1
VIN KHOA HC V CễNG NGH VIT NAM
VIN SINH THI V TI NGUYấN SINH VT NGUYN VN BC
Nghiên cứu Phân lập, phân loại, bảo quản
một số chủng nấm sợi có hoạt tính gelatinaza
v xenlulaza gặp trong môi trờng đất
khu vực vờn bách thảo - H Nội LUN VN THC S SINH HC
Chuyờn ngnh: Vi sinh vt hc
Mó s: 60 42 40 Ngi hng dn : TS. Li Vn Hũa
1.1. Vị trí của nấm trong sinh giới 3
1.2. Tính đa dạng của vi nấm 4
1.3. Vi nấm trong đất 5
1.4. Vai trò của vi nấm trong công nghiệp 7
1.5. Đặc tính đặc trng của vi nấm 8
1.6. Hệ thống phân loại vi nấm 9
1.6.1. Hệ thống phân loại của Robert Shaffer (1969) 9
1.6.2. Hệ thống của Ainsworth & Bisby (1995) 10
1.7. Những vấn đề chung về cơ chế sinh hoá và sự phá huỷ sinh học
do vi nấm gây nên 12
1.7.1. Đặc điểm phá huỷ sinh học do vi nấm 12
1.7.2. Các chất trao đổi chuyển hoá xâm thực của sợi nấm - các loại
enzym và các axít hữu cơ 13
1.8. Các phơng pháp bảo quản vi nấm 16
1.8.1. Nhóm phơng pháp tiếp tục duy trì sự phát triển 19
1.8.2. Nhóm phơng pháp làm khô 20
1.8.3. Nhóm phơng pháp làm đình chỉ trao đổi chất 22
1.9. Lựa chọn các phơng pháp bảo quản 25
1.10. Những nghiên cứu về phân loại và bảo quản vi nấm ở Việt Nam 26
Chơng 2: Đối tợng, vật liệu và phơng pháp nghiên cứu
28
2.1. Đối tợng nghiên cứu 28
2.2. Vật liệu nghiên cứu 28
2.2.1. Dụng cụ, thit b
28
2.2.2. Môi trờng nuôi cấy 29
2.2.3. Hoá chất và các cơ chất sinh học 29
2.3. Phơng pháp và kỹ thuật nghiên cứu 30
2.3.1. Phơng pháp lấy mẫu 30
2.3.2. Phơng pháp phân lập 30
chất sinh học (xenluloza, gelatin) để đa vào bảo quản
75
4.3. Bảo quản các chủng vi nấm có hoạt tính enzym đã đợc chọn bằng
hai phơng pháp: lạnh sâu (glyxerin 10% ở -200C) và trên silicagel.
76
4.4. Khả năng sinh enzym phân huỷ các cơ chắt sinh học của các
chủng nấm sợi phục hồi sau bảo quản 77
Chơng 5: Kết luận và kiến nghị
79
TàI LIệU THAM KHảO
81
S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
5
C¸c ch÷ viÕt t¾t
ATCC American Type Culture Colletion
CCRC Culture Collection Research Center
IMI International Mycological Institute
LS Lạnh sâu
SLC Silicagel
TBQ Trước bảo quản
SBQG Sau bảo quản glyxerin
SBQS Sau bảo quản Silicagel
DMSO Dimethyl sulfoxide
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
1
Đặt vấn đề
lập, phân loại, bảo quản một số chủng nấm sợi có hoạt tính gelatinaza và
xenlulaza gặp trong môi trờng đất khu vực Vờn Bỏch tho-H Ni.
S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
2
Mc tiờu ca chỳng tụi a ra l:
1. Phõn lp, phõn loi mt s chng nm si cú hot tớnh gelainaza v
xenlulaza gp trong mụi trng t khu vc Vn Bỏch tho-H Ni
2. Bảo quản các chủng vi nấm đã phân lập đợc bằng một số phơng pháp
bảo quản hiện nay
3. Góp phần xây dựng bộ su tập các chủng nấm sợi có hoạt tính enzym
phục vụ cho các nghiên cứu và vào bộ su tập giống của Bảo tàng giống chuẩn
Việt Nam.
