ư

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI
KHUẨN CHUYỂN HÓA NITƠ, ỨNG DỤNG SẢN
XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH DÙNG XỬ LÝ CHẤT
THẢI CHĂN NUÔI

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. PHẠM HUỲNH NINH
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1151110352

:

LÊ ANH THY
Lớp: 11DSH04

TP. Hồ Chí Minh, năm 2015


Đồ án tốt nghiệp

cùng với sự quan tâm chỉ bảo giúp đỡ nhiệt tình của Ban lãnh đạo, các cô chú, anh
chị tại ở Phòng thí nghiệm và phân tích chăn nuôi, Phân viện chăn nuôi Nam Bộ. Ở
trường tôi đã nhận được sự giúp đỡ dìu dắt của quý Thầy Cô Bộ môn. Thầy Cô đã
mang đến cho tôi hành trang để bước vào cuộc sống.
Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành, cùng lòng biết ơn sâu sắc đến
TS. Phạm Huỳnh Ninh- Phó Bộ môn dinh dưỡng thức ăn chăn nuôi và chị Lê
Hoàng Bảo Vi, người trực tiếp hướng dẫn tôi hoàn thành bài báo cáo này.
Kính mong nhận được ý kiến đóng góp của quý Thầy Cô.
Chân thành cảm ơn.


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... iv
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. vi
GIỚI

THIỆU

........................................................................................................................ 1

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................3
1.1.

Chu trình nitơ ..................................................................................................3

1.2.

Quá trình nitrate hóa .......................................................................................7


Đặc điểm hình thái .................................................................................12

1.5.

Ứng dụng của vi khuẩn nitrate hóa ..............................................................13

1.5.1.

Trong thủy sản .......................................................................................13

1.5.2.

Trong chăn nuôi .....................................................................................14

CHƯƠNG

2.VẬT
.................................17

LIỆU

THÍ

NGHIỆM

VÀ

PHƯƠNG


2.4.2.

Trang thiết bị thí nghệm ........................................................................17

2.4.3.

Hóa chất và môi trường thí nghiệm.......................................................18

2.5.

Phương pháp .................................................................................................21

2.5.1.

Cách lấy mẫu..........................................................................................21

2.5.2.

Phương pháp phân lập ...........................................................................22

2.5.3.

Phương pháp định danh .........................................................................22

2.5.4.

Phương pháp đo độ đục (OD)................................................................23

2.5.5.


Kết quả phân lập, định danh .........................................................................32

3.2.1.

Phân lập vi khuẩn Nitrosomonas ...........................................................32

3.2.2.

Phân lập vi khuẩn Nitrobacter...............................................................33

3.2.3.

Định danh ...............................................................................................35

ii


Đồ án tốt nghiệp

3.3.

Kết quả định lượng nitrite, nitrate ................................................................38

3.3.1.

Hàm lượng NO2– sinh ra của các chủng vi khuẩn Nitrosomonas .........38

3.3.2.

Hàm lượng NO3– sinh ra của các chủng vi khuẩn Nitrobacter.............40

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ......................................................................56
4.1.

Kết luận .........................................................................................................56

4.2.

Đề nghị..........................................................................................................56

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................57
PHỤ LỤC............ ................................................................................................................1

3


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH
Hình 1. 1. Vi khuẩn Nitrosomonas europea khi quan sát dưới kính hiển vi quan
học (a) và (b) kính hiển vi điện tử..........................................................11
Hình 1. 2. Vi khẩn Nitrosomonas............................................................................11
Hình 1. 3. Tế bào vi khuẩn Nitrobacter winogradski quan sát dưới kính hiển vi
quang học (a) và (b) kính hiển vi điện tử
...............................................13
Hình 2.1.

Nơi lấy mẫu ............................................................................................21

Hình 3.1.


Biểu đồ cột thể hiện hàm lượng NO2– (mg/l) sinh ra của các chủng vi
khuẩn Nitrosomonas...............................................................................39

Hình 3.8.

