan. Trong giai đoạn thứ hai, cellulose hòa tan sẽ bị thủy phân
dưới tác dụng xúc tác của hệ enzyme C
x
tạo thành đường cellobiose.
Ở giai đoạn cuối cùng, dưới tác dụng của enzyme ß-1,4-glucosidase (hay
cellobiase, EC 3.2.1.21), cellobiose bị thủy phân thành glucose.
5
ﾧ
Hình 1.3. Cơ chế tác dụng của cellulase
Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tự
nhiên thường bị ảnh hưởng bởi tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có
loài phát triển rất mạnh, có loài phát triển yếu. Chính vì thế, việc phân hủy cellulose
trong tự nhiên được tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm.

Act.griseus
Act.melamocylas
Act.coelicolor
Act.candidus
Act.chromogenes
Act. hygroscopicus
Act.griseofulvin
Act.ochroleucus
Act.thermofulcus
Act.xanthostrums
Thermonospora curvata
Preudomonas
Fluorescens
B.megaterium
B.mensenteroides
Clostridium sp.
Acetobacter xylinum
Vi khuẩn dạ cỏ
Ruminoccus albus
Ruminobacter parum
Bacteroides
Amylophillus sp.
Clos.butiricum
Clos.locheheadil
Cellulosemonas
1.2. ỨNG DỤNG CỦA ENZYME CELLULASE
Hiện nay, enzyme cellulase được ứng dụng mạnh mẽ trong các ngành công
nghiệp khác nhau như: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp sản xuất bia rượu,
công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, công nghiệp dệt, sản xuất bột giặt, sản xuất
giấy, trong nông nghiệp

Chế phẩm cellulase tinh khiết được ứng dụng trong kỹ thuật di truyền. Trong
kỹ thuật tạo tế bào trần (protoplas), người ta thường dùng chế phẩm cellulase tinh
khiết để phá vỡ thành tế bào thực vật. Ứng dụng cellulase phá vỡ thành tế bào thực
vật không làm tổn thương các cơ quan bên trong tế bào, đảm bảo sự nguyên vẹn các
9
nhân tố di truyền.
Ngoài ra, việc sản xuất enzyme cellulase có hoạt độ cao để phân hủy cellulose
thành các nguồn nhiên liệu sinh học đang được quan tâm đặc biệt trong ngành công
nghiệp năng lượng sạch của toàn thế giới.
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ ENZYME CELLULASE
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Nghiên cứu và ứng dụng của cellulase bắt đầu từ những năm 1950. Cuối thế
kỷ XIX đã có rất nhiều tác giả nghiên cứu về khả năng tổng hợp cellulase từ các
loại vi sinh vật. Một số nghiên cứu về cellulase từ nấm của một sồ tác giả như :
Trichoderma reseii (Ogawa và cộng sự, 1991), Aspergillus sp. (Lusta và cộng sự,
1999), Schizophillum commune (Wilick & Seligy, 1985), Fusarium lini, Penicillium
funiculosum (Fogarty & Kelly, 1990). Năm 2000, Mawadza và cộng sự đã nghiên
cứu về khả năng tổng hợp cellulase từ các loại nấm có tính đặc hiệu cao bao gồm
phức hệ 3 enzyme: endoglucanase, cellobihydrolase và β-glucosidase thủy phân
hoàn toàn cellulose.
Trong số những nghiên cứu về khả năng sinh cellulase của vi khuẩn thì
Bacillus là chủng có khả năng sản sinh cellulase ngoại bào với số lượng lớn, và
được quan tâm nghiên cứu nhiều hơn cả đặc biệt là: B.subtilis (Park và cộng sự,
1991), B.polymxa, B.cereus (Robson & Chambliss, 1989), B.pumilus
(Christakopoulos và cộng sự, 1999), Bacillus sp. KMS-330 (Ozaki & Ito, 1991) và
KMS-635 (Ito và cộng sự, 1989).
Do cellulase có nhiều ứng dụng, cho nên rất nhiều nghiên cứu về enzyme
cellulase như: nghiên cứu về các tính chất hóa lý của chúng như xác định khối
lượng phân tử của Macarrón và cộng sự (1993); Sang và cộng sự (1995);
Henriksson và cộng sự (1999); Karisson và cộng sự (2001); Coral và cộng sự

