Viện Đại Học Mở Hà Nội

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn tới ban giám hiệu Viện Đại học mở
Hà Nội, đặc biệt các thầy cô trong khoa Công nghệ Sinh học đã dạy dỗ em
trong suốt 4 năm học tại trường, trang bị cho em nền tảng kiến thức khoa học
để có thể học hỏi thêm nhiều điều bổ ích có thể áp dụng vào thực tế và đã tạo
điều kiện tốt nhất cho em được làm bài báo cáo tốt nghiệp này.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS.Lê Thị Hồng
Minh, Phó Trưởng phòng Công nghệSinh học– Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và NCS.Vũ Thị Quyên, người đã truyền
cho em phương pháp học tập, nghiên cứu khoa học, đã tận tình hướng dẫn, chỉ
bảo, giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu vừa qua.
Đồng thời, em cũng gửi lời cảm ơn tới các cô chú, anh chị và các bạn
trong Phòng Công nghệ Sinh học– Viện Hóa Sinh Biển đã nhiệt tình giúp đỡ
em hoàn thành tốt đợt thực tập.
Sau cùng, em xin kính chúc quý thầy cô trongkhoaCông nghệ Sinh học
nói chung và thầy cô giáo Viện Đại học mở nói riêng thật nhiều sức khỏe, niềm
tin để thực hiện sứ mệnh cao đẹp của mình là truyền kiến thức cho thế hệ mai
sau.
Trân trọng!

Sinh viên
Trịnh Thị Thanh Lam

Trònh Thj Thanh Lam


Viện Đại Học Mở Hà Nội

MỤC LỤC

Viện Đại Học Mở Hà Nội

3.2.1. Thu thập các mẫu trầm tích. .................................................................... 28
3.2.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn. ............................................................. 28
3.2.3. Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật bằng khuếch tán trên đĩa
thạch. [24].......................................................................................................... 28
3.2.4. Xác định khả năng sinh enzyme của các chủng nghiên cứu. .................. 29
3.2.5. Phương pháp tách chiết ADN tổng số..................................................... 32
3.2.6. Phương pháp PCR. .................................................................................. 32
3.2.7: Phương pháp giải trình tự. ...................................................................... 36
PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. ....................................................... 37
4.1. Kết quả thu thập mẫu. ................................................................................ 37
4.2. Phân lập vi khuẩn từ trầm tích. .................................................................. 38
4.3. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng nghiên cứu...... 40
4.4. Khả năng sinh enzyme của các chủng nghiên cứu. ................................... 42
4.4.1. Khả năng thủy phân tinh bột tan. ............................................................ 42
4.4.2. Khả năng thủy phân protein (casein) ...................................................... 44
4.4.3. Khả năng thủy phân CMC. ..................................................................... 45
4.5. Định danh vi khuẩn bằng sinh học phân tử................................................ 46
4.5.1. Tách chiết AND từ vi khuẩn. .................................................................. 46
4.5.2. Thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR. ................................ 46
4.5.3. Nhân gen 16S ADN riboxom. ................................................................. 47
3.4.4. Kết quả giải trình tự gene 16S của ba chủng vi khuẩn ......................... 48
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................... 53
5.1. Kết luận. ..................................................................................................... 53
5.2. Kiến nghị. ................................................................................................... 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO. ................................................................................ 55

Trònh Thj Thanh Lam


Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

G(-)

Gram âm

G(+)

Gram dương

HTKS

Hoạt tính kháng sinh

KS

Kháng sinh

LB

Lauria Betani

PCR

Polymerase Chain Reaction

SDS

Sodium dodecyl sulfate



Bảng 2.1. Các chất kháng sinh được phát hiện qua các năm.
Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR.
Bảng 3.2: Thành phần phản ứng để xác định trình tự.
Bảng 4.1. Danh sách các mầu thu được ở Vịnh Văn Phong – Khánh Hòa.
Bảng 4.2. Danh sách các chủng vi khuẩn phân lập được.
Bảng 4.3. Kết quả thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định.
Bảng 4.4: Trình tự và thông số các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR.

