BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
Võ Thị Bích Viên
KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC MỘT SỐ NHÓM NẤM SỢI
TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ
TP. HỒ CHÍ MINH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC
Chuyên ngành
:
Vi Sinh Vật
Mã số: 60 42 40
Đ
Đ
Ầ
Ầ
U
U Nấm sợi hay còn gọi là nấm mốc, phát triển rất nhanh trên nhiều nguồn cơ chất hữu cơ khi gặp
điều kiện khí hậu nóng ẩm. Trong tự nhiên, nấm sợi phân bố rất rộng rải và tham gia tích cực vào các
vòng tuần hoàn vật chất, nhất là quá trình phân giải chất hữu cơ hình thành chất mùn.
Ngoài ra, có rất nhiều loài nấm sợi được sử dụng rộng rải trong CN chế biến thực phẩm (làm
tương, nước chấm…), trong CN enzim (sản xuất amilaza, proteaza, cellulaza…), CN dược phẩm (sản
xuất KS, steroid…), sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, kích thích tố sinh trưởng TV, sản xuất sinh khối
nấm sợi để phục vụ chăn nuôi và dinh dưỡng cho người (m
ycoprotein), dùng nấm sợi để xử lý ô nhiễm
MT. [4]
Bên cạnh đó còn có nhiều loài nấm sợi ký sinh trên người, ĐV, TV gây ra nhiều bệnh khá nguy
hiểm. Nhiều nấm sợi sinh ra các độc tố nấm có thể gây ra bệnh ung thư và
nhiều bệnh khác. Nấm mốc
còn có thể phát triển, sinh axít và làm mờ các vật liệu vô cơ (thấu kính ở ống nhòm, kính hiển vi và
một số dụng cụ quang học khác)
Để tận dụng tối đa nguồn lợi to lớn từ nấm sợi đồng thời hạn chế các tác hại do nấm sợi gây ra,
con người đã tập trung nghiên cứu các vấn đề liên quan đến nấm sợi. Trước đây, các nhà nghiên cứu
thường tập trung tìm
hiểu nấm sợi phân bố ở đất liền. Những năm gần đây, con người mới nhận thấy
hết được tầm quan trọng của hệ sinh thái RNM - HST có năng suất sinh học cao nhất trong các HST.
Với điều kiện sinh thái của RNM con người có thể nghiên cứu khả năng chịu đựng và phục hồi của các
tổ hợp gen. Có thể tìm ra được các chủng nấm sợi có hệ gen bền vững mang nhiều đặc tính c
ó lợi cho
xét sơ bộ về đặc điểm sinh học của các chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus và Penicillium.
Đề tài được tiến hành từ tháng 9 năm 2008 đến tháng 7 năm 2009 tại phòng thí nghiệm Sinh hoá
– Vi sinh, khoa Sinh, Trường Đại học Sư phạm Tp. Hồ Chí Minh.
P
P
H
H
Ầ
Ầ
N
NI
I
:
:T
T
Ổ
Ổ
N
N
G
GQ
là một HST đặc biệt
với những điều kiện sinh thái đặc trưng
là khí hậu nóng, đất mặn ngập nước quanh
năm, hoặc có thuỷ triều lên xuống, thường xuyên thiếu khí và oxy khi ngập nước,
đất chưa ổn định.
Với MT đó, một quần hợp TV không họ hàng với nhau nhưng có những đặc tính sinh lý giống nhau,
thích nghi sinh thái giống nhau tạo nên một kiểu rừng được gọi là RNM. Ở miền Nam, Việt Nam RNM
còn được gọi là Rừng sát, tiếng Anh gọi là Mangrove. Danh từ Mangrove rất thông dụng trên thế giới.
Trên thế giới, RNM thường gặp ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở Việt Nam
,
RNM đã từng
bao phủ diện tích khoảng 400,000 ha vào năm 1943 (Maurand, 1943). Tuy nhiên, do nhiều nguyên
nhân khác nhau như chiến tranh, chuyển đổi mục đích sử dụng, đốn củi, đã làm cho diện tích RNM
ngày càng thu hẹp. Hơn 60 năm qua, trên 80% diện tích RNM bị tàn phá hoặc suy giảm chất lượng
(worldbank, 2003). Đặc biệt trong những năm 1995 trở lại đây, RNM bị thu hẹp một cách nhanh chóng
nguyên nhân do con người đã phá RNM để nuôi tôm.[10]
Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ được hình thành ở hạ lưu sông Đồng Nai – Sài Gòn nằm
ở cửa ngõ Đông Nam Thành phố Hồ Chí Minh:
RNM Cần Giờ
giới hạn bởi các đoạn sông, rạch, tắc: sông Soài Rạp, sông Vàm Sát- rạch Đôn-
tắc An Nghĩa- sông Lòng tàu, tắc Rổi- sông Đồng Tranh- tắc Nước Hội- sông Thị Vải- sông Gò Gia-
sông Cái Mép và biển Đông, từ bắc xuống Nam dài 28km, từ Đông sang Tây dài 30km.