Nội dung nghiên cứu
1. Phân lập các chủng nấm sợi từ môi trờng đất khu vực vờn Bách Thảo
2. Phân loại xác định đến chi, loài các chủng nấm sợi đã phân lập đợc.
3. Xác định hoạt tính enzym phân huỷ một số cơ chất sinh học nh
gelatin, xenluloza của các chủng nấm sợi đã phân lập và phân loại.
4. Bảo quản các loài nấm sợi có hoạt tính enzym cao bằng phơng pháp
silicagel và bảo quản trong glyxerin 10% ở nhiệt độ -20
0
C.
5. Phục hồi các chủng vi nấm đã bảo quản sau 18 tháng, kiểm tra độ
thuần khiết, độ sống sót, độ ổn định về hình thái và khả năng sinh enzym
phân huỷ cơ chất sinh học của chúng.
6. Xây dựng bộ su tập các chủng nấm sợi có hoạt tính enzym phục vụ
cho các nghiên cứu và góp phần vào bộ su tập giống của Bảo tàng giống
chuẩn Việt Nam.
thực vật có cơ thể dinh d
ỡng dạng cây có rễ, thân, lá.
- Sinh sản: Nấm sinh sản và phát tán bằng bào tử.
S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
4
Nhờ những thành tựu nghiên cứu v cấu trúc nhân, màng tế bào, ty thể,
cấu trúc phân tử ARN riboxom; thành phần sinh hoá; phơng thức dinh
dỡng thì gianh giới giữa động vật và thực vật bị mờ đi, mà rõ nét là gianh
giới giữa sinh vật không nhân và sinh vật có nhân.
Hiện nay, có nhiều quan điểm khác nhau về việc xếp các ngành nấm
vào các giới sinh vật. Theo hệ thống 5 giới của Whittaker (1978) thì các ngành
nấm đợc xếp vào 2 giới khác nhau: Các ngành nấm nhầy tế bào
(Acrasiomycota), nấm nhầy thật (Myxomycota), nấm trứng (Oomycota) và
nấm cổ (Chytridiomycota) đợc xếp vào giới Protoctista; các ngành nấm tiếp
hợp (Zygomycota), nấm túi (Ascomycota), nấm đảm (Basidiomycota), nấm bất
toàn (Deuteromycota) và địa y (Lichenomycota) đợc xếp vào giới nấm. Theo
Whittaker giới nấm chỉ gồm 2 ngành nấm tiếp hợp (Zygomycota) và ngành
nấm thật (Eumycota), trong dó ngành nấm thật bao gồm 4 phân ngành: nấm
túi (Ascomycotina), nấm đảm (Basidiomycotina), nấm bất toàn
(Deuteromycotina) và địa y ( Lichenes).
Ngoài ra còn có một số hệ thống khác nh hệ thống 6 giới của Lucile
Mc Cook (năm 2004), hệ thống 7 giới của Bryce Kendrick (2001).
1.2. Tính đa dạng của vi nấm
Vi nấm có khả năng phát triển ở hầu hết các dạng sinh thái, có thể sử
dụng hầu hết các sản phẩm tự nhiên và các sản phẩm do con ngời làm ra.
Chúng là sinh vật đầu tiên và lý tởng sinh trởng ở vùng hoang dã, vì chúng
có khả năng thay đổi để thích nghi với điều kiện sống. Ví dụ, các loài của chi
Aureobasidium có thể sinh trởng ở nơi nhiệt độ thấp (vùng Antarctica) trên
các hòn đá ở nhiệt độ từ -10
gồm cả địa y), động vật chân đốt, các động vật không xơng sống và có xơng
sống. Không khí, đất, nớc, phân, thức ăn, các sản phẩm thực vật, dầu khí và
mt s dợc phẩm cũng là nguồn phân lập c vi nấm.
