ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

ĐẶNG THỊ MỸ TRIỀU

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN
MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM
SP. TỪ LÁ DƯƠNG XỈ (MARATTIACEAE)

Đà Nẵng – Năm 2018


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

ĐẶNG THỊ MỸ TRIỀU

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN
MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM
SP. TỪ LÁ DƯƠNG XỈ (MARATTIACEAE)

Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Cán bộ hướng dẫn : TS. PHẠM THỊ MỸ

Đà Nẵng – Năm 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.

1. Đặt vấn đề ..................................................................................................1
2. Mục tiêu đề tài............................................................................................2
3. Ý nghĩa của đề tài.......................................................................................2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3
1.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ METHYLOBACTERIUM SP. .....................3
1.1.1. Lịch sử phát hiện và phân loại VK Methylobacterium sp. ..............3
1.1.2. Đặc điểm phân bố ............................................................................4
1.1.3. Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh lí................................................4
1.1.4. Phương pháp phân lập và định danh................................................6
1.1.5. Các loài vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium ...............................6
1.1.6. Một số ứng dụng của chi Methylobacterium ...................................7
1.2. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP.
TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI ...........................................................10
1.2.1. Một số nghiên cứu trên thế giới .....................................................10
1.2.2. Một số nghiên cứu trong nước .......................................................12
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
.......................................................................................................................... 15
2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU......................................15
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................15
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu .......................................................................15
2.1.3. Nội dung nghiên cứu .....................................................................15
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................16
2.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ..................................................................16
2.2.2. Phương pháp thu mẫu ....................................................................17
2.2.3. Phương pháp phân lập ...................................................................17
2.2.4. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào và các test sinh
hóa của các chủng VK được tuyển chọn .................................................18
2.2.5. Phương pháp định danh các chủng VK bằng kỹ thuật sinh học phân
tử ..............................................................................................................20
2.2.6. Phương pháp khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh

Cetyltrimethyl-ammonium bromide

CMS:

Môi trường MS bổ sung Caseine Hydrolase

CFU:

Colony Forming Unit

IAA:

Indole-3-acetic acid

MMS:

Methanol minerat salts

NCBI

National Center for Biotechnology Information

PCR:

Polymerase Chain Reaction

PHB:

Poly-β-hydroxybutyrate


đặt tên (Lựa chọn dựa trên công bố của các tạp chí

7

trong ngân hàng NCBI)
2.1

Trình tự cặp mồi được sử dụng để khuếch đại vùng
gen 16S rRNA

3.1

Hình thái khuẩn lạc 32 chủng VK phân lập được

3.2

Tổng hợp các đặc tính sinh hóa của 2 chủng VK
(T6, T12)

22
25,26
31


DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ
Số hiệu

Tên hình ảnh

Trang

25

3.2

Hình thái khuẩn lạc của các chủng VK có sắc tố hồng

27

3.3

Tế bào dưới kính hiển vi của 15 chủng VK (T1, T2, T4, T5,
T6, T7, T8, T10, T12, T13, T16, T18, T25, T27, T31)

29

3.4

Thử nghiệm catalase 2 chủng VK T6, T12

30

3.5

Test Urease của 2 chủng VK T6, T12

31

3.6

Sinh khối của 2 chủng VK T6, T12

Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của 2 chủng VK T6 và
T12
Đường cong sinh trưởng của 2 chủng VK T6 và T12 sau
120h nuôi cấy

