BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Nguyễn Thò Thanh Bình NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYM AMYLASE CỦA
MỘT SỐ CHỦNG NẤM SI PHÂN LẬP TỪ RỪNG
NGẬP MẶN CẦN GIỜ
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. TRẦN THANH THỦY
Thành phố Hồ Chí Minh, Tháng 8 - 2010
THƯ
VIỆN
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gởi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành đến TS. Trần Thanh Thủy đã dìu dắt giúp đỡ
tôi trong suốt quá trình học tập và tận tình hướng dẫn trong suốt quá trình nghiên cứu, hoàn thành
luận văn này.
Tôi xin ghi nhớ công ơn tất cả Quý Thầy Cô trong Khoa Sinh, và trong phòng thí nghiệm Vi
sinh – Sinh hóa, Trường Đại học Sư phạm Tp Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn
Nguyễn Thị Thanh Bình
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CMC Carboxymethy cellulose
dd Dung dịch
DNS 3, 5 – dinitrosalicylic acid
Hđ
amylase
Hoạt độ amylase
HST Hệ sinh thái
KL Khuẩn lạc
KS Kháng sinh
MT Môi trường
NS Nấm sợi
NXB Nhà xuất bản
OD Optical density (mật độ quang)
PTN Phòng thí nghiệm
RNM Rừng ngập mặn
SV Sinh vật
VK Vi khuẩn
VSV Vi sinh vật
MỞ ĐẦU
Amylase là một loại enzym thủy phân tinh bột quan trọng nhất trong công nghệ sinh học. Nó
có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4 glucoside, α-1,6 glucoside của amylose và amilopectin, làm
tăng tốc độ đường hóa tinh bột của nguyên liệu giúp các phản ứng xảy ra nhanh chóng, rút ngắn thời
gian hình thành sản phẩm.
Amylase thu nhận từ VSV nói chung, từ NS nói riêng có nhiều ưu điểm nổi bật hơn các loại
amylase từ thực vật và động vật như: hoạt tính enzym cao hơn, khả năng chịu nhiệt cao, thời gian
- Khảo sát khả năng sinh tổng hợp amylase các chủng NS phân lập được
- Tuyển chọn 2 chủng sinh amylase cao tiếp tục khảo sát
- Phân loại đến chi các chủng NS đã tuyển chọn
- Khảo sát các điều kiện sinh trưởng của 2 chủng NS tuyển chọn
- Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình thu nhận amylase
- Thu nhận chế phẩm amylase thô và so sánh với enzym thương mại trên thị trường.
- Khảo sát các đặc tính sinh học khác
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng là các chủng NS phân lập từ các mẫu đất, thân, lá cây, …ở RNM Cần Giờ
- Phạm vi nghiên cứu gồm 5 xã: Bình Khánh, Tam Thôn Hiệp, An Thới Đông, Long Hòa, Lý
Nhơn thuộc RNM huyện Cần Giờ.
Thời gian và địa điểm nghiên cứu đề tài
- Thời gian: Từ tháng 8/2009 – 7/ 2010
- Địa điểm: Đề tài được thực hiện tại PTN Vi sinh - Sinh hóa, Khoa Sinh học,
Trường Đại học Sư Phạm Tp. Hồ Chí Minh
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. KHÁI QUÁT VỀ RNM CẦN GIỜ TP. HỒ CHÍ MINH
1.1.1. Đặc điểm các nhân tố sinh thái cơ bản
RNM Cần Giờ là một hệ sinh thái ngập mặn có vai trò và vị trí đặc biệt quan trọng đối với
MT và cộng đồng dân cư địa phương trong vùng. Là rừng mới tái sinh nhưng RNM Cần Giờ là Khu
Dự trữ Sinh quyển đầu tiên tại Việt Nam với hệ thực vật và động vật rất phong phú mang tính đa
dạng sinh học cao [34], [39].
Hình 1.1. Rừng ngập mặn Cần Giờ
Về vị trí địa lý khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ được hình thành ở hạ lưu hệ thống sông
Đồng Nai – Sài Gòn nằm ở cửa ngõ Đông Nam Tp. Hồ Chí Minh. Tọa độ: 10°22’ – 10°40’ độ vĩ
mặn nơi đây dao động 1,8 – 3%.