1.3. Vi nấm trong đất
Vi nấm là thành phần nhiều nhất trong sinh khối của hệ vi sinh vật
trong đất, mặc dù số lợng của chúng trong các đĩa môi trờng pha loãng khi
phân lập thấp hơn vi khuẩn. Nm cú ý ngha rt quan trng trong i sng ca
con ngi, chỳng cú vai trũ thc tin trong nn kinh t, khoa hc v cỏc chu
trỡnh vt cht, nng lng trong t nhiờn. Vi nấm là vi sinh vật gây mục nát
chính trong đất, đặc biệt là đất rừng, chỳng phõn gii cỏc cht hu c, cỏc
cnh lỏ khụ ca thc vt thnh cht mựn, cht khoỏng. Nó tham gia phân huỷ
xenluloza, kitin và licnin trong lớp đất bề mặt, do ú l yu t quan trng lm
tng phỡ nhiờu ca t. Nấm đất bao gồm các loài thuộc lớp: Zygomycetes,
Ascomycetes, Deutermycetes, Basidiomycetes và một vài loài thuộc họ
Pythiaceae của lớp Oomycetes. Hầu hết chúng sống hoại sinh, một số sống ký
S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
6
sinh hoặc bán kí sinh trên rễ cây. Nhiều loài Basidiomycetes dạng sợi sống ở
trong đất rất khó phân lập bằng các kỹ thuật cơ bản. Chúng sống cộng sinh
đặc hiệu với cây rừng (nấm rễ - ectomycorrhizal), hoặc sống hoại sinh phân
huỷ gỗ, rác. Một số vi nấm có bào tử động thờng sống trong nớc có thể có
mặt trong đất, chúng đợc nghiên cứu bằng các kỹ thuật đặc biệt.
Nấm tồn tại trong đất ở dạng sợi, bào tử (vô tính hoặc hữu tính), bào tử
áo hoặc các thể hạch nấm. Chỉ có giai đoạn sợi mới có các hoạt động trao đổi
chất đáng kể, các giai đoạn sau là giai đoạn ngủ phục hồi cấu trúc, khi ú hoạt
động trao đổi chất ít và có tầm quan trọng hạn chế trong việc chuyển hoá đất.
Nấm sống trong đất hầu hết ở trạng thái ngủ. Để phân tích nấm đất cần có các
hiểu biết về sinh thái học để phân biệt giữa dạng sợi và trạng thái nghỉ của chúng.
Kỹ thuật phân lập nm trong đất bao gồm: Kỹ thuật không đặc hiệu và
Vi nm còn là nguồn nguyên liệu quan trọng để sản xuất hoá chất công
nghiệp: axớt xitric và axớt gluconic c sn xut từ A.niger, axớt itaconic từ
A.terreus. Sản phẩm rợu, bia sản xuất từ sự lên men của Saccharomyces là
một ngành công nghiệp lớn.
Đặc biệt là nấm có thể sinh ra các sản phẩm tự nhiên có ích cho sức
khoẻ của con ngời nh các chất kháng sinh, các chất chống ung th, các chất
ức chế miễn dịch để chống nhiễm trùng chữa u bớu và ngăn chăn sự đào thải
các mảnh ghép cho các bệnh nhân phải cấy ghép tng. Griseofulvin là chất
chống nấm đợc tạo từ P.griseofulvum, thuốc ức chế miễn dịch cyclosporin c
sn xut từ nấm Tolypocladium inflatum [27]. Kháng sinh cryptocandin có khả
năng kháng các nấm gây bệnh da ở ng
ời đợc lấy ra từ loài nấm nội sinh thực
vật (Endophyte) Cryptosporiopsis quercina phân lập từ cây Tripterigem
wilfordii, kháng sinh này còn có khả năng kháng 1 số nấm gây bệnh thực vật.
Axớt colletotric là sản phẩm trao đổi chất của loài Colletotrichum
gloeosporiloides, chất này có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm.
Paclitaxel và một số dẫn xuất của nó đại diện cho nhóm các chất chống
ung th do các nấm nội sinh thực vật sinh ra. Paclitaxel là sản phẩm trao đổi
S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
8
chất của loài Pestalotiopsis microspora nội sinh trờn cây thông Taxus
wallichiana v loài Taxomyces andreanae nội sinh trong cây thông Taxus
brevifolia. Paclitaxel là loại thuốc chống ung th đầu tiên đem lại nhiều lợi,
nó còn đợc dùng điều trị bệnh tăng sinh mô ở ngời.