Thổ nhưỡng phát triển trên một đầm mặn mới, do phù sa sông Sài Gòn và sông Đồng Nai mang
đến và lắng đọng tạo thành nền đất. Đất Cần Giờ được cấu tạo bởi quá trình trầm tích sét, quá trình
phè
n hoá và quá trình nhiễm mặn.
lớn nhất khi
triều cường và nhỏ nhất khi triều kém, nước mặn xâm nhập sâu vào tháng 4 và bị đẩy xa vào tháng 9
và tháng 10.
* Khu hệ thực vật
Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ có trên 150 loài TV, các loài chủ yếu như bần trắng, mấm
trắng, các quần hợp đước đôi - bần trắng cùng sú, ổi, trang, đưng v.v… và các loại nước lợ như bần
chua, các quần hợp mái dầm – ô rô, dừa lá, ráng, v.v… Thảm cỏ biển với các loài ưu thế Halophyla
sp., Hal
odule sp., và Thalassia sp.; đất canh tác nông nghiệp với lúa, khoai mỡ, các loại đậu, dừa
v.v…; các vườn cây ăn trái. [34]
* Khu hệ động vật
Theo khảo sát sơ bộ của dự án khả thi khu bảo tồn tự nhiên RNM Cần Giờ năm 1999, kết quả:
+ Khu hệ ĐV thuỷ sinh không xương sống trên cạn có 9 loài lưỡng thê, 31 loài bò sát, 4 loài
hữu nhũ. Trong đó có 11 loài bò sát có tên trong sách đỏ Việt Nam như: tắc kè (gekko gekko), kỳ đà
nước (var
anus salvator), trăn đất (python molurus), trăn gấm (python reticulatus), rắn cạp nong
(bungarus fasciatus), rắn hổ mang (naja naja), rắn hổ chúa (ophiophagus hannah), vích (chelonia
mydas), cá sấu hoa cà (crocodylus porosus)…
[34]
+ Khu hệ chim có khoảng 130 loài thuộc 47 họ, 17 bộ. Trong đó có 51 loài chim nước và 79 loài
không phải chim nước sống trong nhiều sinh cảnh khác nhau.
[35]
Phân vùng khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ: Tổng diện tích Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần
Giờ là 75.740 ha, trong đó: vùng lõi 4.721 ha, vùng đệm 41.139 ha, và vùng chuyển tiếp 29.880 ha.
Bacidiomycetes và Deuteromycetes. Người ta đã tìm thấy 6 chi nấm có mặt trên lá cây Đước đỏ (R.
mangle): Cladosporium, Pestalotia, Alternaria, Zygosporium, Penicillium và Aureobacidium.
[34]
Các chi nấm ký sinh và hoại sinh sống trên lá cây ngập mặn thường gây bệnh cho các cây chủ
như: Pestalotia, Phyllosticta, Cladosporium, Nigrospora và Cercospora. Hầu hết các loài nấm trên đất
liền đều có trên lá cây ngập mặn, còn các loài nấm biển thì có trên rễ hoặc phần gỗ ngâm trong nước
mặn.
Khi cây chết thì gỗ phân huỷ tạo điều kiện thuận lợi cho các loại nấm phân huỷ phát triển. Các
mẫu gỗ để ngâm trong nước biển có tỉ lệ phân huỷ cao hơn những vùng chỉ ngập khi triều cao. [34]
Nấm trong đất RNM có thể phân ra các loại nấm ở trong đất và loại nấm sống trên các mảnh vụn
lá trên mặt đất. Cả hai loại này đều phụ thuộc vào lượng chất hữu cơ có trên bề mặt và trong đất.
Một vài loài, đặc biệt là Aspergillus candidus cho thấy khả năng tạo ra các hợp chất phos
phate
tan từ các chất phosphorus không tan cho các SV khác sử dụng. Vì vậy, những nấm này đóng vai trò
tạo chất dinh dưỡng trong HST (Prabhakaran et al., 1987). [41]
Đối với lá cây ngập mặn thì nấm là SV phân huỷ đầu tiên, nhờ khả năng phân giải cellulose và
lignin. Đa số các loại nấm được phân lập trên lá, gỗ và cây con thường là nấm hoại sinh góp phần phân
huỷ xác TV. Chúng cũng góp phần phân huỷ cỏ biển, bùn và đầm lầy mặn. [46]
Nấm đóng một vai trò rất quan trọng trong HST. Cùng với VK, nấm là SV phân hủy chính ở hầu
hết các HST. Bởi vậy, nấm sợi
có vai trò quan trọng các chu trình sinh địa hóa ở nhiều lưới thức ăn.