Trònh Thj Thanh Lam


Viện Đại Học Mở Hà Nội

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1. Một số hình ảnh về vi khuẩn.
Hình 2.2. Cấu tạo của vi khuẩn.
Hình 2.3. Các hình dạng chính của vi khuẩn.
- Cầu khuẩn: 1,2,3,4,5.
- Trực khuẩn: 6,7,8,9.
- Xoắn khuẩn: 10,11,12.
Hình 2.4. Alexander Fleming và Penicillium notatum được phân lập.
Hình 2.5. Ba nhà khoa học được nhận giải Nobel về Y học.
Hình 2.6. Vi khuẩn E.coli
Hình 2.7. Vi khuẩn Salmonella enterica
Hình 2.8. Vi khuẩn Bacillus cereus.
Hình 4.1. Một số hình ảnh khi thu thập mẫu ở Văn Phong
Hình 4.2. Một số hình ảnh phân lập vi khuẩn sau 2-7 ngày nuôi cấy
Hình 4.3. Một số hình ảnh làm sạch các chủng vi khuẩn.
Hình 4.4. Một số hình ảnh thử hoạt tính kháng VSVKĐ

Salmonella enterica ATCC13076.
+ 1 chủng vi khuẩn Gram dương (+): Bacillus cereus ATCC13245.
Trònh Thj Thanh Lam


PHẦN I: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ngộ độc thực phẩm luôn là vấn đề có ý nghĩa rất lớn đến sức khỏe cộng
đồng, ảnh huởng đến hầu hết các nuớc trên toàn thế giới.Theo thống kê của
Cục An toàn Vệ sinh Thực phẩm, mỗi năm Việt Nam có chừng 250-500 vụ
ngộ độc thực phẩm với 7.000-10.000 nạn nhân và 100 – 200 ca tử vong. Có rất
nhiều nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm, trong đó một trong những nguyên
nhân chính là do thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật (33-49%) chủ yếu do
Salmonella, E.coli, Clostridium perfringens, vi khuẩn Listeria.
Trong một nghiên cứu ở Hà Nội mới được công bố trên tập san nhiễm
trùng học quốc tế, các nhà nghiên cứu phân tích số liệu từ 587 trẻ em mắc bệnh
tiêu chảy và 249 em không mắc bệnh. Trong nhóm tiêu chảy, 41% xảy ra ở trẻ
em dưới 1 tuổi. Phân tích vi sinh cho thấy rotavirut nhóm A hiện diện trong
47% trường hợp, kế đến là E.coli (22,5%), Shigella spp (khoảng 5%) và
Bacteroides fragilis (khoảng 7%).[39,40].
Các bệnh đường ruột là một trong những nỗi lo đáng ngại đối với con
người, gây nguy hại nghiêm trọng đến sức khỏe con người.Khi đường ruột gặp
phải bất kỳ vấn đề gì sẽ làm đảo lộn hoạt động bình thường của hệ tiêu hóa. Vì
vậy không thể xem nhẹ trước những tín hiệu bất thường để phòng ngừa các
bệnh đường ruột. Đa số vi sinh vật gây bệnh là loại sống ký sinh và lấy thức ăn
từ vật chủ. Một sốvi sinh vật gây bệnh sản sinh ra các độc tố (khả năng tạo ra
ngoại độc tố hoặc nội độc tố) đối với vật chủ,các đốc tố của vi khuẩn sẽ có tác

Trònh Thj Thanh Lam




tài: “Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn từ mẫu trầm tích biển
thu nhập được ở Văn Phong – Khánh Hòa có hoạt tính kháng một số
chủng vi sinh vật kiểm định gây bệnh đường ruột”.
1.2. Mục tiêu của đề tài.
Tuyển chọn được 2-3 chủng vi khuẩn từ mẫu trầm tích biển có hoạt tính
kháng một số chủng vi sinh vật kiểm định gây bệnh đường ruột và định danh
bằng sinh học phân tử các chủng đã lựa chọn. Nhằm chọn được những chủng
vi sinh vật có khả năng tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học tốt làm tiền đề
cho các ứng dụng trong chăm sóc sức khỏe cộng đồng.
1.3. Nội dung của đề tài.
• Phân lập vi sinh vật từ mẫu trầm tích biển.
• Sàng lọc và tuyển chọn được vi khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật
kiểm định gây bệnh đường ruột.
• Định danh các chủng có hoạt tính cao nhất.

1.4. Ý nghĩa của đề tài.
Tiến hành các nghiên cứu về hệ vi khuẩn từ trầm tích biển, từ đó tiến tới
khai thác nguồn dược liệu từ vi sinh vật biển nói chung và vi khuẩn từ trầm
tích biển nói riêng.