Biểu đồ cột thể hiện hàm lượng NO3– (mg/l) sinh ra của các chủng vi
khuẩn Nitrobacter. ..................................................................................40

4


Hình 3.9.

Biểu đồ cột kết quả khảo sát pH thích hợp cho chủng Nitrosomonas
S18.. ........................................................................................................42

Hình 3.10. Biểu đồ cột kết quả khảo sát pH thích hợp cho chủng Nitrobacter B6.43
Hình 3.11. Biểu đồ cột kết quả khảo sát nồng độ muối thích hợp cho chủng
Nitrosomonas S18 ..................................................................................44
Hình 3.12. Biểu đồ cột kết quả khảo sát nồng độ muối thích hợp cho chủng
Nitrobacter B6 ........................................................................................46
Hình 3.13. Biểu đồ cột kết quả khảo sát nhiệt độ thích hợp cho chủng
Nitrosomonas S18. .................................................................................47
Hình 3.14. Biểu đồ cột kết quả khảo sát nhiệt độ thích hợp cho chủng Nitrobacter
B6. ...........................................................................................................48
Hình 3.15. Biểu đổ khảo sát động học quá trình lên men của chủng Nitrosomonas
S18. .........................................................................................................49
Hình 3.16. Biểu đổ khảo sát động học quá trình lên men của chủng Nitrobacter
B6.. ..........................................................................................................50
Hình 3.17. Biểu đồ khảo sát nồng độ cơ chất thích hợp cho chủng Nitrosomonas


Bảng 3.2.

Kết quả hàm lượng NO2– của các chủng vi khuẩn Nitrosomonas .........38

Bảng 3.3.

Kết quả hàm lượng NO3– (mg/l) của các chủng vi khuẩn Nitrobacter .40

Bảng 3.4.

Kết quả khảo sát pH thích hợp cho chủng Nitrosomonas S18 ..............41

Bảng 3.5.

Kết quả khảo sát pH thích hợp cho chủng Nitrobacter B6 ...................42

Bảng 3.6.

Kết quả khảo sát nồng độ muối thích hợp cho chủng Nitrosomonas
S18....................... ...................................................................................44

Bảng 3.7.

Kết quả khảo sát nồng độ muối thích hợp cho chủng Nitrobacter B6 ..45

Bảng 3.8.

Kết quả khảo sát nhiệt độ thích hợp cho chủng Nitrosomonas S18 ......47


này thành sản phẩm cuối cùng là nước và CO2, chuyển hóa nitơ dạng hữu cơ và vô
cơ thành dạng khí. Quá trình loại bỏ nitơ trong chất thải diễn ra chủ yếu bởi các quá
trình như ammonia hóa, nitrate hóa và phản nitrate hóa. Quá trình khoáng hóa nitơ
trong chất hữu cơ dẫn đến tích lũy NH4+, hình thành khí độc nếu không có quá trình
nitrate hóa tiếp theo bởi Nitrosomonas, để chuyển hóa NH4+ thành NO2–. Tiếp đó,
NO2– được chuyển hóa thành NO3 – nhờ Nitrobacter. Nitrate (NO3–) có thể được các
vi sinh vật khác (nấm men, Lactobacillus) sử dụng như nguồn dinh dưỡng hay được
chuyển thành nitơ phân tử phát tán vào trong không khí nhờ tác dụng của các vi
khuẩn phản nitrate hóa, yếm khí như Pseudomonas. Hiện tại các sản phẩm vi sinh