Khi sống hoại sinh ha
y cộng sinh, chúng phân hủy những vật chất hữu cơ thành những phân tử vô cơ,
rồi sau đó những chất này sẽ được đồng hóa ở TV hay những S
V khác. [46]
RNM
cung cấp chất hữu cơ để tăng năng suất cho vùng ven biển, là nơi sinh sản hoặc ươm nuôi
của nhiều loài hải sản có giá trị kinh tế cao như tôm, cua, cá,…
Mặt khác, RNM còn có tác dụng làm chậm dòng chảy và phát tán rộng nước triều, làm giảm
mạnh độ cao của sóng khi triều cường. Hạn chế tác hại của sóng thần và bão lớn, hạn chế xâm nhập
mặn và bảo vệ nước ngầm. RNM bảo vệ đa dạng sinh học, điều chỉnh nồng độ muối của MT, làm sạch
MT nước khi có lũ lụt, lũ quét, sạt lở đất.[4][18]
1.2
Sơ lược về nấm sợi
1.2.1 Phân loại của nấm sợi
Nấm phân bố trên toàn thế giới và phát triển ở nhiều dạng MT sống khác nhau, kể cả sa mạc. Đa
phần nấm sống ở trên cạn, nhưng một số loài lại chỉ tìm thấy ở MT nước. Nấm
và VK là những SV
phâ
n huỷ chính, có vai trò quan trọng đối với các HST trên cạn. Dựa theo tỉ lệ giữa số loài nấm với số
loài TV ở trong cùng một MT, người ta ước tính giới Nấm có khoảng 1,5 triệu loài. [38]
Theo G.C.Ainsworth (1973): Hệ thống của giới nấm bao gồm hai ngành: Myxomycota và
Eumycota. Eumycota bao gồm 5 ngành phụ: Mastigomycotina, Deuteromycotina, Zygomycotina,
Ascomycotina và Basidiomycotina [49]
Ngành phụ Deuteromycotina được chia
theo 3 lớp: [50
]
+ Khuẩn ty không phát triển hoặc phát triển yếu; dạng cơ thể giống như nấm men và có sự nảy
chồi: Blastomycetes
+ Khuẩn ty thật, không nảy chồi; sợi nấm bất dục hoặc sinh BT trên cuống, không có sự tập
trung thành túi BT hay cụm cuống BT: Hyphomycetes
+ Khuẩn ty thật, BT tập trung trong túi BT hoặc trên cụm cuống BT: Coelomycetes
Lớp Hyphomycetes được chia thành 3 bộ: Moniliales, Melanconiales và Sphaeropsidales. Có
nh 0,2µm (Woronin body), thể Chitô đường kính 40-70nm(chitosome)… Ngoài ra
trong tế bào chất còn có các vi quản rỗng ruột, đường kính 25nm (microtubule), các vi sợi đường kính
5-8nm (microfilament), các thể màng biên (plasmalemmasome) (xem hình 1b).
[50] Ribosome của nấm thuộc loại 80S (S là đơn vị hệ số lắng Svedberg) có đường kính khoảng
20-25nm, gồm 2 tiểu phần: tiểu phần lớn 60S và tiểu phần nhỏ 40S
[51]
Phần lớn sợi nấm có dạng trong suốt, ở một số nấm có sợi mang sắc tố tạo nên màu tối hay màu
sặc sỡ. Sắc tố của một số nấm còn tiết ra ngoài MT và làm đổi màu khu vực có nấm phát triển. Một số
nấm còn tiết ra các chất hữu cơ tạo nên các tinh thể trên bề mặt KL. Vì BT của nấm thường cũng có
màu nên cả KL thường có màu.