Độ mặn là nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, tỉ lệ sống của các loài cây ngập
mặn và phân bố của RNM. Hầu hết cây ngập mặn sinh trưởng tốt ở nước có độ mặn từ 25% đến
50% độ mặn nước biển. Nhiều ý kiến cho rằng, muối là nhân tố quan trọng, tác động thông qua quá
trình chọn lọc tự nhiên thích nghi, tạo điều kiện để cây ngập mặn tồn tại, phát triển [36].
RNM Cần Giờ chịu tác động của chế độ bán nhật triều không đều của biển Đông. Mỗi tháng
có khoảng 2 ngày nhật triều không đều xuất hiện 2-3 ngày trước, giữa và cuối tháng âm lịch. Mực
nước trung bình cao nhất thường xuất hiện vào tháng 10, 11 và thấp nhất vào tháng 6, 7 [39]. Chế
độ bán nhật triều với biên độ triều cao là một trong những nhân tố thuận lợi cho RNM sinh trưởng
so với vùng có nhật triều. Các dòng hải lưu ở đây là nhân tố chính giúp phát tán quả, hạt, trụ mầm
và SV dọc theo các vùng ven biển.
1.1.2. Đặc điểm của các khu hệ SV tại RNM Cần Giờ
RNM Cần Giờ có hệ SV vô cùng đa dạng và phong phú, trong đó có nhiều loài đem lại
những giá trị kinh tế cao.
Về thực vật: Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ có trên 150 loài thực vật, các
loài chủ yếu như Bần trắng, Mấm trắng, các quần hợp Đước đôi - Bần trắng cùng Xu, Ổi, Trang,
Đưng… Các loại cây nước lợ như Bần chua, các quần hợp Mái dầm – ôrô, dừa lá, ráng… Thảm cỏ
biển với các loài ưu thế Halophyla sp., Halodule sp., và Thalassia sp [66].
Động vật: bao gồm động vật thủy sinh không xương sống với trên 700 loài, khu hệ cá trên
130 loài, 9 loài lưỡng thê, 31 loài bò sát, 4 loài có vú. Trong đó có 11 loài bò sát có tên trong sách
đỏ Việt Nam như: tắc kè (Gekko gekko), kỳ đà nước (Varanus salvator), trăn đất (Python molurus),
trăn gấm (Python reticulatus) … Khu hệ chim có khoảng 130 loài thuộc 47 họ, 17 bộ [66].
Thảm động thực vật nơi này trở thành nguồn cung cấp thức ăn và nơi trú ngụ cho rất nhiều
loài thủy sinh, các động vật có xương sống và hệ VSV.
Vi sinh vật rất đa dạng gồm có: vi khuẩn, nấm, tảo
Vi khuẩn
VK cùng với nấm tạo nên một thành phần quan trọng trong hệ sinh thái RNM. Là những SV
phân huỷ, chúng đóng vai trò trung tâm về mặt chức năng trong hệ sinh thái này. Số lượng VK
trong rừng ngập mặn chiếm tỉ lệ khá cao, đặc biệt là trong trầm tích các quần thể VK dị dưỡng
nhiều gấp 2-3 lần lớp nước trên mặt, các quần thể trên nền bùn lớn gấp vài lần trên nền cát. Nhiều
quá trình quang hợp. Tảo còn tạo ra độ thoáng khí giữa các hạt đất, tiết ra các chất nhầy hình thành
phức hệ keo, tảo xanh lục dị dưỡng làm tăng hàm lượng đạm cho đất nhờ khả năng cố định đạm
[36].
Các SV trong RNM làm nên sự đa dạng sinh học của các quần xã RNM, chúng là một mắt
xích quan trọng trong chuỗi thức ăn, là một nhân tố không thể thiếu trong chu trình chuyển hóa vật
chất ở RNM Cần Giờ.