Trang 1


dùng trong đệm lót sinh học chủ yếu được nhập khẩu, chỉ duy nhất một sản phẩm
được sản xuất trong nước là chế phẩm Balasa No1. Nhằm đa dạng hóa sản phẩm
dùng trong đệm lót vi sinh, góp phần hạn chế phụ thuộc vào sản phẩm nhập ngoại,
cần thiết phải tiến hành phân lập, khảo sát, tìm ra các chủng vi sinh có hoạt lực cao
trong phân giải, chuyển hóa các hợp chất hữu cơ, đặc biệt là vi khuẩn chuyển hóa
nitơ.
Từ những nhận định trên, tôi thực hiện đề tài “PHÂN LẬP VÀ TUYỂN
CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CHUYỂN HÓA NITƠ, ỨNG DỤNG SẢN
XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH DÙNG XỬ LÝ CHẤT THẢI CHĂN NUÔI”.
Đề tài luận văn này là 1 phần trong đề tài nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi
sinh dùng trong đệm lót sinh học cho chăn nuôi của TS. Phạm Huỳnh Ninh, Phân
viện chăn nuôi Nam Bộ.
❖ Mục tiêu và phạm vi của đề tài
Phân lập, định danh các chủng vi khuẩn chuyển hóa nitơ (tập trung vào nhóm
vi khuẩn Nitrosomonas và Nitrobacter) từ phân, bùn đất, nước thải chăn nuôi heo,
chế phẩm Balasa No1.
Khảo sát các điều kiện sinh trưởng của các chủng vi khuẩn vừa phân lập

để tổng hợp thành protein động vật. Xác động thực vật và chất bài tiết chứa nitơ
được vi sinh vật phân hủy trở lại thành nitơ vô cơ, một phần được thực vật hấp thu,
phần còn lại qua tác dụng của vi khuẩn phản nitrate hóa biến thành khí nitơ trở về
khí quyển.
Vi sinh vật dị dưỡng (heterotrophs) cũng có thể tiến hành nitrate hóa, một số
vi sinh vật dị dưỡng còn có thể kết hợp quá trình nitrate hóa với quá trình phản
nitrate hóa kỵ khí, đó là quá trình oxy hóa NH4+ trong điều kiện mức oxy thấp và
tạo ra N2O và N2. Trong điều kiện thiếu oxy việc tồn tại quá trình oxy hóa ion
ammon cho thấy quá trình nitrate hóa không chỉ là quá trình hiếu khí.
Nitrate hóa là một quá trình hiếu khí, oxy hóa ion ammon (NH4+) thành
nitrite (NO2–), rồi sau đó oxy hóa thành nitrate (NO3–). Chẳng hạn, vi khuẩn thuộc


các chi Nitrosomonas và Nitrosococcus đóng vai trò quan trong trong giai đoạn
trước, còn vi khuẩn thuộc chi Nitrobacter và các vi khuẩn dị dưỡng hóa năng tương
ứng sẽ thực hiện giai đoạn sau. Gần đây người ta phát hiện thấy vi khuẩn
Nitrosomonas eutropha trong phản ứng phản nitrate hóa tương quan, sẽ dùng
NO2 làm chất oxy hóa, trong điều kiện kỵ khí oxy hóa ion ammon thành nitrite và
NO. Ngoài ra, quá trình nitrate hóa dị dưỡng (heterotrophic nitrification) thực hiện
bởi vi khuẩn và nấm đóng vai trò quan trọng trong những môi trường acid.
Quá trình phản nitrate hóa (denitrification) đòi hỏi một loạt các điều kiện môi
trường khác nhau. Đó là một quá trình dị hóa, thông thường do các vi khuẩn dị
dưỡng như Pseudomonas denitrificans thực hiện. Trong quá trình này nitrate sẽ là
chất oxy hóa trong điều kiện hô hấp kỵ khí, tuy vẫn có thể tích lũy nitrite, nhưng
sản phẩm chủ yếu của quá trình phản nitrate hóa là N2 và N2O. Nitrite rất hệ trọng
đối với môi trường vì chúng có thể tạo ra các nhân tố gây ung thư (carcinogenic)
thuộc loại nitrosamin. Sau nữa là nitrite có thể bị chuyển hóa thành ammon do tác
dụng khử dị hóa của nhiều loài vi khuẩn khác nhau, bao gồm các vi khuẩn
Geobacter metallireducens, Desulfovibrio spp., và Clostridium.
Quá trình đồng hóa nitơ là việc sử dụng nitơ vô cơ làm chất dinh dưỡng và