Các nấm bậc thấp thường có sợi nấm không vách ngăn. Ngược lại, các nấm bậc cao thường
mang sợi nấm có vách ngăn (xem hình 2). Sợi nấm không vách ngăn mang nhiều nhân nhưng vẫn có
thể gọi là đơn bào. Ở các nấm không vách ngăn thì vách ngăn vẫn có thể hình thành khi cơ thể sinh
sản, tại các bộ phận bị thương tổn sợi nấm
cũng có thể hình thành vách ngăn. Đó là loại vách ngăn liền,
không có lỗ thủng, có tác dụng bảo vệ cơ thể. [5]
Sợi nấm có vách ngăn là cơ thể đa bào. Mỗi tế bào có 1 nhân hoặc nhiều nhân. Tuy nhiên, sợi
nấm vẫn không phải do nhiều tế bào hợp thành mà là do các vách ngăn tách sợi nấm ra thành nhiều tế
bào.
các ezim ngoại bào có chức năng phân giải xác động thực vật là thành phần hữu cơ chính của RNM,
các chất KS và các độc tố giúp làm
tăng khả năng ĐK của nấm sợi trong quá trình cạnh tranh ở MT
sống. Gần đây, người ta phát hiện ra nấm biển và nấm sợi RNM là nguồn VSV có tiềm năng sinh các
chất KS mới, chống lại các VSV nhờn thuốc.
Sống trong MT biến động, MT chịu ảnh hưởng của chất thải từ đất liền, ô nhiễm do tràn
dầu…đã tạo cho các nấm sợi RNM có những cơ chế phản ứng lại với những tác động này, bằng khả
năng phân giải những chất thải độc hại nhờ sinh tổng hợp được hệ enzim
phân giải.
RNM là một HST chịu nhiều tác động của gió bão. Sau những tác động trên, vấn đề ô nhiễm là
điều không thể tránh khỏi, nhất là ô nhiễm VSV gây bệnh [13]. Nhờ có những đặc tính sinh học đáng
quí như khả năng sinh ra các sản phẩm
giúp khống chế VSV có hại. Từ đó, có thể cải thiện MT sống
cũng như giúp con người nâng cao khả năng điều trị bệnh tật.
Đa số các nấm sợi RNM đều có khả năng chịu mặn cao. Chúng có thể sinh trưởng ở nồng độ
muối từ 2% - 20%. Thậm chí, một số nấm sợi RNM còn có thể sinh trưởng ở nồng độ muối 30% [13].
Đây là một đặc điểm rất có ý nghĩa sinh thái đối với RNM.
Nấm sợi ở RNM c
ó những đặc tính sinh học rất đáng quí cần được khai thác nhằm phục vụ nhu
cầu và lợi ích của con người. Tuy nhiên, những nghiên cứu về nấm sợi RNM còn rất khiêm tốn, chưa
tương xứng với qui mô và tiềm năng của chúng,
1.2.4 Tình hình nghiên cứu nấm sợi RNM trên thế giới và Việt Nam
Hiện nay, có khoảng 800 – 1000 loài nấm biển được định loại (Hawkswworth et al.,
1995;
Jones, 1995), trong khi đó có một số lượng lớn các loài nấm trên đất liền đã được phân loại. Sự hiểu
biết của loài người về nấm RNM và vai trò của chúng đối với khu HST này còn quá ít và chưa đầy đủ
(Agate A.D., Subramania, C.V và Anuci, V.1998). Sự nghiên cứu về nấm RNM mới chỉ được các nhà
nấm học quan tâm từ năm 1950.
Theo cơ sở dữ liệu (chưa đầy đủ) của mạng nấm RNM toàn cầu có thể thấy nhiều nước đã và
đang tích cực nghiên cứu phân l
Bên cạnh đó, công trình nghiên cứu của Phạm Thị Thanh Thuý (2007) đã tuyển chọn được các
chủng nấm sợi có khả năng phân giải dầu, góp phần làm
phong phú thêm nhóm VSV phân giải dầu, xử
lý ô nhiễm MT dầu ngày nay.[30]
Nấm sợi RNM có vai trò lớn đối với việc làm sạch MT sống với việc
phân giải các chất độc hại trong MT như dầu mỏ, các chất hóa học có cấu trúc mạch vòng [13]. Bên
cạnh vai trò làm sạch MT sống nói chung, nấm sợi RNM còn có vai trò làm sạch MT sinh vật với chức
năng là tác nhân kiểm soát sinh học hữu hiệu trong việc giữ cân bằng sinh thái.
Ngoài ra, nghiên cứu của Phan Thanh Phương (2007) đã tuyển chọn được các chủng có hoạt tính
ĐK với
VSV gây bệnh, hoạt tính phân giải phốt phát khó tan, lại thêm hoạt tính chịu mặn. Điều này, có
ý nghĩa hết sức quan trọng trong chu trình photpho của RNM Cần Giờ. [27]
1.3 Đặc điểm của Aspergillus
1.3.1 Vị trí phân loại của chi Aspergillus trong các hệ thống phân loại nấm
- Năm 1729 P. A. Micheli lần đầu tiên mô tả chi Aspergillus (Maren. A. Klich, 2002).