36
37
38
39


1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Chi Methylobacterium bao gồm nhiều loài vi khuẩn (VK) có sắc tố hồng dinh
dưỡng methyl tuỳ ý (pink-pigmented facultatively methylotrophic, PPFM). Chúng cư
ngụ chủ yếu ở vùng lá, nhưng đôi khi vẫn tìm thấy ở trong đất và trong nước. Chúng
sử dụng methanol từ thực vật làm nguồn carbon chủ yếu đồng thời sinh tổng hợp các
chất điều hòa tăng trưởng thực vật (auxin, cytokinin, salicylic acid), vitamine (B12)
và các enzyme (urease, ACC deaminase) để tác động ngược trở lại đối với thực vật,
là nhóm VK có ích nên chúng đã được sử dụng để tăng năng suất lúa [35], kích thích
sự sinh trưởng của mía, bông vải hay gia tăng tính kháng bệnh ở đậu phộng [9], [23],
[36].
Bên cạnh đó, Methylobacterium sp. có khả năng sử dụng đa dạng các hợp chất
hữu cơ khác nhau, từ các chất không độc cho tới các chất độc đối với sinh vật hay các
chất gây ô nhiễm môi trường (methyl bromine, methyl chloride, methane,
trinitrotoluent, Hg, Ni, Cd...) do vậy chúng có nhiều tiềm năng để ứng dụng trong xử
lý ô nhiễm môi trường [46]. M. radiotolerans, M. extorquens, M. fujisawaense còn
có khả năng kháng mạnh với các chất phóng xạ, chúng vẫn tồn tại ở liều chiếu xạ

2. Mục tiêu đề tài
Đề tài được thực hiện với mục tiêu là phân lập và tuyển chọn được các chủng
vi khuẩn Methylobacterium sp. từ lá dương xỉ. Từ đó tạo dữ liệu khoa học về các
chủng phập lập được, ứng dụng vào thực tiễn tại địa phương.

3. Ý nghĩa của đề tài
3.1 Ý nghĩa khoa học
Phân lập và lưu giữ được một số chủng VK Methylobacterium sp. Đây là nguồn
gen cung cấp cho các hướng nghiên cứu chuyên sâu hơn về sinh lý, sinh hóa, di
truyền...
3.2 Ý nghĩa thực tiễn
Các chủng VK phân lập được sẽ là tiền đề cho việc nghiên cứu các đặc tính và
ứng dụng sản xuất protein đơn bào, nhựa sinh học tự phân hủy PHB, các chất điều
hòa sinh trưởng thực vật…


3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ METHYLOBACTERIUM SP.
1.1.1 Lịch sử phát hiện và phân loại VK Methylobacterium sp.
Chi Methylobacterium bao gồm nhiều loài vi khuẩn (VK) có sắc tố hồng dinh
dưỡng methyl tuỳ ý (pink-pigmented facultatively methylotrophic, PPFM). Chúng có
khả năng sử dụng các hợp chất chỉ chứa một nguyên tử carbon như fomate,
formaldehyde, methanol hay các hợp chất chứa nhiều nguyên tử carbon làm nguồn
cung cấp năng lượng và nguồn carbon cho quá trình sinh trưởng [23].
Vị trí phân loại chi Methylobacterium trong giới vi sinh vật như sau: Giới:
Bacteria, ngành: Proteobacterium, lớp: Alphaproteobacteria, bộ: Rhizobiales, họ:
Methylobacteriaceae.
Mặc dù, VK Methylobacterium sp. hiện diện rất phổ biến trong đất hay trên các

