TRẦN QUỐC VIỆT - Phân lập , tuyển chọn và đánh giá ….

1

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC ĐẶC TÍNH PROBIOTIC CỦA
MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT HỮU ÍCH ĐỂ SẢN XUẤT CÁC CHẾ PHẨM
PROBIOTIC DÙNG TRONG CHĂN NUÔI
Trần Quốc Việt
1
, Bùi Thị Thu Huyền
1
, Dương Văn Hợp
2
và Vũ Thµnh L©m
2

1
Viện Chăn nuôi - Thụy Phượng - Từ Liêm - Hà Nội
2
Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia - Hà Nội.
*Tác giả liên hệ: Trần Quốc Việt - Bộ môn Dinh Dưỡng, Thức ăn và Đ
ồng cỏ
Viện Chăn nuôi - Thụy Phương - Từ Liêm - Hà Nội
Tel: (04) 38.386.126 / 0982.011.584; Fax: (04) 38.389.775; Email: [email protected]
ABSTRACT
Isolation, selection and evaluation of probiotic characteristics of some kinds of useful microorganism
for probiotic producton
Sixty four strains of microorganism were isolated from the intestinal content of pigs, chickens and from
commercial probiotics. Amongs them, 4 strains including two strains of lactic bacteria and two strains of yeast
were selected for futher investigation of their characteristics. Based on metabolic characteristics and taxonomic

(iv) có khả năng sản sinh các bacteriocin và hoặc enzyme tiêu hóa; (v) có khả năng làm tăng
đáp ứng miễn dịch.
Vì những đặc điểm này mà việc phân lập, tuyển chọn các vi sinh vật probiotic trở nên rất khó
khăn, phức tạp. Hầu như rất hiếm có những chủng VSV hội đủ các điều kiện trên. Bởi vậy, để

VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 16-Tháng 2-2009 2

có chất lượng cao, sản phẩm probiotic thường gồm nhiều loại VSV thuộc các loài khác nhau
(Multispecies Probiotic) (Timmerman và cs, 2006). Nghiên cứu này được tiến hành nhằm
phân lập, đánh giá, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có các đặc tính probiotic phục vụ cho
việc sản xuất các chế phẩm Probiotic dùng trong chăn nuôi.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu
Các vật liệu phục vụ cho việc phân lập tuyển chọn các vi sinh vật probiotic: Phân, chất chứa
đường tiêu hoá (ruột non, manh tràng) của lợn và gia cầm (gà, ngan, vịt). Một số sản phẩm
probiotic thương mại (Lacto-Sac của hãng Alltech-Canada; EM của Nhật; E-Lac của Hàn
quốc…vv).
Các vi sinh vật kiểm định (Salmonella enteritidis, E. coli và Shigella flexneri); các vi sinh vật
probiotic đã được phân lập, tuyển chọn và đánh giá đặc tính probiotic
1
được bảo quản tại bảo
tàng giống chuẩn vi sinh vật thuộc Viện Vi Sinh Vật và Công nghệ sinh học-Đại học Quốc gia
Hà nội.
Các hóa chất: dùng để tách ADN và phân giải trình tự: EDTA, Tris- SDS, chlorofom-isoamyl
alcohol, dNTP, Taq polymeraza, Ethidium Bromit, kit QIAgen vv.
Các vật liệu khác: Giá đỗ, đường gluco, K
2

Ngoài ra, các chủng nấm men còn được thử phản ứng DBB và hoạt tính Ureaza. Việc phân
loại các chủng vi khuẩn được thực hiện dựa trên cơ sở khoá phân loại của Bergeys (Holt và
cs, 2000) (theo các chỉ tiêu chủ yếu như: hình thái tế bào, khuẩn lạc, nhuộm Gram, phản ứng
catalaza và lên men một số loại đường) và phân tích, giải trình tự 16S rARN theo phương
pháp được giới thiệu bởi Lane (1991).
Xác định trình tự rADN 16s của các chủng vi khuẩn lactic theo phương pháp của Saito và
Miura (1963) và trình tự rADN ITS1, ITS4 của các chủng nấm men theo phương pháp của
Manitis và cs (1982).
Đánh giá một số đặc tính probiotic của các chủng VSV hữu ích
Đánh giá khả năng chịu nhiệt: Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trên môi trường MRS

TRẦN QUỐC VIỆT - Phân lập , tuyển chọn và đánh giá ….