- Năm 1900, Lindau lại xếp Aspergillus vào trật tự:
Lớp (Class) : Fungi imperfect
Bộ (Order): Hyphomycetes
Họ (Family): Mucedinaceae
Họ phụ (Subfamily): Aspergillaceae
Chi (Genus): Aspergillus
- Năm 1950, Bessey đã xếp Aspergillus vào hai lớp khác nhau:
Lớp 1 (Class): Ascomycetes Lớp 2 (Class): Ascomycetes
Bộ (Order): Aspergillaces Bộ (Order): Moniliales (Hyphomycetes)
Họ (Family): Aspergillaceae Họ (Family): Moniliaceae
Chi (Genus): Eurotium Chi (Genus): Aspergillus
- Năm 1962, Alexopoulos trong cuốn “Introductory Mycology” đã xếp Aspergillus vào hai lớp:
Ascomycetes (khi người ta tìm thấy hình thức sinh sản của nó) và vào Form class: Deuteromycetes (ở
Bộ máy mang BTT phát triển từ một tế bào có đường kính lớn hơn, màng dày hơn các đoạn lân
cận của sợi nấm (tế bào chân – foot cell). Gíá BTT phát triển từ tế bào chân, như là một nhánh của sợi
nấm, gần thẳng gốc với trục của tế bào chân và thường ở trên mặt cơ chất (Hình1.3). Giá BTT không
có nhánh, không có hoặc có ít vách ngang, có phần đỉnh to ra thành bọng hình chùy ( Hình 1.4k), hình
quả bầu (Hình 1.4b ,d, g), hình bàn trang (phần đỉnh bọng giá thẳng-Hì
nh 1.4a, c, e) hình nửa cầu
(Hình 1.4l, m…) hoặc hình cầu (Hình 1.4q), bọng này mang các thể bình. Các thể bình này hoặc song
song và hợp thành cụm ở phần đỉnh bọng, hoặc xếp thành hình tia sát nhau trên toàn bộ bề mặt bọng.
[6]
loài thuộc chi Aspergillus Mich. Ex Fr.
[6]
a- A. conicus Blochw; b- A. clavatus Desm; c- A. nidulans (Eid); d- A. fumigatus Fres; e- A.
sersicolor (Vuill); g- A.malinus Lindt; h- A.sydowi (Bain.et Sart) Thom et Church; i- A.niveus Blochw; k-
A.vảaans Wehm; l- A.glaucus Link; ; m- A.citrispóu Hohn; n- A.terreus Thom; o- luchuensis Inui; p- A.
ustus
(Bain) Thom et Church, q- A.sulphureus (Fres) Thon et Church ( M.A.Litimov 1967)
Thể bình hoặc chỉ có một tầng hoặc hai tầng. Trong trường hợp sau, mỗi thể bình cấp một (cũng
gọi là cuống thể bình, metula) mang một cụm gồm hai hoặc ba (hoặc nhiều hơn) thể bình cấp hai (gọi
là thể bình) ở phần đỉnh. Các BTT được tạo thành nối tiếp nhau trong miệng thể bình, thành chuỗi
hướng góc (BT ở ngay miệng thể bình là BT non nhất, càng xa miệng thể bình càng già), không phân
nhánh.
[6]
BTT không vách ngăn, thay đổi về hình dạng, kích thước, màu sắc, dấu vết ở mặt ngoài (nhẵn,
có gai, có nốt sần) tuỳ từng loài. Tất cả các chuỗi BTT tạo thành từ các thể bình của một bọng đỉnh giá
hợp thành khối BTT đỉnh bọng – bông nấm (conidial head). Khối BTT đỉnh bọng có thể có các dạng
hình cột (các chuỗi BTT song song, sát nhau), hình cầu hoặc hình tia toả tròn. Một số loài có BT túi
(ascosporum) trong các thể quả kín (cleitothecium). [6]
1.3.3 Các chất có hoạt tính sinh học của Aspegillus
Nhiều loài thuộc chi Aspergillus phâ
n bố rộng rải trên các cơ chất tự nhiên, trong các sản phẩm
công nông nghệp, ở nhiều vùng địa lý khác nhau trên thế giới. Một số loài, đặc biệt là A. oryzae đã
được dùng rộng rãi trong công nghệ lên men truyền thống để chế biến thực phẩm ở nhiều nước châu Á
như Việt Nam (làm tương), Trung Quốc, Nhật Bản, Indonexia, Philipin…
Hiện nay, công nghệ sinh học sử dụng một số loài thuộc chi As
pergillus chủ yếu là các loài A.
niger, A. oryzae trong CN sản xuất enzym (amylaza, glucoamylaza, pectinaza, proteaza, cellulaza),
Chi Penicillium do Link mô tả đầu tiên năm 1809 với 3 loài: P. camdidum, P. expansum và P.
glaucum. Vị trí phân loại của Penicillium được thay đổi theo tiến trình lịch sử như sau:
- Theo hệ thống phân loại hình thái của Saccardo, năm 1886 :
Lớp: Nấm bất toàn (Deuteromycetes)
Bộ : Moniliales.