và tập trung chủ yếu ở vùng lá thực vật [21], [23].
VK Methylobacterium sp. là những vi khuẩn hiếu khí hoàn toàn, do vậy các vi
khuẩn này có thể được phân lập môi trường nước sạch nào có chứa oxy hòa tan. Ngoài
ra, VK Methylobacterium sp. còn có khả năng kháng với ion Cl- nên chúng vẫn hiện
diện trong nước sạch dùng để sinh hoạt [24], [27].
VK Methylobacterium sp. được phân lập trên bề mặt lá, thân, rễ của thực vật
nhưng mật độ ở mỗi cơ quan thì khác nhau [29]. Chúng có mặt chủ yếu trên vùng lá
của hơn 100 loài thực vật và có mối quan hệ mật thiết với thực vật [18], [38], [40].
Thông qua phương pháp sử dụng carbon phóng xạ (C14) Green đã làm sáng tỏ khả
năng sử dụng các hợp chất methanol từ thực vật của VK Methylobacterium sp., điều
này giải thích nguyên nhân sự hiện diện của chi VK Methylobacterium sp. trên thực
vật [23], [28], [39].
VK Methylobacterium sp. thường lan truyền qua không khí, có khả năng sử
dụng các hợp chất có tính độc với sinh vật làm nguồn cung cấp carbon và nitơ:
tetrachloromethane, trimethylamine. Chính vì vậy, các VK Methylobacterium sp. còn
đóng vai trò quan trọng trong chu trình carbon trong tự nhiên [23], [48], ứng dụng
trong xử lý ô nhiễm môi trường [49]. Tuy nhiên, vai trò của chúng trong hệ sinh thái
vẫn chưa được sáng tỏ [38].

1.1.3 Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh lí
Hầu hết các loài Methylobacterium sp. thường có hình que kích thước 0,8 - 1 x
1- 8µm và là VK gram âm, thường ở dạng tế bào đơn hay kết đôi lại theo dạng hoa
hồng (rosettes) [22], [23]. Hầu hết các chủng Methylobacterium sp. đều có khả năng


5

di động nhờ một tiêm mao ở cực hay gần cực và chúng cho phản ứng dương tính với
catalase [23]. Chúng thường tăng sinh chậm, khuẩn lạc có màu hồng hay đỏ cam, một
vài chủng không tăng trưởng trên môi trường nutrient agar. Sắc tố hồng của VK

đặc trưng. Hầu hết các chủng có khả năng sử dụng betaine, trimethylanine,
serbactae,... Trong khi một số loài khác có khả năng sử dụng cyanate, thiocianate,
formaldehyde, TNT (2,4,6-trinitrotoluene), HMX (octahydro-1,3,5,7-tetranitro1,3,5,7-tetrazicine hay high-melting-point explosive), RDX (hexahydro-trinitro1,3,5-triazine hay royal explosive),... Do vậy, có thể phân biệt các loài VK
Methylobacterium sp. nhờ căn cứ vào khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ của các
chủng này [21], [23], [24].

1.1.4 Phương pháp phân lập và định danh
Methylobacterium sp. là những vi khuẩn có khả năng sử dụng methanol làm
nguồn cung cấp carbon và năng lượng, vì thế môi trường methanol mineral salts
(MMS) là môi trường thích hợp để phân lập vi khuẩn Methylobacterium sp. Ngoài
ra, VK Methylobacterium sp. có sắc tố hồng đặc trưng nên rất dễ nhận diện trên môi
trường phân lập [23].
Khoảng nhiệt độ thường được sử dụng để phân lập Methylobacterium sp. là 25300C. Vi khuẩn có tốc độ tăng trưởng tương đối chậm, trên môi trường MMS sau 2
đến 3 ngày mới hình thành khuẩn lạc, khuẩn lạc đạt đường kính tối đa 1-3 mm sau 7
ngày nuôi cấy. Đôi khi vi khuẩn mọc nhanh, có màu đậm hơn trên môi trường
Glycerol-Peptone Agar và môi trường này thường được sử dụng trong giữ giống các
chủng VK Methylobacterium sp. [23].
Ngoài việc sử dụng methanol làm tác nhân chọn lọc thì việc sử dụng
cycloheximide cũng giúp cho quá trình phân lập được thuận lợi hơn. Khi sử dụng môi
trường MMS làm môi trường phân lập thì những khuẩn lạc màu hồng có đường kính
khoảng 1 mm thường là vi khuẩn Methylobacterium sp., trong môi trường này nhóm
nấm men hay nhóm vi khuẩn có sắc tố hồng không phải là phổ biến [23], [36].