Chlorophyceae, bộ: Ulvales.
2.1.2. VSV sinh cellulase:
Bao gồm cả nấm mốc, xạ khuẩn và vi khuẩn hiện diện trên rong giấy.
2.1.3. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật
* Môi trường phân lập VSV: các loại môi trường sử dụng: thạch thường,
capek, ISP
4
, các môi trường đường (glucose, maltose, manitol, D-frucrose, sucrose,
lactose) đều của Merck - Đức cung cấp.
* Môi trường ISP - 4 (g/l):
K
2
HPO
4
.3H
2
O 1 g
MgSO
4
.7H
2
O 1 g
CaCO
3
2 g
(NH
4
)
2
SO

Agar 15 - 20 g
Nước 1 lít
pH 7
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
VSV có khả năng sinh enzyme cellulase cao là những chủng có khả năng phân giải
tốt cơ chất cellulose. Vì thế các chủng VSV sinh enzyme cellulase cao thường hiện diện ở
những nơi giàu nguồn cellulose như: rơm rạ mục, lá cây mục, gỗ mục, mùn cưa mục hay
hiện diện trên thân rong… Vì thế chúng tôi tiến hành phân lập và tuyển chọn những
VSV sinh enzyme cellulase trên rong giấy và tuyển chọn các chủng sinh cellulase cao
theo các bước sau:
- Thu rong giấy đã ủ mục tại bãi biển Hòn Chồng - Nha Trang.
- Phân lập và tuyển chọn các chủng VSV trên môi trường thạch đặc trưng
(chọn chủng VSV có vòng phân giải CMC lớn nhất là chủng có khả năng sinh
cellulase cao nhất).
- Sơ bộ phân loại các chủng VSV được tuyển chọn bằng phương pháp truyền
thống.
- Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của
chủng VSV được tuyển chọn.
2.2.1. Phương pháp phân lập
Tiến hành phân lập các mẫu rong như sau:
Lấy 10 g rong đã ủ mục cho vào bình tam giác chứa 90 ml nước cất đã vô
trùng, lắc đều rồi tiến hành pha loãng ở các nồng độ khác nhau. Pha loãng mẫu theo
các nồng độ từ 10
-1
- 10
-8
. Lấy 1 ml ở bình tam giác sau khi lắc đều cho vào ống
nghiệm thứ nhất chứa 90 ml nước cất, lắc đều rồi lại lấy 1 ml cho vào ống nghiệm
thứ hai, cứ làm như vậy cho đến khi được nồng độ thí nghiệm (để có số khuẩn lạc
13

độ thuần chủng của các khuẩn lạc và kiểm tra tế bào dưới kính hiển vi. Khi được
khuẩn lạc thuần nhất và tách rời trên đĩa thạch thì cấy vào ống nghiệm giữ giống
(hình 2.1).
Phương pháp giữ giống và cấy chuyền: Sau khi tinh sạch xong ta chọn khuẩn
lạc mọc riêng rẽ cấy vào ống nghiệm thạch nghiêng. Tiến hành cấy ziczac trên ống
thạch nghiêng để được giống thuần khiết. Giống thuần khiết được bảo quản trong tủ
lạnh ở nhiệt độ 4
0
C, thời gian tốt nhất là 1 tháng. Sau 1 tháng tiến hành cấy chuyền
định kì để đảm bảo dinh dưỡng cho vi sinh vật. Trước khi sử dụng chủng thuần
khiết cần được hoạt hóa.
14
Hình 2.1. Quá trình phân lập vi sinh vật sinh cellulase từ rong giấy
Lưu ý: Mọi thao tác trên phải được thực hiện trong điều kiện vô trùng:
• Tay và bề mặt tiếp xúc trong tủ cấy được khử trùng bằng cồn.
• Không khí trong tủ cấy được khử trùng bằng tia UV.
• Dụng cụ phải được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn.
2.2.2. Phương pháp tuyển chọn chủng VSV sinh cellulase mạnh nhất
VSV được nuôi cấy lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng, trong môi trường
dịch thể. Sau 24 h đối với vi khuẩn, 36 - 48 h đối với nấm và 72 h đồi với xạ khuẩn
tiến hành ly tâm dịch nuôi cấy với tốc độ 8000 vòng/phút trong 15 phút hoặc lọc thu
dịch enzyme rồi đem xác định hoạt tính cellulase theo phương pháp Miller (phụ lục
02), (Miller, 1959).
2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp
* Phương pháp xác định thời gian nuôi cấy thích hợp
Nấm mốc được nuôi cấy lắc 200 vòng/phút ở các khoảng thời gian: 6; 12; 18;
24;30; 36; 42; 48; 54 và 60 h. Sau đó lọc thu sinh khối và xác định hoạt độ enzyme.
* Phương pháp xác định nhiệt độ nuôi cấy thích hợp
15
Nấm mốc được nuôi cấy trên môi trường bán rắn ở các nhiệt độ: 25; 30; 35;