Họ: Moniliaceae.
Chi: Penicilium.
- Theo Fischer (1897):
Lớp (Class): Ascomycetes
Bộ (Order): Plectasciales
Họ (Family): Penicilliaceae
Chi (Genus): Penicillium
- Năm 1953 Hughes xếp Penicillium vào tổ chi VI (Section VI), nhóm Hyphomycetes trong hệ
thống phân loại nhóm
Hyphomycetes.
[6]
- Năm 1972, 1977 Bùi Xuân Đồng xếp Pencillium theo hệ thống sau:
Ngành (Division): Mycota
Ngành phụ (Sub-Division): Deuteromycotina
Lớp (Class): Hyphomycetes
Lớp phụ (Sub-Class): Euhyphomycetidae
Tổ chi (Section): Phialoconidiae
Chi (Genus): Penicillim [6]
-Theo hệ thống phân loại của G. C Ainsworth, năm 1973:
Ngành (Phylum): Eumycota (Eumycetes)
Ngành phụ (Subdivision): Deuteromycotina
Lớp (Class): Hyphomycetes
Bộ (Order): Moniliales
* Trường hợp các giá BTT mang một hoặc nhiều nhánh (branch) ở phần ngọn giá, sau đó các
nhánh mang các cuống thể bình và các cuống thể bình lại mang các thể bình cũng được coi là cấu tạo
hai vòng. (Hình 1.5b)
Khi các cuống thể bình xếp đều đặn và sát nhau trên ngọn giá, cấu tạo hai vòng đó được gọi là
cấu tạo hai vòng đối xứng, trường hợp các cuống thể bình xếp không đều trên phần ngọn giá hoặc có
nhánh, cấu tạo này đư
ợc gọi là cấu tạo hai vòng không đối xứng.
[6]
* Trường hợp giá BTT mang nhiều nhánh và các nhánh này cùng với các cuống thể bình, các
thể bình xếp đều đặn và sát nhau, bộ máy mang BTT có cấu tạo nhiều vòng (polyverticillate).
Giá BTT có thể phát triển từ các sợi nấm nằm sát cơ chất, sát mặt MT thạch nuôi cấy (các sợi
nền), khi đó thường có chiều dài đều nhau, và KL có dạng mặt nhung. Giá BTT có thể là nhánh của các
sợi nấm khí sinh, KL trong trường hợp này có dạng len hoặc xốp bông (lanate, floccose). Trường hợp
Nhaùnh
Hình 1.5: Chi Penicillium Link ex Pries. Các thành phần của chổi [7]
(a) (b)
các giá BTT là các nhánh của các bó sợi hoặc bản thân chúng tụ họp lại với nhau thành các bó giá, KL
đặc trưng bởi sự có mặt của các bó sợi (funiculose) hoặc của các bó giá (fasciculase).
[6]
BT (ascus) đơn độc hoặc thành chuỗi, BT túi không ngăn vách, có hoặc không có rãnh và gờ quĩ đạo.
[6]
1.4.3 Các chất có hoạt tính sinh học của Penicillium
Nhiều loài thuộc chi Penicillium được dùng trong công nghệ KS. Trong CN sản xuất KS hiện
nay, một số chủng đã xử lý đột biến của P. chrysogenum có thể dùng để sản xuất penicillin tự nhiên
(penicillin G, penicillin V…) và axit 6- aminopenycillamic (dùng để sản xuất các penicillin bán tổng
hợp như ampicillin, oxacillin…).[6]
Hình 1.6: Chi Penicillium Link ex Fries. Các kiểu thể bình.
a- Thể bình có phần cổ rộng ở P. expansum Link và nhiều loài, b- Thể bình có phần cổ hẹp ở P.
janthinellum Biourge và các loài lân cận, c- Thể bình hình mác ở P. funicolusum Thom và một số loài
thu
ộc nhóm loài Biverticillata-Symmetrica (Raper và Thom, 1949)
a
b
c
Ngoài ra một số loài khác thuộc chi Pencillium được dùng trong CN chế biến thực phẩm như
CN sản xuất phomat (P. roqueforti). Nhiều loài cũng đã được nghiên cứu khà năng tạo thành các axit
hữu cơ, về các hoạt tính enzim và một số sản phẩm trao đổi chất khác.