1.1.5 Các loài vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium
Theo thống kê của ngân hàng dữ liệu NCBI [51] thì đã có tổng cộng 52 loài tính
đến tháng 4. 2018 (bảng 1.1).


7


21

M. iners

39

M. radiotolerans

4

M. aquaticum

22

M. isbiliense

40

M. rhodesianum

5

M. brachiatum

23

M. jeotgali

41


26

M. marchantiae

44

M. specialis

9

M. dankookense

27

M. mesophilicum

45

M. suomiense

10 M. endosymbiont

28

M. nodulans

46

M. tardum


14 M. gnaphalii

32

M. persicinum

50

M. trifolii

15 M. goesingense

33

M. phyllosphaerae

51

M. variabile

16 M. gossipiicola

34

M. phyllostachyos

52

M. zatmanii


Basile và cộng sự (1969) phát triển kích thích sinh trưởng ở cây rêu (Scapania
nemorosa) trong điều kiện in vitro. Trong những nghiên cứu ban đầu, họ mô tả VK
này có thể kích thích sự tăng trưởng và tái sinh của rêu nuôi cấy mô. Sau đó, họ chỉ


8

ra rằng VK Methylobacterium sp. sản xuất vitamine B12 (cyanocobalamine) và sự bổ
sung vitamine này khi trồng rêu Jungermannia leiantha và Gymnocolea inflata có
thể kích thích sự tăng trưởng và phát triển của cây. VK Methylobacterium sp. có tác
động đối với một số lượng lớn các loài cây trồng có giá trị như: thuốc lá, bông, dâu
tây, lúa, bông vải, mía, cà chua, hướng dương, đậu phụng [9], [35], [36]. Tuy nhiên,
hiệu quả cho từng loại cây trồng không phải do một loài mà là do sự tác động tổng
hợp của nhiều loài VK Methylobacterium sp. tạo ra [23].
Ngoài khả năng kích thích sự tăng trưởng và phát triển của một số loài cây trồng,
VK Methylobacterium sp. còn có khả năng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh trên
thực vật chẳng hạn như: Xanthomonas camprestris, Pseudomonas syringae, Erwinia
carotovora, Clavibacter michiganense và Agrobacterium tumefaciens, Fusarium
solani (gây bệnh trên cây tiêu), Guignardia citricarpa hay Xylella fastidiosa (gây
bệnh nghiêm trọng trên các loài cây có múi). Madhaiyan ghi nhận khả năng kháng
bệnh ở cây lúa và cây đậu phộng có liên quan tới sự thay đổi hệ enzyme polyphenol
trong cây [35]. Penalvera và Poonguzhali ghi nhận khả năng sinh tổng hợp các phân
tử tín hiệu N-acyl homoserine lactone, điều này giúp VK Methylobacterium sp. cạnh
tranh với các loài VK gây bệnh khác trong quá trình cư trú trên thực vật [42]. Các
nghiên cứu này ghi nhận khả năng giúp cây trồng kháng lại với các tác nhân gây bệnh
nhưng chưa làm sáng tỏ các cơ chế. Tuy nhiên, những ghi nhận này cũng cho thấy
tiềm năng sử dụng VK Methylobacterium sp. để kiểm soát dịch bệnh trên thực vật
[18], [40].
b. Sản xuất nhựa sinh học PHB
PHB (Poly-β-hydroxybutyrate) là một loại nhựa polymer chịu nhiệt, là nguồn

25mg/l TNT, 20mg/l RDX, 2,5mg/l HMX sau 55 ngày nuôi cấy để tạo ra CO2 [45],
[46]. Methylobacterium sp. đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái do chúng có
khả năng sử dụng methan một loại khí gây hiệu ứng nhà kính. Ngoài ra, VK
Mehtylobacterium sp. cũng có khả năng phân hủy nhiều hợp chất hữu cơ gây ô nhiễm
khác bao gồm methyl chloride, methyl bromide, methyl iodide, dichloromethane,
methul tert-butyl ether, methylated amines, những hợp chất có chứa ethylated sulfur,
cyanate và thiocyanate [23], [40].
d. Ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm
Ngoài khả năng sinh tổng hợp PHB, VK Methylobacterium sp. còn có khả năng
sinh tổng hợp một số hợp chất khác có giá trị kinh tế chẳng hạn như: exopolysaccharid