3

dịch thể (VK Lactic) và môi trường YM (nấm men) (pH =7.0), trong các máy lắc ổn nhiệt
(200 vòng/phút) với các giải nhiệt độ khác nhau 30; 37; 45; 55
o
C.
Đánh giá khả năng sinh trưởng trong môi trường có độ pH khác nhau
Tương tự như trên, các chủng vi khuẩn và nấm men cũng được nuôi cấy trên môi trường dịch
thể trong đệm acetat có pH khác nhau (2,2; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0), trên máy lắc ổn nhiệt (200
vòng/ phút tại 37
o
C cho vi khuẩn Lactic và 30
o
C cho nấm men).
Đánh giá khả năng sinh trưởng trong môi trường có nồng độ muối mật khác nhau
Các chủng nghiên cứu cũng được nuôi cấy trên môi trường dịch thể như trên có nồng độ muối
mật (0,2; 0,5; 1;1,5; 2; 3%). Nuôi cấy lắc (200 vòng/phút tại 37

ấm (37
o
C). Đếm mật độ tế bào trên môi trường đĩa thạch sau 48h.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Phân lập, tuyển chọn, phân loại và định danh các chủng vi sinh vật hữu ích
Từ các nguồn khác nhau (chất chứa đường ruột của lợn, gà và các mẫu sản phẩm probiotic
thương mại), 64 chủng vi sinh vật đã được phân lập, trong đó có 27 chủng vi khuẩn lactic
(42,2%) và 39 chủng nấm men (57,8%) (Bảng 1).
Trong đó từ chất chứa đường ruột của lợn và gia cầm đã phân lập được 25 chủng vi khuẩn
lactic, 32 chủng nấm men. Từ một số chế phẩm probiotic hiện đang lưu hành trên thị trường,
đã phân lập được 2 chủng vi khuẩn lactic và 7 chủng nấm men.

VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 16-Tháng 2-2009 4

Bảng 1: Kết quả phân lập các vi sinh vật từ các nguồn khác nhau
Vi sinh vật Nguồn phân lập
VK Lactic Nấm men
Chất chứa ruột non và ruột già của lợn. 10 4
Chất chứa ruột non, ruột già của gà 15 28
Bốn (4) mẫu sản phẩm probiotic thương mại 2 7
Cổng 27 39
Tổng số 64
Kết quả phân lập các mẫu sản phẩm probiotic thương mại cho thấy, tất cả các sản phẩm này
đều là các sản phẩm probiotic đa chủng. Để làm cơ sở cho việc tuyển chọn, các chủng VSV
trên tiếp tục được thuần khiết trên môi trường đĩa thạch và chọn được 4 chủng (2 chủng VK
lactic và 2 chủng nấm men) để đánh giá các đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hóa quan trọng
làm cơ sở cho việc phân loại. Kết quả được trình bày ở Bảng 2 và 3.


TRẦN QUỐC VIỆT - Phân lập , tuyển chọn và đánh giá ….

