BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
KHƯU PHƯƠNG YẾN ANH

Chuyên ngành : Vi sinh vật
Mã số : 60 42 40
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. TRẦN THANH THỦY
TS. VÕ THỊ HẠNH

Thành phố Hồ Chí Minh – 2007
LỜI CẢM ƠN

Enzym : Enzyme
EG : Endoglucanase
EGI : Endoglucanase I
EGII : Endoglucanase II
IU : Imeasure Unit (đơn vị hoạt độ)
KHV : Kính hiển vi
KL : Khuẩn lạc
MT : Môi trường
PTN : Phòng thí nghiệm
PGA : Potato glucose agar
RNM : Rừng ngập mặn
VSV : Vi sinh vật

MỞ ĐẦU1. Lí do chọn đề tài
Sự hiện hữu của rừng ngập mặn (RNM) Cần Giờ là kết quả của hơn 25
năm phục hồi và phát triển bằng các nổ lực to lớn của chính quyền và nhân
dân Thành phố Hồ Chí Minh. Vào ngày 21 tháng 1 năm 2000, Ủy ban MAB/
UNESCO đã công nhận RNM Cần Giờ là khu dự trữ sinh quyển đầu tiên tại
Việt Nam [55].
RNM Cần Giờ là nơi lưu trữ các nguồn gen sinh vật quí hiếm và bền
vững, có khả năng chịu đựng điều kiện sống rất đặc biệt khắc nghiệt. Là nơi
có hệ VSV vô cùng phong phú và đa dạng như nấm sợi, vi khuẩn, xạ
khuẩn…., trong đó nấm sợi chiếm số lượng rất lớn. Nấm sợi đóng vai trò rất
quan trọng trong vòng tuần hoàn vật chất và năng lượng của hệ sinh thái

RNM, nhờ có khả năng sinh các loại
enzym ngoại bào như cellulase, protease,

 Các công trình nghiên cứu nấm sợi sinh enzym cellulase
Khả năng sinh enzym cellul
ase chủ yếu được tổng hợp từ nấm sợi
Trichoderma và Aspergillus.
Ở Mỹ, năm 1983 PTN của Quân đội Mỹ ở Natik và trường đại học
Rutgers, sử dụng chủng Trichoderma viride QM6 hoang dại để sản xuất
cellulase đầu tiên. Sau đó, gây biến chủng và chọn lọc được biến chủng
QM9414 có khả năng sinh ra cellulase cao (theo Rehm
, 1983) [74].
Năm 1998, YU đã nuôi cấy T. reesei Rut 30 trong MT chứa 5% bột
cellulose và 1% cám mì, thu được hoạt lực CMCase 232,4 IU/g [68].
Năm 2000, Sonia Couri khảo sát khả năng sinh tổng hợp các enzym
như polygalacturonase, cellulase, xylanase và protease từ A. niger 3T5B8 trên
nguồn phụ phế liệu nông nghiệp khác nhau bằng phương pháp lên men bán
rắn và ứng dụng enzym trong việc tách chiết dầu thực vật [61].
Năm 2002, theo báo cáo gần đây của CORAL, dịch nuôi cấy A. niger
trong MT Czapek-Dox chứa CMC1%, cho chạy điện di trên gel SDS-PAGE
(chứa 0,2% CMC) phát hiện có hai vạch có hoạt tính CMCase và trọng lượng
phân tử lần lượt là 83.000 và 50.000 Dalton [67].
Ở Việt Nam, năm 1989, Lê Hồng Mai nghiên cứu về sinh tổng hợp và
một số đặc tính của cellulase (typ CMCase) ở A. niger VS-1 trên MT lên men
bán rắn [40].
Năm 2001, Huỳnh Anh nghiên cứu về nấm sợi T. reesei
sinh tổng hợp
enzym cellulase trên MT lỏng với nguồn cacbon là CMC [40].
Năm 2002, Kiều Hoa nghiên cứu sinh tổng hợp enzym cellulase với
nguồn cacbon là cellulose tinh khiết, cám trấu, bã mía, vỏ cà phê [22].
Năm 2003, Hoàng Quốc Khánh nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp và
đặc điểm cellulase của A. niger Rnnl 363. Châu Hoàng Vũ cũng nghiên cứu
thu nhận và tinh sạch enzym cellulase từ nấm mốc T. reesei bằng phương

Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym
cellulase từ RNM Cần Giờ.
Đề xuất hướng ứng dụng các chủng nấm sợi phân lập được.
4. Đối tượng nghiên cứu
- Hệ sinh thái RNM Cần Giờ.
- Nấm sợi có khả năng sinh enzym
cellulase ở RNM Cần Giờ.
- Enzym cellulase sinh ra từ nấm sợi.
5. Phạm vi nghiên cứu
Do hạn chế về thời gian nên đề tài chỉ nghiên cứu phân lập các chủng
nấm sợi ở 6 xã của huyện Cần Giờ: xã Bình Khánh, xã An Thới Đông, xã
Tam Thôn Hiệp, xã Long Hòa, xã Thạnh An, xã Lý Nhơn. Sau đó, chỉ nghiên
cứu một số chủng nấm sợi có khả năng sinh một loại enzym cellulase trong hệ
enzy
m này.

Đề tài được thực hiện tại PTN Vi sinh, khoa Sinh Trường Đại học Sư
phạm Thành phố Hồ Chí Minh và PTN Vi sinh, Viện Sinh học Nhiệt đới
Thành phố Hồ Chí Minh.
6. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Phân lập các chủng nấm sợi từ RNM Cần Giờ.
- Tuyển chọn một số chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase
cao.
- Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa và phân loại các
chủng nấm sợi được tuyển chọn.
- Nghiên cứu các yếu tố MT ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển
và sinh tổng hợp enzy
m cellulase của các chủng được chọn.
- Bước đầu thử nghiệm sử dụng nấm sợi sinh enzym cellulase vào
việc phân hủy các chất phế thải, góp phần hạn chế ô nhiễm MT.

iờ còn là địa điểm du lịch hấp dẫn với
3.000 - 5.000 du khách đến tham quan mỗi tuần [83].
RNM Cần Giờ hiện nay có diện tích khoảng 29,380 ha chiếm 41,18 %
đất huyện Cần Giờ [87]. Khí hậu nóng ẩm và chịu chi phối của quy luật gió
mùa cận xích đạo với mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 10, mùa khô từ tháng 11
đến tháng 4. Lượng mưa trung bình từ 1.300mm đến 1.400mm hàng năm.
Nhiệt độ trung bình là 25,8
0
C, biên độ nhiệt dao động trong ngày từ 5-7
0
C.
Chế độ bán nhật triều không đều. Độ mặn dao động 18

‰ – 30

‰ [1].
Một nghiên cứu mới đây cho biết RNM Cần Giờ đã có 157 loài thực
vật; 63 loài phiêu sinh vật; 130 loài Tảo thuộc 3 ngành: Tảo khuê, Tảo giáp,
Tảo lam; 100 loài động vật đáy không xương sống như tôm, cua, sò ốc. Ngoài
ra, còn có 120 loài cá, trong đó có các loài có giá trị kinh tế cao như cá Ngát,
cá Dứa, cá Chẽm; 31 loài bò sát như cá sấu, trăn, rắn, kỳ đà nước; 19 loài hữu
nhũ như khỉ, heo rừng, rái cá, mèo rừng và 145 loài chim [83]. Đây là các
nguồn thức ăn tốt nhất cho hệ nấm sợi sống trong RNM. Nấm sợi có khả năng
tiết ra hệ enzym cellulase phân hủy hợp chất cellulose có trong lá cây, thân
cây ở RNM thành glucose để sử dụng. Ngoài ra, nấm sợi còn có thể sinh các
loại enzym khác như protease, amylase, kitinase…phân hủy xác, vỏ tôm, cua,
ốc, xác chết các loài động vật khác thành các chất dinh dưỡng chúng có thể
hấp thu [1].

Hình 1.1. Bản đồ RNM Cần Giờ [83]