10

được sử dụng để tạo ra các màng sinh học, methylan được sử dụng để tạo ra các
polysaccharid ion dương nhằm thay thế cholestyramine dùng trong điều trị bệnh cao
huyết áp [47].
Trong lĩnh vực thực phẩm VK Methylobacterium sp. cũng có thể góp phần quan
trọng và đầy tiềm năng bởi vì chúng vừa có khả năng sử dụng các nguồn nguyên liệu
rẻ tiền vừa có thể tạo các sản phẩm có giá trị như protein đơn bào, β-carotene,
vitamine B12 và nhiều sản phẩm có giá trị khác [23], [44].
Từ những cơ sở này có thể kết luận rằng VK Methylobacterium sp. có nhiều
tiềm năng ứng dụng không chỉ trong nông nghiệp mà còn trong lĩnh vực môi trường,
thực phẩm.

1.2. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM
SP. TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI
1.2.1 Một số nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới việc nghiên cứu về Methylobacterium sp. khá phong phú và đa
dạng.

tăng năng suất trên cây mía, bông, đậu phộng [23].
Sự tổng hợp một số hợp chất thứ cấp của Methylobacterium sp. cũng được ghi
nhận. Năm 2001, trong nghiên cứu của Ivanova chỉ ra rằng 4 loài Methylobacteria là
M. mesophilicum, A. aminovorans, M. mays, P. Kondratievae có thể tạo IAA. Năm
2002, Koenig và cộng sự kiểm tra được lượng cytokynin được tổng hợp bởi PPFM
[41]. Năm 2004, nghiên cứu của Omer và cộng sự chứng minh rằng Methylobacteria
hiếu khí có thể tổng hợp auxin (chủ yếu là IAA) từ L- tryptophan ngoại bào [39],
[40].
Bên cạnh khả năng tổng hợp các chất góp phần gia tăng khả năng sinh trưởng
của thực vật, Methylobacterium sp. còn có khả năng tổng hợp nhựa sinh học PHB.
Trong nghiên cứu của Ackermann và cộng sự (1994), chứng minh rằng PHB được
tích lũy trong tế bào ở điều kiện bị giới hạn dinh dưỡng. Tùy thuộc vào yếu tố giới
hạn (nitrogen hoặc phosphate) mà tổng tích lũy PHB biến thiên trong khoảng 2%
trọng lượng thô của sinh khối [35], [37].
Ngoài ra, VK Methylobacterium sp. được Van Aken (2004) đánh giá là có tiềm
năng ứng dụng trong xử lí ô nhiễm môi trường bởi chúng có khả năng phân giải các
hợp chất hữu cơ gây ô nhiễm khác như methyl chloride, methyl bromide, methyl
iodide, methyl tert-butyl ether, dichloromethane, những hợp chất chứa ethylated
sunfur, cyanate, thiocyanate [45], [46].


12

Vì sử dụng các hợp chất một carbon làm nguồn năng lượng nên VK
Methylobacterium sp. đang là một VK kiểu mẫu đầy tiềm năng trong việc sử dụng
nguồn nguyên liệu rẻ tiền để sản xuất ra các sản phẩm có giá trị chẳng hạn như:
protein đơn bào, β-carotene, vitamine B12, Q10, các amino acid…[23], [46]. Ngày
nay, nhiều công trình tập trung nghiên cứu vào việc thiết kế các hệ thống vector tái
tổ hợp nhằm biểu hiện các protein ngoại lai trong tế bào VK Methylobacterium sp.,
trong đó hai công trình nổi bật trong hướng nghiên cứu này là biểu hiện bacteriocin