• Cách tiến hành:
- Quan sát hình thái khuẩn lạc, màu sắc sợi nấm trên đĩa petri.
- Lấy một miếng băng dính trong suốt, đặt mặt dính nhẹ lên khuẩn lạc nấm,
sau đó lấy ra và áp sát vào phiến kính sao cho băng dính dính chặt vào phiến kính.
- Quan sát phiến kính dưới kính hiển vi.
2.2.5. Kiểm tra khả năng lên men các loại đường và khả năng sinh hơi
Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc cần kiểm tra cấy vào mỗi ống nghiệm có
chứa từng loại đường riêng biệt, để tủ ấm 37
o
C. Sau 24 - 72 h lấy ra đọc kết quả:
Phản ứng dương tính khi môi trường chuyển từ màu đỏ sang màu vàng và ngược
lại; VSV có khả năng sinh hơi khi có bọt khí trong ống duhaml.
2.2.6. Kiểm tra khả năng chịu muối
Cấy vi sinh vật lên đĩa peptri chứa môi trường đặc trưng với các nồng độ muối
khác nhau từ 1 - 11%, giữ trong tủ ấm 37
o
C. Sau 1 - 5 ngày lấy ra đọc kết quả, nếu
VSV mọc được ta kết luận chúng có khả năng chịu muối và ngược lại.
2.2.7. Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp các enzyme thủy phân khác
(protease và amylase)
17
Nấm sợi được nuôi cấy trên môi trường capek lỏng, lắc 200 vòng/phút, sau 36
– 48 h tiến hành thu dich lọc và xác định hoạt tính các enzyme theo phương pháp
khuếch tán trên môi trường thạch chứa cơ chất đặc trưng (casein với protease và
tinh bột với amylase). Để tủ ấm 37
0
C trong 24 h rồi đổ lugol và xác định hoạt tính
enzyme bằng cách đo vòng thủy phân.
2.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Xử lý số liệu nghiên cứu theo phương pháp thống kê sinh học. Mỗi thí nghiệm

7 VK7 15
8 N1 32
9 N2 36
10 N3 48
11 N4 40
12 N5 31
13 XK1 24
14 XK2 26
15 XK3 31
16 XK4 30
Nhận xét:
Kết quả phân lập ở bảng 3.1 cho thấy đã phân lập được 16 chủng VSV có khả
năng sản xuất enzyme cellulase, trong đó có 14 chủng VSV có hoạt tính enzyme
cellulase cao bao gồm 7 chủng vi khuẩn, 4 chủng nấm mốc và 4 chủng xạ khuẩn.
Từ những chủng có họat tính cellulase cao, chúng tôi chọn được bốn chủng VSV
19
có vòng thủy phân cellulose mạnh nhất gồm VK
4
, N3, N4 và XK
4
. Tiếp tục xác định
hoạt độ enzyme cellulase theo phương pháp Miller để chọn chủng có hoạt tính
cellulase cao nhất. Kết quả xác định hoạt tính cellulase được thể hiện như sau (bảng
3.2).
Bảng 3.2. Hoạt tính cellulase của 4 chủng đã qua sơ tuyển
Chủng
Hoạt tính
cellulase (mm)
Hoạt tính C
1

Trích đoạn Ảnh hưởng của nhiệt độ

---