Trònh Thj Thanh Lam

Page 3


PHẦN II. TỔNG QUAN
2.1. Vi khuẩn.
Vi khuẩn (tiếng Anh và tiếng La Tinh là bacterium, số nhiều bacteria) đôi

sinh trong cơ thể người hay các sinh vật khác. Ví dụ như sự hiện diện của các
vi khuẩn cộng sinh trong ruột già giúp ngăn cẳn sự phát triển của các vi sinh
vật có hại. Vi khuẩn có khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ một cách đáng
kinh ngạc. Một số nhóm vi sinh “chuyển hóa” đóng một vai trò rất quan trọng
trong việc hình thành các khoáng chất từ một số nhóm hợp chất hữu cơ. Ví dụ,
sự phân giải cellulose, một trong những thành phần chiếm đa số trong mô thực
vật, được thực hiện chủ yếu bởi các vi khuẩn hiếu khí thuộc chi Cytophaga.
Khả năng này cũng được con người ứng dụng trong công nghiệp và trong cải
thiện sinh học (bioremediation). Các vi khuẩn có khả năng phân hủy
hydrocarbon trong dầu mỏ thường được dùng để làm sạch các vết dầu loang…
Vi khuẩn cùng với nấm men và nấm mốc được dùng để chế biến các thực phẩm
lên men như phô-mai, dưa chua, nước tương, dưa cải bắp, giấm, rượu…Sử

Trònh Thj Thanh Lam

Page 5


dụng công nghệ sinh học, các vi khuẩn có thể được “thiết kế” để sản xuất thuốc
trị bệnh như insulin, hay để cải thiện sinh học đối với các chất thải độc hại.[1]
2.1.2. Cấu tạo của vi khuẩn.[1,42]
Dưới kính hiển vi điện tử, tế bào vi khuẩn được quan sát gồm các thành phần
sau:

Hình 2.2. Cấu tạo của vi khuẩn.
2.1.2.1. Nhân (nuclear body).
Vi khuẩn không có nhân điển hình vì không có màng nhân, nhưng có cơ
quan chứa thông tin di truyền đó là nhiễm sắc thể (chromosome) tồn tại trong
nguyên sinh chất. Bản chất nhiễm sắc thể là ADN có hình cầu, hình que hoặc
hình chữ V, sao chép theo kiểu bán bảo tồn dẫn đến sự phân bào. Tuy nhiên, sự


Trònh Thj Thanh Lam

Page 7


đặc điểm để phân loại vi khuẩn, ví dụ: phẩy khuẩn tả có lông ở một đầu, nhiều
loại vi khuẩn khác có lông quanh thân như (Salmonella, E.coli), một vài vi
khuẩn khác lại có một chùm lông ở đầu.
2.1.2.7. Pilli.
Là cơ quan phụ của vi khuẩn như lông, nó có thể mất đi nhưng không ảnh
hưởng tới sự tồn tại của vi khuẩn. Pilli bám vào các tế bào có màng nhân, khả
năng gây bệnh của một số loại vi khuẩn cũng liên quan đến sự tồn tại của Pilli,
nếu vi khuẩn lậu mất Pilli sẽ không thể gây bệnh được.
2.1.2.8. Nha bào.
Nhiều loại vi khuẩn có khả năng tạo nha bào khi điều kiện sống của
chúng không thuận lợi. Mỗi vi khuẩn chỉ tạo được một nha bào, khi điều kiện
sống thuật lợi, nha bào vi khuẩn lại nẩy mầm để đưa vi khuẩn trở lại dạng sinh
sản. Nha bào có thể tồn tại lâu tới 150.000 năm, do ở dạng nha bào không có sự
chuyển hóa và mất nước.
2.1.3. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn.
Vi khuẩn có nhiều hình thái khác nhau: hình cầu, hình que, hình xoắn,
hình dấu phẩy, hình sợi…Kích thước thay đổi tùy theo các loại hình và trong
một loại hình kích thước cũng khác nhau. So sới virus, kích thước của vi khuẩn
lớn hơn nhiều, có thể quan sát vi khuẩn dưới kinh hiển vi quang học. Dựa vào
loại hình có thể chia ra một số nhóm sau:

Trònh Thj Thanh Lam

Page 8


2.2. Chất kháng sinh.
2.2.1. Khái niệm về chất kháng sinh. [13]
Thời kì vàng son của kháng sinh bắt đầu từ khi sản xuất penicillin để dùng
trong lâm sàng (1941). Khi đó người ta đã định nghĩa: “Kháng sinh là những
sản phẩm trao đổi chất tự nhiên được các vi sinh vật tiết ra (vi khuẩn, vi nấm),
có tác dụng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật
khác”, theo Walsman 1942.
Tuy nhiên, với sự phát triển của khoa học, người ta có thể tổng hợp, bán tổng
hợp các kháng sinh tự nhiên (chloramphenicol); tổng hợp nhân tạo các chất có
tính kháng sinh: sulfamid, quinolon hay chiết xuất từ vi sinh vật những chất
diệt được tế bào ung thư (actinomycin). Vì thế định nghĩa kháng sinh đã được
thay đổi: “Kháng sinh là tất cả các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng
hợp với nồng độ rất thấp có khả năng đặc hiệu kìm hãm sự phát triển hoặc tiêu
diệt đối với các vi sinh vật gây bệnh, đồng thời không có tác dụng hoặc tác
dụng yếu lên con người, động vật và thực vật bằng con đường cung cấp
chung”. [3]
Để biểu thị độ lớn giá trị hoạt tính sinh học của kháng sinh trong 1ml dung dịch
(đơn vị/ml) hay 1 mg chế phẩm (đơn vị/mg), thường dùng đơn vị kháng sinh.
Đơn vị kháng sinh là lượng kháng sinh tối thiểu hòa tan trong một thể tích môi
trường xác định, có tác dụng ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật kiểm định trong
thời gian xác định.[3] Đơn vị kháng sinh quốc tế là UI, ví dụ: 1 UI penicillin =
0,6 µg, còn 1 UI streptomycin = 1,0 µg (Hopwood, 2007).

Trònh Thj Thanh Lam

Page 10


2.2.2. Lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh. [13]

loại được dùng trong Y khoa và Thú y.
Kể từ đó, kháng sinh đã trở thành một dược phẩm thần kì sớm chiếm vị trí hàng
đầu trong lĩnh vực dược phẩm thế giới, với những kết quả ngày càng mới lạ,
với nhu cầu ngày càng tăng và lượng sản xuất ngày càng lớn. Hơn thế nữa, bên

Trònh Thj Thanh Lam

Page 12


cạnh chất penicillin đầu đàn, có thêm nhiều loại kháng sinh được chiết xuất từ
nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn.
Năm CKS được phát hiện

Nước Năm CKS được phát hiện

Nước

1929 Penicillin

Anh

1939 Gramicidin

Mỹ

1943 Streptomycin

Mỹ


Mỹ

1966 Docycyclin

Mỹ

1973 Torbamycin

Mỹ

1972 Cephamycin

Mỹ

Bảng 2.1. Các chất kháng sinh được phát hiện qua các năm. [7]
Những năm 1940 – 1959 được coi là thời kỳ hoàng kim của việc nghiên
cứu CKS với hàng loạt CKS mới liên tiếp được phát hiện như: gramixidin,
tiroxidin do Rene Jules Dobos phát hiện năm 1939, streptomycin do Waksman
phát hiện năm 1941, erythromycin do Gurre phát hiện năm 1952…Cùng với
việc phát hiện ra các CKS mới, công nghệ lên men sản xuất CKS cũng ra đời
và dần được hoàn thiện.
Ngay từ những năm 1950, CKS đã được nghiên cứu sử dụng trong việc phòng
chống bệnh, kích thích sự tăng trưởng của động vật nuôi và cây trồng. CKS thu
hút được sự quan tâm của các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau
trên thế giới.