tổng hợp auxin, cytokinin và gibberellin [9].
Trong nghiên cứu về poly-beta-hydroxybutyrate (PHB, nhựa phân hủy sinh
học), Lê Lý Thùy Trâm (2006) chứng minh chủng Methylobacterium sp. (kí hiệu
Mcd) phân lập từ môi trường nuôi cấy mô cây chanh dây tạp nhiễm VK màu hồng,
có thể phát triển trên môi trường khoáng cơ bản với methanol 1% là nguồn C và lượng
PHB tạo ra chiếm 31.37 % tổng lượng sinh khối khô sau 4 ngày nuôi cấy [14].
Năm 2010, Kiều Phương Nam và cộng sự nghiên cứu sâu về sự tích lũy nhựa
phân hủy sinh học PHB, ở chủng VK Methylobacterium radiotolerans H2T được xác
định thông qua quan sát sự phát màu màu cam sáng của tế bào VK đã được nhuộm
với Nile Blue A 1% trên kính hiển vi huỳnh quang và phân tích sản phẩm PHB thu
nhận từ sinh khối VK bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS). Khảo
sát các điều kiện nuôi cấy để gia tăng khả năng tích lũy PHB ở này cho thấy: môi
trường khoáng Med3 có 1% methanol thích hợp hơn môi trường MMS và khoáng K.
Khi bổ sung thêm nguồn carbon (methanol 1,5% ) ở thời điểm 24 giờ sau khi bắt đầu
nuôi cấy đã kích thích sự tích lũy PHB lên tới 50,55% (khối lượng PHB/khối lượng
sinh khối tế bào). Hiệu suất này cao hơn hoặc ngang bằng với hiệu suất tích lũy PHB
ở một số chủng Methylobacterium sp. khác đã được nghiên cứu trong nước cũng như
trên thế giới. Kết quả này cho thấy tiềm năng sản xuất PHB theo con đường sinh học
từ nguồn Carbon rẻ tiền (methanol) đang mở ra một hướng nghiên cứu và ứng dụng
mới đầy triển vọng ở nước ta hiện nay [10].
Ngoài ra các nhà khoa học trên đã tiến hành nghiên cứu ứng dụng VK
Methylobacterium sp. trong tạo chế phẩm gia tăng tỉ lệ nảy mầm của hạt giống cây
trồng. Kết quả cho thấy ở VK Methylobacterium sp. có tính đặc hiệu chủng. Mỗi
chủng tác động mạnh nhất đối với một loại hạt nhất định. Tuy nhiên, vẫn có một vài
chủng có phổ hoạt tính rộng, điển hình là chủng 1021b. Các chủng Methylobacterium
sp. không chỉ làm tăng tỉ lệ nảy mầm và sức nảy mầm của hạt mà còn tăng kích thước
và chiều cao của cây con [9].


14


2.1.3 Nội dung nghiên cứu
Đề tài tập trung vào các nội dung sau:
- Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn các chủng VK có sắc tố hồng có khả năng
sinh trưởng trên môi trường MMS có bổ sung 1% methanol.
- Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, nuôi cấy và đặc tính lý hóa của các chủng
VK được tuyển chọn.
- Định danh chủng VK tuyển chọn bằng bằng kỹ thuật sinh học phân tử.
- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng và xây dựng đường cong sinh trưởng của
các chủng VK Methylobacterium sp. được định danh.


16

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm nghiên cứu được bố trí theo sơ đồ sau đây:

Mẫu lá dương xỉ
Phân lập
Các chủng vi khuẩn
Làm thuần
Các chủng vi khuẩn
thuần
Khảo sát đặc điểm hình
thái, nuôi cấy, sinh lý
hóa
Tuyển chọn
Chủng VK
Methylobacterium sp.