1.1.3. Vai trò của RNM đối với hệ sinh thái
RNM có liên quan mật thiết với các đầm lầy mặn, các bãi bùn, bãi cỏ ven biển hoặc các quần
xã cửa sông khác. Dòng nước ngọt đổ từ thượng nguồn ra biển, dòng nước triều từ biển lên xuống
các vùng cửa sông đều đi qua RNM. Các dòng nước này vận chuyển vật chất, SV từ quần xã này tới
quần xã khác và như vậy hệ sinh thái RNM chính là nơi giao lưu của các quần xã, tạo nên sự phong
phú về thành phần SV cho nơi này [36].
Hệ thực vật RNM bao gồm các loài thực vật (Sú, Vẹt, Mắm, Đước, Bần,…) sống trong vùng
nước mặn, hệ rễ của cây góp phần vào việc làm giảm tốc độ dòng chảy của thủy triều, tạo điều kiện
lắng đọng bùn, các vật chất lơ lửng, chúng góp phần bảo vệ vùng ven bờ; cung cấp các giá trị về
lâm sản như than, gỗ, củi, thức ăn, thuốc,…Bên cạnh đó, hệ thực vật còn đóng vai trò quan trọng
trong việc điều hòa khí hậu, cung cấp chất hữu cơ để tăng năng suất cho vùng ven biển [34].
RNM còn là nơi kiếm ăn, sinh sản và cư trú của nhiều loài hải sản có giá trị kinh tế cao như
tôm, cua, cá,... Mới đây, Bell và cộng sự (1984) khẳng định RNM là vườn ươm quan trọng cho các
loài cá sống ở cửa sông. Khi so sánh thành phần các loài cá và tôm trong một vùng có RNM vào các
mùa vụ trong năm đều thấy lượng con non của các loài này đều cao hơn hẳn các vùng đất, cát ở
ngoài đầm. Từ đây cho thấy RNM là nơi nuôi dưỡng chính cho con non của nhiều loài hải sản [36]
Các loài động thực vật, VSV sống trong MT tự nhiên của RNM Cần Giờ liên kết với nhau
thông qua các quá trình trao đổi chất và đồng hóa năng lượng nhằm khép kín chu trình dinh dưỡng
của hệ sinh thái này. Các quá trình nội tại như cố định năng lượng, tích lũy sinh khối, phân hủy vật
chất hữu cơ và chu trình dinh dưỡng đều chịu sự ảnh hưởng mạnh mẽ bởi các nhân tố bên ngoài
như: thủy triều, nhiệt độ và lượng mưa. RNM phát triển tốt nhất ở nước có nồng độ muối 15 - 25‰
[36]
Tuy nhiên, hiện nay RNM đang có những thay đổi đáng kể trước áp lực của việc đánh bắt cá,
tôm,… khai thác gỗ, củi, nhiên liệu, nuôi trồng thủy sản, du lịch… Sự tác động này nếu quản lý
Hình1.2. Cấu trúc sợi nấm
NS sinh sản chủ yếu bằng bào từ, bào tử có thể hình thành theo kiểu vô tính hoặc hữu tính.
Bào tử vô tính gồm các dạng bào tử trần hay bào tử kín, trong đó bào tử trần là phổ biến nhất. Trong
sinh sản hữu tính, NS có các hình thức đẳng giao, dị giao và tiếp hợp [59].
NS được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm nhiều do khả năng sinh các chất có hoạt
tính sinh học như: enzym, các chất KS, các axit hữu cơ được ứng dụng rộng rãi và đem lại lợi ích
kinh tế cao. Bên cạnh đó, từ NS còn có các chất có khả năng phân giải nguồn cacbonhydro ứng
dụng trong xử lý ô nhiễm MT do tràn dầu, khai thác các mỏ dầu trong lòng đất [1], [57], [59].
Khả năng sinh các enzym ngoại bào
NS đã trở thành nguồn VSV chủ yếu dùng trong việc sản xuất enzym. Hiện nay, từ NS người
ta đã sản xuất được trên 80 loại enzym khác nhau, trong đó có 10 enzym được ứng dụng rộng rãi
Cần Giờ [35].