phát triển
thành các dạng KL khác nhau tùy theo cơ chất rắn, lỏng hay mềm (hình 1.3).
KL nấm sợi thường có dạng hình tròn, hoặc gần tròn. Bề mặt KL có thể mượt,
nhẳn bóng, dạng bột, dạng sợi, dạng hạt, dạng xốp, phẳng, có những vết khía
xuyên tâm, hoặc lồi lõm không đều. Mép KL trơn, răng cưa…. Hình 1.2
.
Bào tử mọc ra khuẩn ty [78] Hình 1.3. KL nấm [78]
Một số sợi nấm có thể tiết sắc tố vào MT hoặc tiết chất hữu cơ kết tinh
trên bề mặt sợi nấm.
Các đặc điểm hình thái khác như có bó sợi, bó giá, thể quả, hạch nấm,
giọt tiết, sắc tố hòa tan…, làm KL nấm sợi có tính đặc trưng loài [78].
Phương thức dinh dưỡng của nấm là hấp phụ qua màng, không có cơ
quan tiêu hóa, không có khả năng quang hợp. Đa phần là các cơ thể hoại sinh,
một số kí sinh, một số gây bệnh trên người và động thực vật [18].
Nấm sợi sinh sản chủ yếu bằng bào tử, bào tử có thể hình t
hành theo
kiểu vô tính hoặc hữu tính.
Bào tử vô tính. Bao gồm các động bào tử, bào tử trần, bào tử kín. Bào
tử trần là dạng bào tử phổ biến nhất. Hình 1.4. Các dạng bào tử trần của nấm sợi [78]
Sinh sản hữu tính. Nấm sợi có các hình thức sinh sản hữu tính như:
đẳng giao, dị giao, và tiếp hợp. Hình 1.5. Sự tiếp hợp của nấm sợi [78]

trong và ngoài cơ thể [29]. Đến nay, các nhà khoa học đã tìm được khoảng
3.500 loại enzym, trong đó phần lớn là enzym từ thực vật và VSV. Nấm sợi
có tiềm năng lớn nhất sinh các loại en
zym ngoại bào mạnh, phân giải và
chuyển hoá các hợp chất hữu cơ, vô cơ khó tan trong tự nhiên. Một số enzym
đã được tinh sạch, nghiên cứu kỹ và ứng dụng phổ biến như: cellulase,
protease, amylase, pectinase và kitinase [6].
 Enzym cellulase. Xúc tác phân giải các hợp chất ligno - cellulose
thành glucose. Ligno-cellulose là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực
vật gồm cellulose (30-40%), hemi-cellulose và lignin (15-30%). Các chủng
nấm sợi Trichoderma, Penicillium, Aspergillus….có khả năng sinh enzym
cellulase được sử dụng trong sản xuất thực phẩm, làm phân bón, xử lý chất
thải hữu cơ chứa cellulose…[19], [20], [21].
 Enzym protease. Protein là các polyme cấu tạo từ các axit amin liên
kết nhau bằng liên kết peptid rất dễ bị cắt đứt tạo thành các chuỗi polypeptid
ngắn. Nấm sợi có khả năng phân giải mạnh protei
n thường gặp thuộc các chi
Aspergillus, Penicillium,… Được sử dụng nhiều nhất trong công nghiệp bột
giặt, sữa, bia, các lĩnh vực khác như công nghiệp dược, công nghiệp thuộc da,
công nghiệp thực phẩm, xử lý chất thải…[5], [6], [29].
 Enzym amylase. Xúc tác quá trình thủy phân tinh bột, chất dự trữ
chủ yếu của thực vật thành đường glucose. Tổ hợp phức hệ enzym amylase
(α-am
ylase, β-amylase và glucoamylase) sẽ cắt đứt các liên kết α-1,4-
glucoside và α-1,6-glucoside trong phân tử tinh bột để tạo ra sản phẩm cuối
cùng là glucose. Nấm sợi có khả năng phân giải tinh bột nhanh chóng là
những tác nhân không thể thiếu ở RNM như Aspergillus, Penicillium,
Trichoderma, Rhizopus, Mucor….. Được ứng dụng trong sản xuất sirô, sản
xuất bia, bánh mì, cồn, nước tương, nước chấm, trong chế biến thực phẩm gia
súc, trong công nghiệp dệt…[29], [30].