Axớt torreyanic cũng là một chất chống ung th đợc lấy từ chủng
Pestalotiopsis microspora nội sinh ở cây thông Taxus taxifolia.
Trong nông nghiệp, những vi nấm gây bệnh cho côn trùng nh
Beauveria bassana & Metarhizium anisoliae đợc dùng nh những tác nhân
sinh học diệt côn trùng, còn nấm gỉ đợc sử dụng để trừ cỏ dại. Loài
trng của chủng vi nấm ó cho phộp phân loại chớnh xỏc các loài thuộc chi
Aspergillus, Beauveria, Fusarium, Penicillium, Rhizopus [27].
1.6. Hệ thống phân loại vi nấm
Hiện nay có nhiều hệ thống phân loại vi nấm của 1 số tác giả đã công
bố. Nhìn chung các hệ thống phân loại này khác nhau về quan điểm xếp các
đơn vị phân loại (taxon) ở bậc, ngành, lớp.
1.6.1. Hệ thống phân loại của Robert Shaffer (1969)
Giới nấm thật (Eumyceteae) gồm 3 ngành
Ngành nấm cổ ( Chytridiomycota):
Lớp Chytridiomycetes;
Ngành nấm tiếp hợp (Zygomycota):
Lớp Zygomycetes;
Ngành nấm song hạch (Dicaryomycota):
Lớp Ascomycetes;
Lớp Basidiomycetes.
Giới nấm thật (Eumyceteae) theo Robert Shaffer chỉ bao gồm các nấm
chính có vách tế bào bằng kitin, các nấm khác có vách tế bào bằng xenluloza
nh nấm nhầy, nấm trứng không đợc xếp vào giới nấm, chúng đợc xếp vào
giới ng vt nguyờn sinh (Protozoa) và gii Chromista (có nghĩa là màu sắc,
gồm một số nấm cú bo t ng và tảo).
S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
10
1.6.2. Hệ thống của Ainsworth & Bisby (1995)
Hệ thống phân loi ny dựa vào những đặc điểm về hình thái, sinh hoá
và cấu trúc phân tử để xếp các ngành nấm vào các giới khác nhau.
Tất cả những nấm mà từ trớc đến nay đợc xếp vào giới nấm
(Kingdom Fungi) thì hiện tại đợc xếp vào 3 giới khác nhau là:
- Giới ng vt nguyờn sinh (Protoza) gồm 4 ngành: chúng đợc gọi là
Protozoan Fungi.
nấm nhân kép, có vách ngăn, có mấu liên kết. Sinh sản hữu tính bằng đảm
(Basidia) với 2, 4 hoặc 8 bào tử đảm (Basidiospore). Khoảng 40% các loài
nấm thuộc ngành này.
+ Ngành nấm bất toàn Deuteromycota (Mitosporic Fungi)
Đặc điểm đặc trng là hệ sợi nấm có vách ngăn, sinh sản vô tính bằng bào tử
trần. Tuy vậy ngời ta phát hiện ở một số loài có sinh sản hữu tính
(Teleomorph) bằng bào tử túi hoặc bào tử đảm. Hiện nay các nhà nấm học cho
rằng nấm bất toàn là giai đoạn sinh sản vô tính của nấm túi, nấm đảm
[2],[4],[16],[21].
Theo hệ thống phân loại của Hughes (1953), căn cứ vào đặc điểm phát
sinh bào tử trần lớp nấm bất toàn đợc chia làm 3 nhóm:
Nhóm Hyphomycetes: gồm các nấm bất toàn không có túi giá và đĩa
giá. Giá sinh bào tử trần ở trên các sợi nấm hoặc các sợi nấm kết lại thành bó
sợi, bó giá (synema, corenia).