Khả năng sinh KS của NS
KS là một trường hợp riêng biệt của tính đối kháng, là hiện trượng một VSV với sản phẩm
trao đổi chất của mình có tác dụng kìm hãm hoặc ức chế sự phát triển của VSV khác.
Các chất KS có nguồn gốc từ NS chiếm tỷ lệ khá lớn, đa số thuộc lớp nấm bất toàn. Chất KS
được sử dụng chủ yếu trong y học như: Cephalo-sporin-C, Griseofluvin, Penicillin là một thứ vũ khí
chống lại các vi khuẩn gây bệnh viêm màng não, viêm màng phổi, bạch cầu, uốn ván. Trong phẫu
thuật, chúng được dùng để chữa các bệnh nhiễm trùng vết thương [11].
Chất KS được sinh ra nếu kết hợp với các enzym thủy phân protein là một trong những
phương thức có nhiều triển vọng nâng cao hiệu quả điều trị của KS. Những vấn đề về chất KS được
sinh ra từ VSV đang là mối quan tâm hàng đầu và phát triển mạnh mẽ trong nhiều lĩnh vực cuộc
sống ngày nay [11].
Ngoài ra, trước nhu cầu sử dụng axit hữu cơ ngày càng nhiều trong công nghệ thực phẩm,
công nghệ chế biến mủ cao su, trong công nghiệp nhẹ và cả trong y học. Axit hữu cơ sản xuất từ NS
được nghiên cứu nhiều hơn: Năm 2004, Võ Thị Hạnh nghiên cứu sản xuất axit citric bằng NS
Aspergillus niger từ rỉ đường mía và bã khoai mì; các nhà khoa học Nhật Bản tổng hợp chất kích
thích sinh trưởng Giberrelin từ hai chủng F. monoforme và F. oxysporum [29].
Bên cạnh những lợi ích trên, nhiều loài NS là nguyên nhân gây hư hỏng hoặc giảm chất
lượng của thực phẩm, dụng cụ quang học,... Một số NS tiết độc tố gây ngộ độc hoặc có thể gây ung
thư. Ví dụ: A. flavus sinh độc tố Aflatoxin gây ung thư gan. Một số NS gây bệnh cho người và động
vật như hen suyễn, bạch huyết, nấm chân tay…, bệnh nấm rỉ sắt ở thực vật, bệnh vàng lùn, thối cổ
bông ở lúa…[6], [7].
1.2.2. Vị trí phân loại
Cho đến nay, người ta ước tính trong tự nhiên có khoảng 1 triệu đến 1,5 triệu loài nấm nhưng
mới định tên được khoảng 10.000 chi và 70.000 loài. Trung Quốc đã điều tra được 40.000 loài.
Riêng các loài nấm thuộc lớp Nấm bất toàn ở nước ta hiện chỉ mới phát hiện được 338 loài thuộc
306 chi khác nhau (Bùi Xuân Đồng, 2004). Việc phân loại NS chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình
thái, nuôi cấy, một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa và phương thức sinh sản [6].
Về phân loại nấm, hiện nay có hai hệ thống phân loại nấm được sử dụng phổ biến hơn cả là:
Hệ thống phân loại hình thái học và hệ thống phân loại phát sinh, với nhiều khóa phân loại được sử
ở RNM, có khả năng phân hủy xác động vật, thực vật ở đó.
Năm 1995, Hyde và Lee ; Kohlmeyer et al., đưa ra nhận định các nấm RNM đóng vai trò
quan trọng đối với các chu trình tuần hoàn vật chất trong hệ sinh thái RNM.
Ở Việt Nam, cho đến năm 2000 mới chỉ có một thông báo của Mai Thị Hằng và cộng sự về
nấm sợi RNM Giao Thủy, Nam Định. Năm 2001, tác giả này tiếp tục nghiên cứu khả năng sinh
enzym ngoại bào của 144 chủng phân lập từ RNM Giao Thủy. Năm 2002, Mai Thị Hằng nghiên
cứu khả năng diệt côn trùng và khả năng phân giải cacbuahydro của nấm sợi RNM ở hai tỉnh Nam
Định, Thái Bình [52].