5

1,2,3 phía, trong khi đó SB chỉ nảy chồi 1 phía. Cả 2 chủng đều có hình thái khuẩn lạc như
nhau (trắng sữa, tròn nhẵn bóng và có vòng đồng tâm) kết quả ở Bảng 3.
Nhìn chung, đặc điểm đồng hóa và lên men các nguồn carbohydrate của 2 chủng nấm men
tương tự nhau, cả hai đều có phản ứng âm tính với DBB và thuỷ phân urê. Căn cứ vào khoá
phân loại của Bergeys và các dữ liệu ở các bảng 2 và 3 thì chủng NC1 thuộc nhóm
Lactobacillus fermentum, chủng NC2 thuộc nhóm Lactobacillus casei, chủng SC thuộc
Saccharomyces cerevisiae và chủng SB thuộc nhóm Saccharomyces nhưng chưa rõ loài.
Bảng 3: Một số đặc tính hình thái và sinh lý sinh hoá của hai chủng nấm men SC và SB
STT Đặc điểm Chủng nấm men
SC SB
1 Hình dạng tế
bào
Hình trứng, elíp,

nảy chồi 1,2,3 phía
Hình trứng, elíp,

nảy chồi 1 phía
Trắng sữa tròn nhẵn bóng lồi
có vòng đồng tâm
Trắng sữa tròn nhẵn bóng lồi
có vòng đồng tâm

2


19 Phản ứng thuỷ
phân urê
- -
Tuy nhiên, để gọi tên chính xác, các chủng trên đã được giải trình tự ARN và ADN 16S. Các
kết quả định danh được trình bày như sau:
Trình tự rADN 16S của chủng NC1
>NC1
GCCAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAGAAGCGGGGGACAACATTT
GGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAGCGTTGTTCGCATGAACAACGCTTAAAAGATGGCTTCTC
GCTATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGA
TGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGGACTGAGACACGGCCCATACTCCTAC
GGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTG
AAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACACGTATGAGAGTAACTGTTCATA
CGTTGACGGTATTTAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGT

VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 16-Tháng 2-2009 6

GGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGAGAGTGCAGGCGGTTTTCTAAGTCTGATGTGAA
GCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGGAAACTGGATAACTTGAGTGCAGAAGAGGGTAGTGG
AACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAAATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTACC
TGGTCTGCAACTGACGCTGAGACTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTC
CATGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCAT
TAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCGAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCA
CAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTG
CGCCAACCCTAGAGATAGGGCGTTTCCTTCGGGAACGCAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCA
GCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTACTAGTTGCCAGCA
TTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAGAT

GGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGCGTAACCC
TTTTAGGGAGCGAGCCGTCTAAGGTGGGACAAATGATTAGGGG
Trình tự rADN 16S của chủng NC2 tương đồng với trình tự rADN 16S của Lactobacillus casei 99,7 % (
1483/1486 ). Trình tự ADN 26S của chủng SC.
>SC-I1
TTAAAGAAATTTAATAATTTTGAAAATGGATTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACTG
GGCAAGAAGACAAGAGATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTCTTGCTAGGCT
TGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAA
ACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCA
ATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAACAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAG
AATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATC
GATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTT
TGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAA
CATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGT
TTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTT
ACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAGAGCGTCT

TRẦN QUỐC VIỆT - Phân lập , tuyển chọn và đánh giá ….

7

AGGCGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGACTTAGCATATCA
ATAGCGAAGAAAGAAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACCGGGATTGCCTTAGTAA
CGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTG
GAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGA
ATCCCGTGTGGCGAGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATG
CAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCG
AGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAA
AAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCC
TTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATA

boulardii là những chủng VSV lành tính (không phải là những VSV gây bệnh), thường được
sử dụng như nguồn VSV Probiotic (Sanders và Klaenhammers, 2001).
Tuy nhiên, mỗi một chủng thuộc các nhóm này có các đặc tính probiotic mạnh yếu khác nhau.
Bởi vậy, trước khi được sử dụng, các chủng này cần được đánh giá các đặc tính probiotic. Kết
quả đánh giá được trình bày ở các Bảng 5; 6; 7; 8 và 9.
Kết quả ở Bảng 5 cho thấy, 2 chủng vi khuẩn lactic (NC1 và NC2) phát triển tốt ở phạm vi
nhiệt độ từ 30-37
o
C. Khi nuôi cấy ở nhiệt độ cao hơn (45 và 55
o
C) sinh khối và khả năng
sản sinh axit lactic giảm rõ rệt (từ 5 đến 8 x 10
7
ở 37
o
C xuống 2,8-5 x 10
6
cfu/ml ở 45
o
C và

VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 16-Tháng 2-2009 8

từ 2-4 x 10
3
cfu/ml ở 55
o


HA
(g/l)
CFU/ml

HA
(g/l)
CFU/ml

HA
(g/l)
NC1 4 x 10
7
2,68 8 x 10
7
3,08 2,8 x10
6

1,8 4 x 10
3
0,63
NC2 2,4 x10
7

2,34 5 x 10
7
2,58 5 x 10
6
1,1 2 x 10
3

C. Đối với các VSV probiotic, khả năng sống trong phạm vi nhiệt độ
rộng có ý nghĩa không nhiều khi chúng hiện diện trong đường tiêu hóa của vật nuôi, nhưng
lại rất quan trọng khi chúng tồn tại trong điều kiện bảo quản và trong trường hợp chế bién
thức ăn.
Bảng 6: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và khả năng sản
sinh axit lactic (g/l) của các chủng vi khuẩn Lactic và nấm men.
Chủng vi sinh vật pH môi trường
NC1 NC2 SC SB
CFU/ml

1x10
8
1x10
7
8x10
6
1x10
7
2
HA(g/l) 2,48 2,12 - -
CFU/ml

1,2x10
8
1,2x10
7
1x10
8
2,7x10
8

1,1x10
8
3,0x10
9
4x10
9
6
HA(g/l) 2,45 2,08 - -
CFU/ml

8,6x10
7
9,0x10
7
2,4x10
8
2,5x10
8
7
HA(g/l) 2,4 2,0 - -
HA: Hàm lượng axit lactic (g/l)
Một đặc tính rất quan trọng khác của các vi sinh vật probiotic là khả năng sống trong các môi
trường có độ pH khác nhau. Các kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy
đến mật độ và khả năng sản sinh axit lactic của các VSV probiotic được trình bày ở bảng 6.

TRẦN QUỐC VIỆT - Phân lập , tuyển chọn và đánh giá ….

9

Các số liệu ở bảng này cho thấy, đáp ứng về sinh trưởng của các chủng VK lactic và nấm men

7
1,1x10
8
1,3x10
8
2x10
8
2,2x10
8
1,8x10
8

2 NC2 1,3x10
7
61,3x10
8
1,1x10
8
1,3x 10
8
1,3x 10
8
9,0x10
7

3 SC 2,2 x 10
9
3,4 x 10
9
2,9 x10

1 NC1 6,28 x 10
9
1,5 x 10
8

2 NC2 2,4 x 10
9
1 x 10
8

3 SC 4,6 x 10
8
2,6 x 10
8

4 SB 3,8 x 10
9
4 x 10
8

5 E. coli 3 x 10
7
2,8 x 10
6

Kết quả Bảng 8 cho thấy, các chủng VK Lactic và nấm men đều bám dính tốt vào niêm mạc
ruột nhưng mức độ không giống nhau giữa hai nhóm. Các chủng nấm men tỏ ra có độ bám
dính cao hơn (từ 2,6 đến 4 x 10
8
) so với 2 chủng VK Lactic. Điều này rất dễ giải thích vì các

đặc tính probiotic như các VK Lactic và Bacillus, nhưng các chủng nấm men hữu ích tác động
có lợi đối với vật nuôi qua cơ chế sau: (i) kích hoạt một số enzyme thuộc nhóm disacharridase
(surcrase, lactase, maltase) làm tăng khả năng tiêu hoá đường đa (Buts và cs, 1986); (ii) trung
hòa một số loại độc tố của vi khuẩn (Castagliuolo và cs 1998); (iii) kết dính một số VK gây
bệnh có roi bám vào biểu mô ruột nhờ các thụ quan mannose và loại chúng ra ngoài theo
phân; và (iv) kích thích hệ miễn dịch, tăng sản xuất IgA (Czerucka và Rauspal, 2002).
Các kết quả nghiên cứu về tính tương thích.
Bảng 11. Khả năng sinh trưởng của các chủng VSV probiotic trong môi trường có chứa một
số thành phần có hoạt tính của khẩu phần.
Số lượng tế bào (CFU/ml) Thành phần
C3 Đ7 6H2 NC1 SB H4
Đối chứng 7,0 x 10
8
8 x 10
10
7,6 x 10
9
5,2 x 10
9
2,0 x 10
9
6 x 10
10