Nhóm Coelomycetes: gồm các nấm bất toàn có túi giá hoặc đĩa giá bào
tử trần hình thành trong các thể quả (Fruit - body) gọi là các conidiomata;
Nhóm Agonomycetes: gồm các nấm bất toàn không có bào tử trần [5],[21].
Phân loại vi nấm dựa vào các đặc điểm đặc trng về hình thái và cu
trỳc. Các đặc điểm đặc trng của các cơ quan sinh bào tử, thành tế bào, sự
phát sinh và kiểu tiên mao đợc dùng để phân loại các nhóm vi nấm chính.
Một số các đặc điểm khác nh các chi tiết về cấu trúc và sự phát triển của thể
quả, màu sắc, vách ngăn, bề mặt và kích thớc của bào tử là những đặc điểm
quan trọng để phân loại vi nấm đến bộ, họ, chi, loài.
S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
12
Hiện nay, nhiều nhóm vi nấm khác nhau đã đợc phân loại và có tên
trong danh mục của hệ thống phân loại. Chúng ta cần phân loại chính xác một
chủng khi s dng chủng loài đó để nghiên cứu hoặc sản xuất vì nếu phân loại
sai có thể dẫn tới những kết luận sai trong nghiên cứu và có thể bỏ phí những
nghèo dinh dỡng, nh các tác phẩm hội hoạ Các loài vi nấm ny phát triển
chậm hơn nhiều so với các loài khác, chỳng có khả năng sống ở những điều
kiện rất khắc nghiệt l do tiết ra các chất sinh học nh các enzym phân huỷ cơ
chất sinh học, các chất hữu cơ (axít hữu cơ, axít vô cơ ) để biến cơ chất môi
trờng thành thức ăn cho chúng. Vì vậy, chúng phá huỷ các cơ chất sinh học
và gây ra những thiệt hại không nhỏ.
Hệ vi nấm (chủng loài) ở 1 khu vực nào đó có thể không ổn dịnh do sự
thay đổi ca điều kiện môi trờng. Trên cựng một cơ chất nhng ở các nhiệt
độ khác nhau hoặc độ ẩm môi trờng cao hoặc thp hơn, thì một số loài vi
nấm sẽ bị chết, còn một số loài khác thì sẽ phát triển tốt hơn.
Vi nấm là một nhóm vi sinh vật rất hay biến dị và không ổn định. Một
trong những cơ chế của tính biến dị ở vi nấm là tính dị nhân. Tuỳ theo điều
kiện môi trờng, số nhân của loài này hay loài khác có thể thay đổi trong sợi
vi nấm để đảm bảo cho vi nấm thích nghi với các điều kiện mới xuất hiện.
Đặc tính đó của vi nấm có ý nghĩa rất quan trọng khi thiên nhiên và con ngời
không ngừng tạo ra các vật liệu mới và xuất hiện các sinh cảnh mới.
1.7.2. Các chất trao đổi chuyển hoá xâm thực của sợi nấm - các loại
enzym và các axít hữu cơ.
Trong số các vi sinh vật gây hại cho các loại vật liệu và sản phẩm thì vi
nấm chiếm vị trí số 1, vì hệ sợi nấm phát triển rất nhanh và hệ thống enzym
của chúng rất phong phú, rất mạnh và không ổn định khiến chúng có thể sử
dụng đợc nhiều loại nguyên liệu thiên nhiên cũng nh nguyên liệu nhân tạo.
Ngày nay, các nguyên liệu công nghiệp rt a dng v phong phỳ.
Nhng nguyên liệu ú u cú th
b phỏ hy do một nhóm vi nấm có đặc tính
sinh thái đặc biệt. Sự phá huỷ sinh học do các loại vi nấm gây ra cho các vật
S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
14
liệu và sản phẩm là sự phá huỷ cơ học do do các sợi nấm phát triển nhanh, do
chất khác. Trong loi enzym oxy hoá khử, peroxydaza và catalaza có sự khác
biệt về tính chất tác động. Đại diện của các chi nấm có hoạt tính peroxydaza
là các chi Penicillium, Aspergillus, Verticillium, Fusarium, Geotrichum. Các
catalaza làm tăng nhanh phản ứng phân huỷ peroxyt hydro thành nớc và oxy
phân tử. Một số loài vi nấm thuộc chi Penicillium có thể sinh catatlaza. Khi
nghiên cứu hoạt tính của catalaza, peroxydaza, polyphenoloxydaza và các
dehydrogenaza do các loài vi nấm Aspergillus niger, A. flavus,
P.chrysogenum, Paecilomyces varioti, Trichoderma viride, ngời ta đã xác
định đợc rằng A. niger và T. viride có tất cả các enzym nêu trên và có hoạt
tính mạnh.