Trònh Thj Thanh Lam

Page 13


ra các chủng có hoạt tính kháng sinh cao, đồng thời nhằm mục đích tìm kiếm
các loại kháng sinh mới và quý trong thời gian ngắn. [10],[26].
2.2.3. Sự hình thành chất kháng sinh ở vi khuẩn.[7,8,9]
Một trong những đặc điểm quan trọng của vi khuẩn là có thể có khả năng
hình thành chất kháng sinh. Có nhiều chất kháng sinh dùng trong y học hiện
nay có nguồn gốc từ vi khuẩn.
Đa số các chất kháng sinh có nguồn gốc từ vi khuẩn đều có phổ kháng
sinh rộng, kìm hãm hoặc ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nhiều loại vi
sinh vật khác nhau. Ngày nay, người ta đã biết chất kháng sinh là sản phẩm trao
đổi thứ cấp của vi sinh vật, dẫu vậy vẫn còn nhiều giả thuyết khác nhau về vai
trò của chất kháng sinh đối với vi khuẩn. Một số giả thuyết cho rằng, sự hình
thành chất kháng sinh là cơ chế giúp vi khuẩn tồn tại trong môi trường tự
nhiên, sự hình thành chất kháng sinh là do sự cạnh tranh môi trường dinh
dưỡng. Lại có giả thuyết cho rằng chất kháng sinh chỉ là sản phẩm thải ra của
quá trình trao đổi chất của tế bào. [1] [25]
2.2.4. Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ vi khuẩn.
Các kháng sinh là một nhom thuốc thiết yếu trong y học hiện đại. Nhờ các
thuốc kháng sinh mà y học đã có thể loại bỏ được các dịch bệnh nguy hiểm.
Hiện nay trên thế giới người ta đã phát hiện trên 8000 chất kháng sinh và mỗi
năm có khoảng vài trăm chất kháng sinh mới được phát hiện ra. Trong tương
lại chắc chắn còn có nhiều chất kháng sinh khác nữa sẽ được tìm ra vì đa số các
vi sinh vật có khả năng tạo thành chất kháng sinh được nghiên cứu đến nay đều
chỉ thuộc về các chi Streptomyces và Bacillus. Cho đến nay, hầu hết các thuốc

Trònh Thj Thanh Lam

Page 15


kháng sinh đều được sản xuất từ xạ khuẩn. Chỉ có số ít vi khuẩn được tìm ra để

mức độ halogen hóa cao- một tính chất tương đối phổ biến của các chất chuyển
hóa thứ cấp có nguồn gốc từ biển. Các vi khuẩn được nuôi cấy từ môi trường
biển bao gồm loài mới được chứng minh là nguồn đặc biệt quan trọng của các
thực thể hóa học mới.
Môi trường biển bao gồm vô số các môi trường sống với sinh thái khác
nhau. Vì vậy, không đáng ngạc nhiên khi vi khuẩn thích nghi với cuộc sống
trong môi trường biển rất đa dạng, khác biệt và duy trì sự thích nghi sinh tồn
khác với vi khuẩn trên đất. Một trong những khác biệt sinh lý sớm nhận ra nhất
giữa các vi khuẩn có nguồn gốc từ biển là yêu cầu của nước biển, hay cụ thể
hơn natri, dùng cho sự tăng trưởng. Vi khuẩn nuôi cấy từ mẫu biển mọc tốt
như nhau trong môi trường được chuẩn bị bằng nước biển hoặc nước khử ion.
Ngược lại, vi khuẩn có khả năng tăng trưởng trên môi trường chuẩn bị với nồng
độ muối tương đương với nước biển có thể được dễ dàng nuôi cấy từ mẫu
không thuộc biển. Những chủng này, nó có thể được coi là có tiềm năng tăng
trưởng trong cả hai môi trường. [8] [15].
Năm 1997, Heidi Schulz đã tìm thấy vi khuẩn Thiomargarita namibiensis trong
tầng lắng đọng ở vùng biển Namibia – bờ biển phía Tây của Châu Phi. Được
coi là vi khuẩn lớn nhất hành tinh (thường có đường kính 0,1-0,3mm). Người ta
phát hiện ra bên trong tế bào vi khuẩn chứa rất nhiều hạt lưu huỳnh dự trữmàu
trắng, nhận thấy mặt có ích, có hại của chủng vi khuẩn này, nhiều nhà khoa học
đã tiến hành nghiên cứu và tìm tòi ra các phát hiện mới mẻ. [45]

Trònh Thj Thanh Lam

Page 17


Theo kết quả nghiên cứu nguồn lợi vi sinh vật biển ở Việt Nam trải qua ba
giai đoạn phát triển (trước năm 1954, từ năm 1954-1975 và từ năm 1976 đến
nay), công tác điều tra, nghiên cứu biển Việt Nam đã không ngừng gặt hái được