Trên lục địa: phản nitrate hóa - 0,12/năm; xác hữu cơ - 300; ammon do phân
giải chất hữu cơ chuyển vào khí quyển - 0,075/năm; cố định sinh học - 0,14/năm;
cố định công nghiệp - 0,036/năm; cố định do tia chớp - 0,004/năm; nitơ theo sông
ra biển: NO3– - 0,008/năm, NH4+ - 0,005/năm.
Trong đại dương: cố định sinh học - 0,10/năm; cố định do tia chớp 0,004/năm; xác hữu cơ – 550; chất vô cơ tạo thành do ammon hóa và nitrate hóa 577; phản nitrate hóa - 0,09/năm; trầm tích: 0,00025NH4+/năm; 0,002
N/năm.
Quá trình chuyển hóa nitơ hữu cơ thành muối ammon được gọi là quá trình
ammon hóa (ammonification). Dưới tác dụng của vi sinh vật protein, các base nitơ
sẽ bị thủy phân tạo thành amino acid. Sau đó tiếp tục phân hủy tới NH3.


NH3 giải phóng ra lại có thể bị vi sinh vật sử dụng. Việc tiến hành tái đồng
hóa ammon (cố định sinh học) và ammon hóa (khoáng hóa) có liên quan đến tỷ lệ
C/N trong môi trường. Thông thường lúc NH3 bị hạn chế thì quá trình cố định sinh
học là chính, trong điều kiện ngược lại thì quá trình khoáng hóa lại là chủ yếu. Nếu
tỷ lệ C/N bằng khoảng 20 thì quá trình cố định sinh học và quá trình khoáng hóa đạt
tới tỷ lệ lý luận bình quân.Trong sản xuất nông nghiệp khi bón phân tạo ra tỷ lên
C/N nhỏ hơn 20 thì quá trình khoáng hóa vượt quá quá trình cố định sinh học.
Ngược lại, nếu tỷ lệ C/N cao hơn 20 thì quá trình cố định sinh học vượt quá quá
trình khoáng hóa.
Quá trình khử nitrate bao gồm khử nitrate đồng hóa và khử nitrate dị hóa.
Khử nitrate đồng hóa:
Khử nitrate đồng hóa là quá trình sinh học, sau khi nitrate được tế bào hấp
thụ, sẽ khử hình thành amon kết hợp vào vật chất tế bào. Nhiều vi khuẩn, nấm và
tảo có khả năng khử nitrate đồng hóa. Mục đích của quá trình này là sử dụng
ammon trong nitrate, mà không phải là chất nhận electron, cho nên hệ enzyme khử
nitrate đồng hóa (gồm enzyme khử nitrate đồng hóa và enzyme khử nitrite đồng
hóa) không bị ức chế bởi oxy khí quyển.
Khử nitrate dị hóa:
Khử nitrate dị hóa là quá trình sinh học sau khi nitrate được tế bào hấp thụ,

qua hoạt động của các vi khuẩn yếm khí như Pseudomonas. Quá trình này gồm 2
giai đoạn được thực hiện bởi 2 nhóm vi khuẩn nối tiếp nhau:
Giai đoạn nitrite hóa: chuyển hóa NH4+ thành nitrite (NO2–) bởi nhóm vi
khuẩn nitrite hóa.
Giai đoạn nitrate hóa: chuyển hóa NO2– thành nitrate (NO3–) bởi nhóm vi
khuẩn nitrate hóa.
Các quá trình chuyển hóa NH3 đều cần có sự tham gia của oxy và độ kiềm
của nước
NH4+ +
O2 +