Các enzym thuộc lớp hydrolaza có vị trí quan trọng trong việc huỷ hoại
sinh học các vật liệu công nghiệp, bởi vì nhiều enzym trong số này là những
enzym ngoại bào tham gia vào việc chuẩn bị sơ bộ để tách và biến đổi chất
nuôi dỡng.
Các enzym thuộc nhóm glycozidaza tham gia tích cực vào việc phá huỷ
các vật liệu công nghiệp chứa xenluloza, các hydrocacbon khác và các dẫn
xuất của chúng. Các vi nấm thuộc các chi Alternaria, Trichoderma,
Chaetomium, Aspergillus, Penicillium, Cladosporium là những chi thể hiện
rõ nhất khả năng tổng hợp các enzym xenlulaza. Các vi nấm có khả năng phát
triển và sinh enzym xenlulaza chỉ ở trong những giới hạn nhiệt độ nhất định,
thông thờng là ở nhiệt độ 28 - 30
0
C.
Các loài vi nm có khả năng sinh enzym proteinaza ngoại bào phân bố
rất rộng, có ở khắp mọi nơi; trong đất, nớc và ngay cả trong môi trờng
không khí tự nhiên, nên rất dễ dàng ô nhiễm lên các vật thể tồn tại ở đây.
Nhiu enzym ca vi nm ó c s dng rng rói trong cỏc ngnh
kinh t khỏc nhau nh trong ngnh cụng nghip thc phm v cụng nghip
dc phm. ở ngnh thc phm, cỏc loi Aspergillus niger, A. oryzae, c
s dng sn xut bia, ru, lm bỏnh m, nh cỏc enzym thy phõn tinh
định. Điều kiện nuôi cấy và kỹ thuật bảo quản phù hợp đợc sử dụng để đảm
S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
17
bảo sự ổn định của quần thể vi nấm trong nghiên cứu, ứng dụng là rất quan
trọng. Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học và kỹ thuật sinh học thì
việc giữ đợc tất cả các đặc điểm đặc trng của vi nấm trong quá trình bảo
quản là rất quan trọng. Rất nhiều loài nấm sợi mọc trên môi trờng nuôi cấy
có thể tồn tại đợc bằng cách cấy chuyển theo kỳ. Tuy nhiên những đặc điểm
của vi nấm trong nuôi cấy có thể không đợc ổn định do sự mất mát của các
plasmid, trải qua những sự đột biến liên tiếp hay sự tổ hợp của các gen do sự
có mặt của các thể dị nhân, và chu trình cận giới tính hay những hoạt động
giới tính bình thờng khác (Smith, 1986). Những sự kiện này đã dẫn đến sự
thay đổi trong đặc tính của các chủng. Vì thế các điều kiện bảo quản phải
đợc lựa chọn kỹ lỡng để làm giảm tối đa mức rủi ro của những thay đổi
trên. Cơ sở của các kỹ thuật bảo quản giống là: sự sinh trởng tiếp diễn, sự
giảm trao đổi chất và trao đổi chất gián đoạn. Trao đổi chất gián đoạn là kỹ
thuật mà cho phép giảm mức độ trao đổi chất đến mức tạm dừng hoặc gần nh
vậy (Smith và Onion, 1983).
Từ năm 1945, Raper và Alexander đã đa ra phơng pháp đông khô
(Freeze drying) để bảo quản các loài Penicillium. Buell & Weston (1947) đã
bảo quản vi nấm trong dầu khoáng. Castellani (1939, 1967) đã bảo quản vi
nấm trong nớc. Gordon (1952) Both (1953) đã bảo quản vi nấm trong đất.