[6]
Trong chi Penicillium cần lưu ý môt số loài có khả năng tạo thành mycotoxin, đặc biệt các
mycotoxin có khả năng gây ung thư gan như các loài P.islandicum tạo thành độc tố islandotoxin và
luteoskyrin, loài P.urticae tạo thành patulin… [6]
Aspergillus và Penicillium có vai trò to lớn trong thiên nhiên cũng như đối với đời sống con
người. Việc nghiên cứu về hai chi này góp phần đánh giá sự đa dạng về về thành phần loài và số lượng
loài. Đồng thời, góp phần quan trọng trong việc xác định các loài có khả năng sinh các chất sinh học
quý như KS, enzim và các chất hoạt tính sinh
học khác.
L
L
I
I
Ệ
Ệ
U
UV
V
À
ÀP
P
H
H
Ư
Ư
Ơ
Ơ
N
N
G
G
.7H
2
O, (Trung Quốc).
- Yeast extract (Mỹ), CMC (Nhật), Malt extract (Đức), pepton (Anh), casein, Agar ( Việt Nam).
- Thuốc thử: lugol, HgCl
2
.
- Thuốc nhuộm: Lactophenol
- Chất KS: Cloramphenycol (Ấn Độ)
2.1.3 Thiết bị, dụng cụ
Các thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu đề tài là những thiết bị chuyên dùng trong thí
nghiệm vi sinh.
- Nồi hấp cao áp Huxley (Đài Loan)
- Tủ sấy Memmert (Đức)
- Kính hiển vi quang học, máy chụp hình kỷ thuật số Olympus 5.1 (Nhật)
- Máy đo pH Pometer KL-009 (II) (Trung Quốc)
- Kính lúp soi nổi (Nhật Bản
)
-
Tủ cấy vô trùng (Việt nam)
- Tủ lạnh (National - Nhật)
- Tủ giữ mẫu (Sanyo - Nhật).
- Máy lắc (Gerhardt - Đức)
-
Cân phân tích ( Sartorius - Đức)
4
.7H
2
O 0,1g (vết)
Agar 20g
Nước biển 1000ml, pH=6,5-7
Để thử hoạt tính enzym amilaza, cellulaza ta dùng các cơ chất tương ứng là tinh bột, CMC thay
đường glucose với hàm lượng tương đương 10g. Riêng hoạt tính enzym proteaza thì môi trường trên
thay 3,5g NaNO
3
bởi 10g casein
MT3: Meat peptone agar (MPA): Dùng để nuôi cấy giữ giống VSVKĐ [10]
Pepton 5g
NaCl 5g
Cao thịt 5g
Agar 20g
Nước cất 1000ml, pH = 7,5
MT4: Malt Extract Agar (MEA): Dùng để phân loại nấm sợi. Khi nuôi nấm sợi để thử hoạt tính
KS thì MT này sẽ thay nước biển bởi nước cất với lượng tương đương.
Malt Extract 20g
Pepton 1g
Glucose 20g
Agar 20g
Nước biển 1000ml
pH = 5,6
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Các phương pháp vi sinh vật
2.2.1.1 Phương pháp lấy mẫu
Chúng tôi phân lập các chủng nấm sợi từ các mẫu lá vàng trên cành (
Ký hiệu là L), lá mục
-6
.
Nhỏ 0,1ml (2giọt) dung dịch ở mỗi nồng độ lên hộp petri có chứa môi trường (MT2). Dùng que
trang trải đều khắp trên mặt thạch, giữ nguyên que trang tiếp tục sang đĩa MT 2 và 3. Sau đó, ủ các đĩa
ở nhiệt độ phòng từ 3-7 ngày.
Tách các KL riêng rẽ và cấy chuyền cho đến khi thu được giống thuần khiết. Cuối cùng, cấy
giống sang ống thạch nghiêng để bảo quản và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của nấm sợi.[32]
[43]
c. Yêu cầu
Các chủng phân lập phải đạt độ thuần khiết và được kí hiệu để nhận biết.
2.2.1.3 Giữ giống trên MT thạch có lớp dầu khoáng
a. Nguyên tắc: Bảo quản để không làm thay đổi phẩm chất ban đầu của giống. Tạo MT yếm khí
bằng dầu khoáng để ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm sợi.
b. Tiến hành
Cho một lượng dầu khoáng (như paraffin lỏng hay vazơl
in) vào ống eppendofy, khử trùng bằng
cách hấp ở 121
0
C trong 30 phút, để nguội.