Với rừng RNM, những phát hiện khoa học đầy thú vị chưa dừng lại ở đó. Các nghiên cứu
VSV trong RNM ven biển đồng bằng sông Hồng và Cần Giờ (2001-2003) đã chứng minh được: ở
các hệ sinh thái RNM này có tới 83/199 chủng nấm có khả năng phân giải dầu mỏ ở các mức độ
khác nhau. Đó là các loài NS thuộc một số chi Penicillium, Aspergillus, Cladosporium,
Paecilomyces, Canninghamela có khả năng phân giải dầu DO rất mạnh
[69].
Theo nhóm nghiên cứu của Phan Nguyên Hồng và Nguyễn Hoàng Trí, những chất thải rắn
trong sinh hoạt, y tế, công nghiệp, nông nghiệp cùng với các hóa chất dư thừa từ nội địa theo sông
ra RNM được giữ lại và nhờ VSV phân hủy, biến chúng thành thức ăn cho hệ sinh vật ở đây, làm
trong sạch nước biển. Chính vì thế “người ta đã ví RNM là quả thận khổng lồ lọc các chất thải cho
MT vùng ven biển” [69].
Năm 2004, Phan Thị Phương Hoa nghiên cứu phân loại 67 chủng NS thuộc chi Aspergillus
phân lập từ RNM Nam Định và Thái Bình. Đây là một nghiên cứu được đánh giá cao trong số các
nghiên cứu về NS ở RNM Việt Nam [8].
Đến năm 2007 mới có tác giả Khưu Phương Yến Anh“Nghiên cứu khả năng
sinh enzym cellulase của một số chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ” [1]
Năm 2009, có tác giả Nguyễn Thị Bích Viên “Khảo sát một số đặc tính sinh học của một số
chủng NS thuộc chi Aspergillus và Penicillium phân lập được từ RNM Cần Giờ” [41].
Bên cạnh việc tìm kiếm những chủng NS mới ở RNM, người ta còn nghiên cứu các đặc tính
sinh học của chủng này. Ví dụ, để thu nhận amylase thì dùng các chủng Aspergillus, Rhizopus. Một
số loài của Neurospora, Mucor tổng hợp rất mạnh cả hai loại α-amylase và glucoamylse (Rodzevits,
những nghiên cứu về amylase của NS từ RNM Cần Giờ vẫn còn khá ít ỏi, chưa tương xứng với tiềm
năng.
1.3. TINH BỘT VÀ HỆ ENZYM AMYLASE
1.3.1. Tinh bột
Tinh bột không phải một hợp chất đồng thể mà gồm hai polysaccarit khác nhau: amilose và
amilopectin [5].
Thành phần cấu trúc của amylose.
Amilose là loại mạch thẳng, chuỗi dài từ 500-2000 đơn vị glucozơ, liên kết nhau bởi liên kết
α−1,4 glicozit. Hình1.6 – Phân tử Amilose
Thành phần cấu trúc của amilopectin
Amilopectin là polyme có mạch nhánh, ngoài mạch chính có liên kết α-1,4 glucozit còn có
nhánh liên kết với mạch chính bằng liên kết α-1,6 glucozit.
Cấu tạo của amilopectin còn lớn và dị thể hơn amilose nhiều. Trong tinh bột tỉ lệ
amiloza/amilopectin khoảng ¼. Tỉ lệ này có thể thay đổi phụ thuộc thời tiết, mùa vụ và cách chăm
sóc.
Hình1.7 – Phân tử amilopectin
Ở nước ta, nguồn nguyên liệu chứa tinh bột thì vô cùng đa dạng và phong phú. Nhưng để phù
hợp cho sản xuất enzym amylase ở qui mô công nghiệp thì cần
thóc mầm và malt là 58 – 60
0
C và VK là 70 – 75
0
C [21].
