20

Đồng nhất và pha loãng
mẫu: 1 g mẫu + 9 ml dd NaCl 9
0
/
00
Lần lượt pha loãng được
các nồng độ tiếp theo ủ ở 37
0
C/ 24h Sơ đồ 3.1: Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất

3.4.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập đƣợc
Quan sát hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi.
Lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ ống TSA làm tiêu bản nhuộm Gram để quan

Sơ đồ 3.2: Định danh vi khuẩn Bacillus subtilis (Nguyễn Ngọc Thanh Xuân, 2006)
3.4.2. Các thí nghiệm về vi khuẩn Bacillus subtilis
3.4.2.1. Ảnh hƣởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh
enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis
 Mục đích: xác định thời gian và chế độ nào phù hợp nhất.
Bảng 3. 1: Bố trí thí nghiệm 1

Chế độ sục
Thời khí
gian
Lô1: sục khí liên tục
Lô 2: không sục khí
Hoạt độ
amylase
Hoạt độ
protease
Hoạt độ
amylase
Hoạt độ
protease
24 giờ

48 giờ


 Cách làm:
Cấy vi khuẩn từ các ống giống vào các ống nghiệm chứa 4 - 5 ml nước
muối sinh lí đã hấp khử trùng, đem đo độ đục.
Sau đó chuyển vi khuẩn từ các ống nghiệm vào 4 loại môi trường thử
nghiệm: Rỉ đường + 2% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột, TSB + 1% tinh bột, rỉ
đường + 1% tinh bột + 0,5% pepton với các điều kiện khảo sát:
Nhiệt độ: nhiệt độ phòng
Tỉ lệ giống 3%
pH = 6
Thời gian nuôi cấy và chế độ được chọn theo kết quả thí nghiệm 1.
Sau đó tiến hành kiểm tra hoạt độ enzyme amylase và protease.
Thí nghiệm được lặp lại 2 lần.
Phương pháp kiểm tra hoạt độ enzyme:
Kiểm tra hoạt độ enzyme amylase bằng phương pháp Wolhgemuth.
Kiểm tra hoạt độ enzyme protease bằng phương pháp Gross + Fluld.

23
Sau khi kiểm tra hoạt độ enzyme trên từng loại môi trường, tiến hành chọn
môi trường nuôi cấy thích hợp để làm thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 3. 2: Bố trí thí nghiệm 2 Môi trƣờng
Hoạt độ enzyme
amylase 24
3.4.2.3. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sự sản xuất enzyme
của các chủng Bacillus subtilis
 Mục đích: xác định pH và thời gian nuôi cấy thích hợp với các chủng đã chọn ở
thí nghiệm 1.
 Cách làm:
Cấy vi khuẩn từ các ống giống vào các ống nghiệm chứa 4 - 5 ml nước
muối sinh lí đã hấp khử trùng, đem đo độ đục.
Sau đó chuyển vi khuẩn từ các ống nghiệm vào môi trường đã chọn ở thí
nghiệm 2 ở các pH và thời gian khác nhau với tỉ lệ 3% và nuôi cấy ở chế độ đã chọn
ở thí nghiệm 1.
Kiểm tra hoạt độ amylase và protease (thí nghiệm được lập lại 2 lần).
Bảng 3. 3: Bố trí thí nghiệm 3

pH
6,0
7,0
Hoạt độ enzyme


3.4.3.2. Kiểm tra chế phẩm trong thời gian bảo quản
Chế phẩm được kiểm tra hoạt độ enzyme ở các khoảng thời gian: 10 ngày,
20 ngày, 30 ngày theo hai chế độ bảo quản: 4 - 10
0
C và nhiệt độ phòng.

Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm thống kê Statgraphic 7.0.

Sấy khô chế phẩm ở nhiệt độ 40 – 50
0
C
Các giống vi khuẩn đã chọn ở thí nghiệm 1
Môi trường nhân giống: môi trường TSB với điều kiện nuôi cấy đã chọn
Môi trường sản xuất: cám gạo
Kiểm tra hoạt độ enzyme protease và amylase
Thời gian 48h, nhiệt độ 37
0
C

Thu hoạch
chế phẩm


4.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn nghi ngờ là
Bacillus subtilis
Các chủng phân lập có đặc điểm hình thái phù hợp với Bacillus subtilis
được chọn làm một số phản ứng sinh hóa để khẳng định. Kết quả được trình bày ở
bảng 4.1.
Sau khi thử phản ứng sinh hóa của 21 chủng nghi ngờ, chúng tôi xác định
được 10 chủng là vi khuẩn Bacillus subtilis. Tiếp tục chúng tôi tiến hành các thí
nghiệm khảo sát khả năng sinh enzyme amylase và protease trong những môi
trường và điều kiện nuôi cấy khác nhau của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis
phân lập được. 28

Bảng 4. 1: Kết quả thử phản ứng sinh hóa của các chủng phân lập

Ghi chú: (+) là phản ứng dương tính
(-) là phản ứng âm tính

Chủng
phân lập
Các phản ứng sinh hóa
Catalase
Lecithinase
Nitrate
Citrate
MR - VP
Maltose
1

+
+
+
+
6
+

+
+
+
+
7
+

+
+
+
+
8
+

+
+
+
+
9
+

+
+

14
+

+
+

+
15
+

+

+
+
16
+

+

+
+
17
+

+

+
+
18
+

Các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được đánh số thứ tự từ 1 đến 10.
Các chủng vi khuẩn phân lập được nuôi cấy trong môi trường TSB ở hai
chế độ sục khí và không sục khí với thời gian khảo sát là 24 giờ, 48 giờ, nhiệt độ
phòng, pH = 7, chúng tôi tiến hành theo dõi chỉ tiêu về khả năng sinh enzyme
amylase và protease với kết quả như sau:
Bảng 4.2: Kết quả thí nghiệm 1 (Bảng phụ lục 1 và 2)

Chế độ sục khí

Thời gian
Lô 1: sục khí liên tục
(n = 18)
Lô 2: không sục khí
(n = 18)
Hoạt độ
amylase
(W
0
/ml)
Hoạt độ
protease
(Hdp/ml)
Hoạt độ
amylase
(W
0
/ml)
Hoạt độ
protease
(Hdp/ml)