1
2

3
2

O2  NO2– + 2H+ + H2O

NO2–  NO3–


Hai nhóm vi khuẩn này có mối quan hệ mật thiết với nhau. Chúng phân bố
rộng rãi trong tự nhiên: môi trường đất, nước. Môi trường thích hợp cho cả 2 loài là
có pH>6.
Vi khuẩn tham gia mạnh nhất trong quá trình nitrite hóa là vi khuẩn tự dưỡng
hóa năng vô cơ và là loài hiếu khí bắt buộc. Khi chúng chuyển hóa ammonium
thành nitrite sử dụng cho hoạt động sống của mình.
Bảng 1. 1. Đặc điểm của một số vi khuẩn điển hình thuộc nhóm nitrite hóa
Loài vi

Đất, nước
ngọt, biển

Nitrosococcus
oceanus
Nitrosococcus
nitrosus
Nitrosococcus
mobillis
Nitrosospria
briensis

0,8 – 2,2 
Hình cầu

Phân đôi

1,8 – 2,2 
Hình cầu

Phân đôi

1,8 – 2,2 
Hình cầu

Phân đôi

1,5 – 2,7 
Hình xoắn
0,3 – 0,4 

20 - 30ºC

Đất

pH = 7 - 8

Trong tự nhiên vi khuẩn nitrite hóa rất nhiều: Nitrosococcuseanus,
Nitrosococcus halophila (thuộc phân lớp � – proteobacteria), Nitrosomonas sp. và
Nitrosopira sp. (thuộc lớp � - proteobacteria), Nitrosocystis, Nitrosolobus. Tất cả
các vi sinh này đều giống nhau về mặt sinh lý, sinh hóa nhưng khác nhau về đặc


điểm hình thái và cấu trúc tế bào. Tất cả đều thuộc loại tự dưỡng bắt buộc. Nhưng
chỉ có Nitrosomonas được ứng dụng nhiều nhất trong giai đoạn nitrite hóa.
Sau quá trình nitrite hoá thì amonium được chuyển hóa thành nitrite, các vi
khuẩn thuộc nhóm nitrate hóa sẽ thực hiện giai đoạn tiếp theo, chuyển hóa nitrite
thành nitrate. Các vi khuẩn này là vi khuẩn tự dưỡng hóa năng vô cơ, vi khuẩn
nitrate hóa thường gặp (gồm có 3 chi khác nhau): Nitrobacter vinogradskii,
Nitrobacter agilis (thuộc phân lớp � - Proteobacteria) là những trực khuẩn thẳng,
mảnh, đôi khi có dạng hình cầu, không di động và tạo thành những tập đoàn khuẩn
keo. Nitrospina gracili, Nitrococcus mobilis (thuộc phân lớp � - proteobacteria) tế
bào dạng cầu, có tiên mao. Chi Nitrobacter được ứng dụng nhiều nhất.
Bảng 1. 2. Đặc điểm của một số vi khuẩn điển hình thuộc nhóm vi
khuẩn nitrate hóa (Bergey, 1994)
Loài vi khuẩn

Đặc điểm tế bào

Hình thức
sinh sản

1,5 – 1,7 

20 - 30ºC

Biển

pH = 7 - 8

Đơn mao
Nitrospira sp.

Hình xoắn

Phân đôi

0,6 – 0,8 x 1,2 – 2 

20 - 30ºC

Biển

pH = 6,5 - 8

Ngoài Nitrosomonas và Nitrobacter được nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất
thì còn có một số loài cũng có khả năng nitrate hóa: Alcaligenes, Anthrobacter,
Corynebacterium, Achromobacter, Pseudomonas...[4].


1.3.