α – amylase hầu như không tác dụng trên tinh bột nguyên thủy nhưng thủy phân hồ tinh bột
rất nhanh. Thủy phân tinh bột bằng α – amylase thường xảy ra hai giai đoạn:
* Giai đoạn đầu: (
Giai đoạn dextrin hóa
) chỉ một số liên kết trong phân tử bị đứt và độ nhớt từ hồ
tinh bột giảm
Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp
* Giai đoạn 2: (
Giai đoạn đường hóa
) thủy phân các dextrin phân tử lớn vừa hình thành [17]
Dextrin tetra và trimaltose di & monosaccharide
Amylase oligosacharide poliglucose
Maltose maltotriose maltotetrose
1.3.2.2. β – amylase hay β (1 - 4) glucomaltohydrolase
α-amylase
Là ngoại enzym chỉ phân cắt các liên kết α – 1,4 glucoside ở đầu mạch. Chỉ phổ biến ở thực
vật, nhiều ở hạt nảy mầm. Vi khuẩn không có enzym này, còn NS chưa được chứng minh hoàn toàn
về sự hiện diện của enzym này [5], [21].
β – amylase kém bền ở nhiệt độ cao, vô hoạt hoàn toàn ở 70
0
C nhưng trong dịch nấu thì nhiệt
độ tối thích là 60 – 65
0
C. Enzym này khá bền trong MT axit ở pH 3-4. Đa số β – amylase hoạt động
sự hoạt động của enzym này [5], [21], [29].
1.3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp amylase của NS
a. Giống nấm sợi
Trong các yếu tố thì chủng giống NS là điều kiện đầu tiên và cơ bản nhất quyết định sự hình
thành và hàm lượng amylase. Không phải tất cả các chủng nấm đều có khả năng tổng hợp amylase
như nhau. Ngày cả những chủng cùng chi, thậm chí cùng loài cũng rất khác nhau về lượng enzym
do chúng sản sinh ra. Chính vì thế mà việc tuyển chọn chủng NS có khả năng tạo nhiều amylase là
điều vô cùng quan
trọng [26], [31].
Bên cạnh việc tuyển chọn được chủng NS có khả năng sinh amylase cao, cần
phải đồng thời tiến hành nuôi cấy trong các điều kiện tối ưu nhằm đảm bảo khả năng tổng hợp
enzym cao nhất và ổn định nhất. Sau đó, cần phải tiến hành bảo quản giống một cách cẩn thận để
giữ được hoạt tính ban đầu.
b. Nguồn dinh dưỡng
Các yếu tố trong thành phần MT ảnh hưởng lớn tới hoạt động sống và sự tạo thành enzym
của NS. Vì vậy, trong MT nuôi cấy cần bảo đảm đầy đủ các thành phần dinh dưỡng và tỉ lệ các chất
dinh dưỡng hợp lý, phù hợp với từng loại NS [26]
Nguồn dinh dưỡng cacbon
Trong MT nuôi cấy NS sinh amylase nhất thiết phải có nguồn tinh bột làm chất cảm ứng và
nguồn cacbon. NS có khả năng đồng hóa rất nhiều nguồn cacbon khác nhau. Nguồn cacbonhydrat
dễ hấp thu nhất với NS là glucose - là nguồn cacbon duy nhất tham gia vào chu trình chuyển hóa:
con đường Embden Meyerhof (1930), Pentose và Entner Doudoroff [26].
Nồng độ tinh bột và các nguồn cacbon khác nhau cũng có ảnh hưởng lớn đến sự tạo thành
các enzym riêng biệt của hệ amylase. Ví dụ như để đảm bảo hoạt lực α-amylase cao cần 6% tinh
bột, còn với glucoamylase là 2% [26].
Nguyên liệu sử dụng cho nuôi cấy NS thu amylase thường là những nguyên liệu có nguồn
gốc tự nhiên như cám mì, cám gạo, ngô mảnh, đậu nành và các loại hạt ngũ cốc khác. Trong đó cám
gạo, cám mì được sử dụng nhiều hơn cả. Hai loại này có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho
VSV phát triển. Mặt khác, khi chế tạo MT, các nguyên liệu này chúng thường có tính chất vật lý rất
thích hợp để vừa đảm bảo khối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng không khí lưu chuyển trong
sẽ ảnh hưởng đến tổng hợp mọi amylase của NS (Fenikxova,
Muxaeva, 1967). Nồng độ tối ưu của muối này cần cho sự tổng hợp α-amylase và glucoamylase là
0,05%.