c chất kích thích sinh trưởng
Ngày nay, nhu cầu sử dụng axit hữu cơ ngày càng nhiều. Các axit hữu
cơ như axit axetic, axit lactic và một số axit hữu cơ khác được ứng dụng
nhiều trong công nghệ chế biến mủ cao su, trong công nghiệp nhẹ và cả trong
y học. Năm 2004, Võ Thị Hạnh đã nghiên cứu sản xuất axit xitric bằng nấm
sợi A. niger từ rỉ đường mía và bã khoai mì [17]. Ngoài ra, các nhà khoa học
Nhật Bản tổng hợp được chất kích thích sinh trưởng Giberrelin từ hai chủng
nấm sợi F. monoforme và F. oxysporum [29].
Tuy nhiên, có rất nhiều loài nấm sợi mọc trên các nguyên vật liệu, đồ
dùng, thực phẩm, phá hỏng hoặc làm giảm chất lượng của chúng. Một số nấm
sợi tiết độc tố gây ngộ độc hoặc có thể gây ung thư. Ví dụ: A. flavus sinh độc
tố Aflatoxin gây ung thư gan. Một số gây bệnh cho người và động vật như
hen suyễn, bạch huyết, nấm tay chân…, bệnh nấm rỉ sắt ở thực vật, bệnh vàng
lùn, thối cổ bông ở lúa…[29
].
1.3. Enzym cellulase từ nấm sợi
Ngày nay, nguồn enzym từ VSV như amylase, cellulase, protease,
kitinase…được chú ý nhiều nhất do có những ưu điểm:
Có hoạt tính cao; khối
lượng enzym thu được nhiều do tốc độ sinh sản của VSV nhanh; nguyên liệu
rẻ tiền; có thể sản xuất theo quy mô công nghiệp …[29].
1.3.1. Khái quát về enzym
 Cấu trúc
Enzym là một loại protein được sinh vật tổng hợp nên và tham gia vào
các phản ứng sinh học [30].
Enzym có phân tử lượng từ 20.000 đến 1.000.000 Dalton, được cấu tạo
từ L-axit amin liên kết nhau bởi liên kết peptid
.
Bộ phận đặc hiệu tham gia
phản ứng gọi là trung tâm hoạt động của enzym.

9
tấn/năm.
Hàng năm có khoảng 232 tỷ tấn chất hữu cơ được thực vật tổng hợp thành
nhờ quá trình quang hợp. Hàng ngày, hàng giờ một lượng lớn cellulose được
tích lũy trong đất. Do các sản phẩm tổng hợp của thực vật thải ra, cây cối chết
đi, cành lá rụng xuống, một phần do con người thải ra dưới dạng rác rưởi,
giấy vụn, mùn cưa…[5], [6]. Trong số này có đến 30% là màng tế bào thực
vật mà thành phần chủ yếu là cellulose. Cellulose chiếm đến 89% trong bông
và 40-50% trong gỗ [52].
Cellulose là polymer mạch thẳng, mỗi đơn vị là một disaccharit gọi là
cellobiose có cấu trúc từ hai phân tử D-glucose được nối với nhau qua liên kết
β-D-1,4-glucoside. Cellulose cấu tạo dạng sợi, các sợi liên kết lại tạo thành
những bó nhỏ gọi là các micrôfibrin có cấu trúc không đồng nhất. Có những
phần đặc gọi là phần kết tinh và phần xốp hơn gọi là phần vô định hình.

Hình 1.7. Cấu trúc đơn vị cellulose [84]

Hình 1.8. Liên kết hydro trong cấu trúc phân tử của cellulose [84]

Hình 1.9. Cấu tạo của phân tử cellulose trong không gian [84]
1.3.2.2. Enzym cellulase
 Cấu trúc
Trong thiên nhiên không gặp cellulase ở dạng tinh khiết. Nó thường tồn
tại ở dạng kết hợp với các enzym khác như: cellulase, hemicellulase,
pentozanase thành hệ enzym gọi là Citolase [39]. Cellulase là một phức hệ
enzym bao gồm các enzym C1, Cx và β-glucosidase tham gia những phản
ứng kế tiếp nhau khi phân hủy cellulose tạo thành glucose [29].

Hình 1.10. Cấu trúc enzym cellulase trong không gian [86]
 Enzym C1: Có tác dụng cắt đứt liên kết hydro biến cellulose tự

phản ứng
Glucose Cellobiose
C1

Cx β-Glucosidase
Cellulose

Hình 1.14. Cơ chế tác động của enzym cellulase [39]

Theo Mandels và Reese (1964), đầu tiên, enzym C1 phá vỡ liên kết
hydrogen trong phân tử cellulose tạo thành cellulose phản ứng.

Sau đó Cx tiếp tục thủy phân cellulose phản ứng thành các phân tử
cellobiose. Cuối cùng, β-glucosidase phân cắt cellobiose thành glucose.
 Điều hòa sinh tổng hợp enzym cellulase
Khả năng sinh tổng hợp cellulase trong các loài nấm sợi được điều hòa
ở mức độ phiên mã, mức độ mRNA mã hóa cho CBHI luôn cao nhất (Pettila,
1993). Tỷ lệ enzym CBHI cao nhất chiếm khoảng 50% trong hổn hợp
cellulase được tiết ra bởi T. reesei (theo Gritzali và Brown, 1979), mức độ mã
hóa các thành phần khác của enzym cellulase luôn ở trạng thái ổn định [40]