Đặc điểm hình thái

Nitrosomonas là vi khuẩn Gram âm, không sinh nội bào tử, tế bào nhỏ bé
hình cầu hay ovan, di động hoặc không di động, một số loài di động bằng tiên mao
ở đầu cực, đứng riêng lẻ, thành đội hay thành chuỗi. Chúng phân bố rộng rãi trong
nước, đất. Nitrosomonas là vi khuẩn kị ánh sáng, thường kết thành khối gọi là tập
đoàn khuẩn keo.

Hình 1. 2. Vi khuẩn Nitrosomonas
Biên độ nhiệt từ 5 - 30ºC, thích hợp trong khoảng 5 - 30ºC. Có thể chịu đựng
pH từ 5,8 – 8,5.


1.3.4.

Cấu trúc tế bào

Những loài ở biển được bao bọc thêm một lớp protein ở ngoài, màng tế bào
chất bên trong. Lượng G+C chứa trong DNA vào khoảng 47,5 – 51%. Chỉ có một
số loài có thể sử dụng được ure như nguồn ammonium. Là loài dinh dưỡng hóa
năng vô cơ bắt buộc, oxy hóa NH4+ thành NO2 –, dùng quá trình cố định CO2 để đáp
ứng nhu cầu về năng lượng và nguồn cacbon vô cơ. Hợp chất cacbon có thể đồng
hóa ở một giới hạn và có thể gây kích thích cho tế bào tự dưỡng phát triển.
1.4.

Vi khuẩn Nitrobacter
Vi khuẩn Nitrobacter là loại vi khuẩn oxy hóa nitrite. Chúng đóng vai trò

quan trọng trong quá trình chuyển hóa nitrite thành nitrate trong điều kiện hiếu khí.
1.4.1.

Hình 1. 3. Tế bào vi khuẩn Nitrobacter winogradski quan sát dưới
kính hiển vi quang học (a) và (b) kính hiển vi điện tử
1.5.

Ứng dụng của vi khuẩn nitrate hóa
1.5.1.

Trong thủy sản

Hiện nay vi khuẩn nitrate hóa được sử dụng rộng rãi trong xử lý nước (nước
thải công nghiệp, nước thải sinh hoạt và nước thải từ nuôi trồng thủy sản). Trong
nuôi trồng thủy sản, nhóm vi khuẩn nitrate hóa được sử dụng rất phổ biến trong
lãnh vực sản xuất giống thủy sản và nuôi thủy sản thâm canh. Quy trình sản xuất
được thực hiện thông qua hệ thống lọc sinh học tuần hoàn, nước thải từ các bể ương
nuôi tôm cá chứa hàm lượng NH3 (do tôm cá bài tiết ra) được đưa vào bể lọc sinh
học để xử lý. Trong bể lọc sinh học, vi khuẩn Nitrosomonas sẽ chuyển hóa
NH4+ thành NO2– (giai đoạn nitrite hóa), kế đến vi khuẩn Nitrobacter chuyển hóa
NO2– thành NO3–(giai đoạn nitrate hóa). Nước sau khi xử lý qua bể lọc sinh học
hoàn toàn không độc cho tôm cá và được được tái sử dụng để ương nuôi tôm cá


(đưa trở lại bể ương nuôi). Trong suốt quá trình nuôi, nước sẽ tuần hoàn trong một
hệ thống kín và hoàn toàn không thay nước, chỉ có một lượng nhỏ nước mới được
cấp thêm vào hệ thống để bù đắp cho lượng nước hao hụt do bốc hơi. Hiện nay, các

nước phát triển đã ứng dụng rất thành công quy trình lọc sinh học tuần hoàn
trong sản xuất thâm canh cá trê phi, cá chình, cá hồi và cá bơn và cả cá rô phi. Ở
Việt Nam, quy trình lọc sinh học tuần hoàn được áp dụng phổ biến trong các trại
sản xuất giống tôm càng xanh và tôm sú, đặc biệt là các trại giống ở vùng Đồng
Bằng Sông Cửu Long. Quy trình sản xuất dựa hoàn toàn vào nhóm vi sinh vật tự