Phospho ảnh hưởng đến sự sinh sản của NS, khi bổ sung phospho hữu cơ vào MT sẽ làm
tăng giá trị dinh dưỡng MT và làm tăng tổng hợp amylase 2-3 lần; Tuy nhiên, nếu trong MT có
nhiều Mn, Cu, Hg thì sẽ kìm hãm sự tổng hợp amylase [21].
c. Điều kiện nuôi cấy
Ngoài các yếu tố dinh dưỡng, trong MT nuôi cấy VSV các yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm, pH,
thời gian nuôi cấy cũng ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp amylase của VSV.
- Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng đa số NS trên MT rắn là 28-32
0
C. Chu kỳ sinh trưởng của
NS có thể chia làm 3 thời kì: Thời kì trương và nảy mầm của đính bào tử (10-11 giờ đầu tiên), nhiệt
độ cần ở 23-30
0
C. Thời kì sinh trưởng nhanh hệ sợi (4-18 giờ), nấm hô hấp mạnh nên giữ nhiệt độ
phóng ở 28-29
0
C. Và ở thời kì
sinh amylse mạnh (10-12 giờ) ở nhiệt độ 28-29
0
C [26].
- Ảnh hưởng của độ ẩm
Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu của MT thích hợp với NS là 60-65%, VK là khoảng
70%, độ ẩm MT cần phải được duy trì trong quá trình sản xuất. Độ ẩm cao sẽ làm giảm độ thoáng
khí của MT, còn khi độ ẩm thấp lại kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của VSV.
- Ảnh hưởng của pH
Đa số NS phát triển và tạo amylase ở MT axit yếu trong khi vi khuẩn lại phát triển và sinh
enzym cao ở MT trung tính. pH môi trường không chỉ ảnh hưởng đến lượng enzym tổng hợp mà
Song phương pháp nuôi cấy chìm cũng có một số nhược điểm sau:
- Đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, điều kiện vô trùng tuyệt đối
- Trong quá trình nuôi cấy phải thổi khí và khuấy liên tục
- Dễ bị nhiễm trùng toàn bộ
- Cần chọn thành phần MT với tỉ lệ dinh dưỡng thích hợp và chú ý tới chất
cảm ứng để NS sinh enzym ở mức tối đa.
Phương pháp nuôi cấy bề mặt – MT bán rắn
Là phương pháp tạo điều kiện cho NS phát triển trên bề mặt MT. Nguyên liệu chính thường
là cám mì, cám gạo, cám nếp, bắp xay nhỏ, tấm gạo,…được bổ sung lượng nhỏ (10-20%) trấu, hạt
ngũ cốc, mạt cưa,… để làm tăng độ thoáng khí. MT được bổ sung thêm một số chất dinh dưỡng
khác, rồi tiến hành trộn đều với nước sao cho độ ẩm khoảng 55 – 60%. Hấp thanh trùng ở 1-1,5
atm/45-60 phút, để nguội rồi cho bào tử nấm hay NS vào. MT đã cấy giống được tãi lên các khay
sạch với chiều dày từ 2 – 5cm và nuôi ở các điều kiện thích hợp. Sau khoảng thời gian nuôi cấy,
người ta thu nhận MT đem sấy nhẹ ở 40
0
C để đạt độ ẩm 8-12%, nghiền nhỏ. Đây chính là chế phẩm
enzym dạng thô [26].