Kháng sinh
- BMD 4,3 x 10
3
2,5 x 10
6
3,9 x 10

2,0 x 10
10
- CTC 3,7 x 10
4

6 x 10
4
3,4 x 10
4
2,6 x 10
4
1,0 x 10
8

2,0 x 10
5
Muối khoáng
- CuSO
4
.5H
2
O 5,7 x 10
8

1 x 10
10
6,8 x 10
9
1,8 x 10
9


9,2 x 10
8

4 x10
9
1,8 x10
9

3,0 x 10
9

*Saigon Nox: Kháng sinh hỗn hợp của Bayer gồm Kitasamycin 50g/kg + Sulphamethazon 50g/kg.
Trong số các yếu tố ảnh hưởng đến sức sống và hoạt tính của các VSV probiotic thì sự tương
tác của chúng đối với các thành phần khẩu phần (chủ yếu là các thành phần có hoạt tính như
một số loại muối kim loại, các chất axit hóa và một số loại kháng sinh) có một ý nghĩa rất
quan trọng (Suita Cruce và Goulet, 2001). Kết quả được trình bày ở Bảng 11.

TRẦN QUỐC VIỆT - Phân lập , tuyển chọn và đánh giá ….

11

Qua Bảng 11 ta thấy, các chủng nấm men (SB) và VK Bacillus (H4) vẫn sinh trưởng và phát
triển bình thường trong môi trường hiện diện một số loại kháng sinh, các muối sulfat của đồng
và kẽm cũng như hỗn hợp một số loại axit hữu cơ với liều tương tự như liều khuyến cáo bổ
sung trong khẩu phần cho lợn và gà.
Trong số các VK Lactic, chủng 6H2 và NC1 sống tốt trong môi trường có BMD, Colistine,
CuSO
4
.5H

4
. 7H
2
O và hỗn hợp axit hữu cơ. Các chủng VK Lactic
có tính tương thích yếu hơn.
Đề nghị : Cho được sản xuất thử một số chế phẩm probiotic từ các chủng đã được lựa chọn và
đánh giá ở trên.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Buts, J.P., Bernasconi, P., Van Craynest. M.P., Maldague, P. and De Meyer. R, (1986). Response of human and
rats small intestinal mucosa to oral administration of Saccharomyces boulardii. Pediatr., Res 20 (2).
p. 251-256.
Castagliuolo I., Riegler M.F., Valenick L., Lamont J.T. and Pothoulakis C, (1999). Saccharomyces boulardii
protease inhibits the effects of clostridium difficile Toxins A and B in Human Colonic Mucosa. Infect.
Immun. 67: p. 302-307.
Czerucka D.and Rampal. P, (2002). Experimental effects of Saccharomyces boulardii on diarrheal pathogens.
Microbes and infection. 4. p.733-739.
Fuller R, (1989). Probiotics in man and animals. J Appl Bacteriol. 66: p. 365-378.
FAO/WHO, (2001). Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live
Lactic Acid Bacteria. Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and
Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria.
Argentina October.2001

VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 16-Tháng 2-2009 12

Holt, J.G (Ed) (2000): Bergeys manual of systemic bacteriology. Williams and Wilkins Baltimore, 2000.
Kozaki. M, Uchi mura.T and Okada.S, (1992). Erperimental Manual for Lactic Acid Bacteria. Tokyo, Japan
Asakurasyoten