Perkin (1962) đa ra phơng pháp bảo quản trên silicagel. Năm 1971, 1977,
Onions đã đa ra phơng pháp bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng
(Cryopreservation). Không có phơng pháp bảo quản nào là tốt cho tất cả các
loài vi nấm, mặc dù phơng pháp bảo quản trong nitơ lỏng là lý tởng nhất.
Các loài nấm sợi sinh nhiều bào tử thì bảo quản trên silicagel là tốt, các loài
có bảo tử màng mỏng, hàm lợng nớc cao thì bảo quản bằng phơng pháp
này độ sống sót kém. Các loài Oomycetes thuộc ngành phụ Mastigomycotina
và Onion, 1983).
Entomophthorales sẽ sống đ
ợc trong nitơ lỏng, trong dầu hoặc đất.
Nấm gỉ thờng không mọc đợc trong môi trờng nuôi cấy, nhng những bộ
su tập sống có thể đợc bảo quản tốt trong nitơ lỏng, mặc dù cũng có thể bảo
S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
19
quản chúng bằng cách khác nh lấy bào tử từ vật chủ nhiễm bệnh đem đông
khô. Có những chi nh Fusarium thờng thay đổi hay bị phá hủy rất nhanh
khi cấy chuyển thờng xuyên. Những vi nấm này nên giữ bằng cách cấy
chuyển hàng loạt, bảo quản trờn silicagel, bảo quản trong đất và nớc nếu nh
phòng thí nghiệm không có điều kiện làm đông khô hoặc nitơ lỏng [27].
Có nhiều phơng pháp đợc dùng để bảo quản các chủng nấm, ngời ta
chia ra thành 3 nhóm:
- Nhóm phơng pháp tiếp tục duy trì sự phát triển;
- Nhóm phơng pháp làm khô;
- Nhóm phơng pháp đình chỉ sự trao đổi chất.
1.8.1. Nhóm phơng pháp tiếp tục duy trì sự phát triển
Kỹ thuật tiếp tục duy trì sự phát triển bao gồm phơng pháp cấy chuyển
định kỳ (định kỳ cấy chuyển chủng nấm từ môi trờng đã hết chất dinh dỡng
tới môi trờng mới có nhiều chất dinh dỡng hơn) và phơng pháp làm giảm
nhu cầu của nấm về môi trờng nuôi cấy. Nhóm biện pháp này bao gồm cả
phơng pháp nuôi cấy trong môi trờng lạnh nhiệt độ từ -20
0
C đến -10
0
C dới
lớp dầu hoặc trong nớc. Cụ thể có 3 phơng pháp sau đây:
1.8.1.1. Phơng pháp cấy chuyển định kỳ
Có thể thực hiện với các loài Phytophthora và Pythium trong thời gian
2-3 năm trớc khi chủng nấm có biểu hiện mất bất kỳ tính chất nào. Những
chủng trên biểu hiện thoái hoá về khả năng gây bệnh nhng phần lớn vẫn có
thể gây nhiễm trên vật chủ tơng thích. Việc mất khả năng của chủng dần
xuất hiện sau 2 năm và 42% các chủng trên bị chết sau 5 năm bảo quản.
1.8.2. Nhóm phơng pháp làm khô
Nhóm phơng pháp này thờng áp dụng với trạng thái không hoạt động
(trạng thái nghỉ) của vi nm, nh bào tử hoặc thể cứng (hạch nấm, ), có thể
sử dụng làm khô tự nhiên trong không khí trong hay trên silicagel, trong đất
hoặc sử dụng phơng pháp đông khô.
1.8.2.1. Bảo quản trong silicagel
Silicagel l mt cht vụ c, bn, khụng c, cú cu trỳc rng, c
dựng lm cht hỳt m nh hin tng mao dn hng triu khoang rng li ti
ca nú. Nh nhng tớnh nng ú m ngi ta s dng Silicagel lm cht b
o
S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Copyright: Tài liệu đại học ©