Quá trình sản sinh enzym cellulase được kiểm soát theo cơ chế cảm
ứng và ức chế bởi glucose. Cellulase được sinh ra khi nấm sợi sinh trưởng
trên MT có chứa cellulose, dẫn xuất của cellulose, lactose. Còn trên MT có
chứa glucose, fructose hoặc glycerol thì cellulase không tạo thành enzym
cellulase (Biaria và Mishra, 1989).
Hơn nữa, hoạt tính cellulase còn phụ thuộc vào sự có mặt của các chất
ức chế trong MT nuôi cấy. Nhiều hợp chất phenol đã được chứng minh là có
tác dụng kìm hãm sự phát sinh cellulase ở S. commune [52].
Khi nuôi cấy nấm cũng xảy ra hiện tượng hoạt hóa cellulase. Chẳng

rơm, than bùn, CMC, ….Các chủng Trichoderma nuôi trên MT có nguồn
cacbon là giấy lọc cho hoạt tính enzym cao nhất [38].
Ngày nay, bã mía được dùng như một cơ chất cảm ứng nấm sợi sinh
enzym cellulase. Trên thế giới, lượng bã mía thải ra rất lớn khoảng 150 triệu
tấn/năm. Ở Việt Nam, bã m
ía phần lớn dùng để đốt lò hơi, làm phân bón hữu
cơ, bột giấy, trồng nấm ăn….Tuy nhiên, không sử dụng hết và đã gây ô nhiễm
MT xung quanh. Bã mía có hàm lượng cellulose rất cao 46% (theo
A.G.Keller, 1964), ngoài ra còn chứa hemicellulose, lipid và sáp, chất
khoáng, lignin, silic nên là một cơ chất cảm ứng tuyệt vời cho nấm sợi sinh
enzym. Ngoài ra, cám mì thường được sử dụng với tỉ lệ (6 : 4) do nó có chứa
đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp
enzym của nấm sợi, có tính chất vật lý rất thích hợp để vừa đảm bảo khối kết
dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng dinh dưỡng cần thiết.
 Nguồn dinh dưỡng nitơ
Các nguồn nitơ thích hợp nhất đối với các sinh vật sinh cellulase là
muối nitrat. Natri nirat làm cho MT kiềm hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho sự
tạo thành cellulase. Các hợp chất nitơ hữu cơ có t
ác dụng khác nhau đến sinh
tổng hợp cellulase tùy vào đặc tính sinh lý của từng chủng. Cao nấm men có
tác dụng nâng cao hoạt lực cellulase, cao ngô có khả năng sinh tổng hợp
exoglucanase và endoglucanase mạnh hơn nấm men. Nước chiết nấm men
chủ yếu kích thích sự tạo thành endoglucanase, còn cao ngô kích thích CHBI
và CBHII. Tác dụng kích thích của các hợp chất này là do sự có mặt của các
axit amin, các nguyên tố khoáng và những nhân tố kích thích sinh trưởng
[38], [39], [40].
 Nguồn dinh dưỡng khoáng
Các chất khoáng như Fe, Mn, Zn, Mo, Cu… có vai trò quan trọng như
tham
gia vào quá trình chuyển hóa vật chất qua màng và thành tế bào nấm

2
SO
4
, NaOH, KOH. Durand (1988) đã điều chỉnh pH trong
nuôi cấy T. viride ở qui mô pilot trên MT hạt cà phê-đường bằng cách phun
dung dịch urea, do hoạt động của urease của nấm sợi làm tăng pH qua việc
tạo ammonia [29].
Ngoài ra, việc điều chỉnh pH thích hợp trong quá trình nuôi cấy nấm
sợi hạn chế sự tạp nhiễm vi khuẩn làm ảnh hưởng đến hoạt tính enzym [73].
 Ảnh hưởng nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh
enzy
m cellulase. Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của đa số nấm sợi từ
28
0
C-32
0
C, tối đa dưới 50
0
C [40], [73]. Nếu nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp
có thể kìm hãm sự sinh trưởng thậm chí có thể giết chết sợi nấm, quá trình
tổng hợp enzym sẽ bị ức chế. Theo Raimbaut & Alazard (1989) cho biết nhiệt
độ tối ưu cho sự sinh trưởng của A. niger trên MT bột khoai mì là 35- 40
0
C,
ngược lại ở 45
0
C, sự nảy mầm của sợi nấm bị ức chế, khả năng sinh enzym
giảm [40].
 Ảnh hưởng của MT khí