Nấm sợi cần bảo quản được nuôi cấy từ 3 đến 5 ngày. Dùng que cấy vô trùng lấy một lượng BT
cho vào ống eppendofy, đậy nắp và dùng keo parafin quấn quanh miệng ống và bảo quản ở điều kiện
lạnh.[32]
2.2.1.4 Quan sát hình thái nấm sợi
* Quan sát đại thể nấm sợi
Nấm sợi sau khi cấy chuyền sang thạch nghiêng, ta tiến hành tạo KL khổng lồ theo các bước sau:
- Cho vào ống nghiệm 5 ml nước biển vô trùng.
- Dùng que cấy lấy một ít BT từ ống giống thạch nghiêng cho vào ống nghiệm chứa 5ml nước cất
vô trùng, lắc đều tạo dung dịch huyền phù.
2.2.1.5 Kiểm tra hoạt tín
h enzym ngoại bào của nấm sợi bằng phương pháp khuếch tán
trên MT thạch [5] [32]
a. Nguyên tắc
Thuốc thử phản ứng với cơ chất tạo màu đặc trưng, còn phần cơ chất bị nấm sợi phân huỷ sẽ
không tạo màu mà tạo vòng trong suốt quanh KL.
b. Thực hiện
* Phương pháp cấy chấm điểm
Chuẩn bị các chủng nấm sợi nghiên cứu và các MT thích hợp.
Cấy chấm điểm các chủng nấm sợi đã nghiên cứu (ba điểm trong một hộp petri) lên MT thử
hoạt tính tương ứng (MT2).
Giữ các hộp petri này trong tủ ấm 28
0
C – 30
0
C, trong 4-5 ngày.
c. Kiểm tra kết quả
Kiểm tra hoạt tính enzym bằng thuốc thử tương ứng:
+ Kiểm tra hoạt tính proteaza: đổ dung dịch thuốc thử 10% HgCl
2
lên bề mặt MT nuôi cấy, nếu
nấm sợi sinh ra proteaza sẽ có một vòng trong suốt quanh KL (cấy chấm điểm) do các phân tử protein
bị phân giải không còn phản ứng kết tủa với HgCl
2
. Các phân tử protein chưa bị phân giải có màu
trắng đục.
+ Kiểm tra hoạt tính cellulase, amylase. Cả hai loại enzym này đều dùng thuốc thử lugol nhỏ
lên bề mặt thạch:
* Nếu nấm sợi có hoạt tính cellulase sẽ tạo vòng trong suốt quanh KL. Vùng cellulose chưa bị
phân giải có màu tím hồng nhạt.
n bề mặt các MT nghiên cứu có các nồng độ muối
khác nhau.
Nuôi trong tủ ấm 3 ngày, ở 28
0
– 30
0
C. Mẫu đối chứng nuôi trên MT không NaCl.
c. Kết quả
Dựa vào đường kính KL d (mm) của các chủng nấm sợi nghiên cứu để đánh giá ảnh hưởng của
độ mặn lên khả năng sinh trưởng.
Thử hoạt tính enzim ngoại bào theo phương pháp 2.2.1.5 và hoạt tính ĐK theo phương pháp
2.2.1.6 ứng với từng nồng độ muối.
2.2 Phương pháp toán học
Xử lí số liệu bằng toán thống kê đơn giản
- Phương pháp tính giá trị trung bì
nh
:
Giá trị trung bình n lần thí nghiệm.
X
i
: Giá trị lần thí nghiệm thứ i
n : Số lần lặp lại thí nghiệm
- Phương pháp tính khoảng ước lượng
Trong đó:
t
α
I
I
I
I
I
:
:K
K
Ế
Ế
T
TQ
Q
U
U
Ả
ẢV
V
À
À
Hình 3.1: Bản đồ xác định các vị trí lấy mẫu đợt 1
- Chúng tôi dùng máy GPF định vị vệ tinh toàn cầu để xác định toạ độ của 4 xã như sau:
* Tam Thôn Hiệp: 10
0
35
’
17.14
’’
N
106
0
49
’
26.54
’’
E
* An Thới Đông: 10
0
34
’
’’
N
106
0
52
’
07.45
’’
E
Qua 3 đợt lấy mẫu chúng tôi phân lập được 476 chủng nấm sợi. Trong đó, đợt 1 phân lập được
129 chủng (chiếm 27,10%) , đợt 2 được 191 chủng (40,13%), đợt 3 được 156 chủng (32,77%).
Copyright: Tài liệu đại học ©