Phương pháp này có nhược điểm là:
- Tốn diện tích mặt bằng
- Khó cơ khí hóa và đặc biệt là khó tự động hóa được toàn bộ quá trình
- Chi phí nhân công, điện nước...cho một đơn vị sản phẩm cao
Trong hai phương pháp trên, thì nuôi cấy NS trên MT bán rắn đem lại hiệu quả cao hơn, vì
NS là VSV hiếu khí bắt buộc do đó nuôi trên MT này thì độ thoáng khí cao. Nồng độ enzym tạo
thành cao hơn nhiều so với nuôi cấy chìm. MT không cần điều kiện vô trùng tuyệt đối, nếu bị nhiễm
VSV lạ cũng dễ dàng xử lý. Chế phẩm dễ sấy khô, bảo quản, dễ vận chuyển và ít tổn hao hoạt tính
enzym. Là phương pháp sử dụng trong điều kiện không cần thu enzym tinh khiết, rất dễ thực hiện,
quy trình công nghệ đơn giản không đòi hỏi quá cao về trang thiết bị [28].
Phương pháp thu nhận amylase
- Từ phương pháp nuôi cấy chìm: Sau khi lọc bỏ sinh khối VSV và các tạp chất rắn không tan
còn khoảng 1-3% chất khô hòa tan, trong đó có enzym. Thu dịch lọc, sau đó cô đặc cho giảm thể
người Việt Nam đã biết sản xuất rượu từ gạo cách đây hàng ngàn năm [29], [31].
Riêng ở Mỹ, mãi đến thế kỷ XIX khi Takamine người Nhật đưa nấm mốc Aspergillus sang
mới biết sử dụng enzym của nấm này thay amylase của malt để sản xuất cồn [29].
b. Sản xuất bánh mì
Để rút ngắn thời gian ủ bột, khi thêm 0,002 – 0,003% chế phẩm amylase vào bột nhào sẽ
nâng cao chất lượng bánh mì về hương vị, màu sắc, thể tích riêng và độ xốp. Nhiệt độ vô hoạt α-
amylase của NS tương đối cao (70
0
C) nên có thể dùng enzym này với liều lượng lớn mà không có
hiện tượng dextrin hóa khi nướng. Hơn nữa, hoạt độ α-amylase lại cao nên có thể đạt đến độ đường
hóa cần thiết rất nhanh chóng, sau đó bị vô hoạt ngay. Tuy nhiên, chế phẩm enzym nấm mốc thường
là một phức hệ enzym, trong đó protease có thể làm cho chất lượng bánh mì xấu đi [29].
c. Công nghiệp dệt
Chế phẩm amylase được dùng để rũ hồ vải trước khi tẩy trắng và nhuộm. Trong vải thô
thường chứa khỏang 5% tinh bột và các tạp chất khác. Để làm vải mềm, có khả năng nhúng nước,
tẩy trắng và bắt màu tốt người ta thường sử dụng 1 lượng chế phẩm amylase (từ VK hay nấm mốc)
khỏang 0,3-0,6 g/l dung dịch và thời gian xử lý 5-15 phút ở nhiệt độ 90
0
C. Phương pháp này không
làm hại vải, độ mao dẫn tốt, đồng thời đảm bảo vệ sinh.
Ngoài ra, amylase cũng được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trong sản xuất đường bột, sản
xuất dextrin, maltodextrin, nha glucose, siro, glucose – fructose, sản xuất tương và nước chấm …ở
quy mô công nghiệp [29].
d. Trong sản xuất thức ăn gia súc
Trong chế biến thức ăn gia súc, thành phần ngũ cốc chiếm một khối lượng rất lớn với thành
phần tinh bột rất cao. Để tăng hiệu suất sử dụng năng lượng từ nguồn tinh bột, người ta thường sử
dụng chế phẩm amylase của A. oryzae, A. owamorii thêm enzym amylase vào khẩu phần ăn của
động vật, nhất là động vật
non làm tăng khả năng đồng hóa dẫn đến tăng trọng nhanh [31].
e. Nghiên cứu sinh học, y học
Gist-brocades
3
Amyloglucosidase
Diazym
AMG
Spezym
Miles lab
Novo-nordisk
Fiun Biochemical
4 β-amylase Dextrozym (chứaAMG)
Promozym
Novo-nordisk
Novo-nordisk
5
Biozym
MKC. Fugal amylase
Fungamyl clarase
Amano
Novo-nordisk
Miles lab
Copyright: Tài liệu đại học ©