10
2.3.1.4. Sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật
Khi nuôi vi sinh vật tạo amylase có hai quá trình liên quan mật thiết với
nhau: quá trình tổng hợp sinh khối vi sinh vật và quá trình tích tụ enzyme trong tế
bào hay ngoài môi trường.
Amylase của Bacillus subtilis được tạo thành ở vi khuẩn trong giai đoạn đã
hoặc đang kết thúc quá trình sinh trưởng. Cả trong môi trường nuôi cấy lẫn trong
bản thân tế bào vi khuẩn “ trẻ ” đều không tìm thấy amylase. Amylase ngoại bào
được tổng hợp ở tế bào đang chuyển sang thời kỳ tự phân.
2.3.1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp amylase
 Ảnh hưởng của thành phần môi trường:
Ảnh hưởng của nguồn cacbon dinh dưỡng: Các nguồn cacbon và năng
lượng dễ hấp thu có tác dụng kiềm hãm sinh tổng hợp amylase (nồng độ tinh bột tối
thích trong nuôi cấy chìm là 0,5 – 0,7%). Để có hoạt lực α–amylase cao cần 6% tinh
bột, oligo – 1,6 – glucozidase cần 2% tinh bột.
Ảnh hưởng của nguồn nitơ dinh dưỡng: Cho nguồn nitơ nhất định vào môi
trường có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác.
Nguồn nitơ hữu cơ: gelatin, casein, nước chiết ngô.
Ảnh hưởng của acid amin: Acid amin có ảnh hưởng tốt tới sinh lí của vi
sinh vật tạo enzyme amylase do: acid amin có thể đồng thời vừa là nguồn cacbon,
nitơ, vừa là nguồn năng lượng; một số acid amin riêng rẽ đóng vai trò quan trọng
trong sinh tổng hợp nhiều acid amin khác và trong quá trình chuyển hoá amin.
Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng: Các nguyên tố đa lượng và vi
lượng có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và tổng hợp các enzyme amylase của vi
sinh vật.
Mg
2+
ảnh hưởng đến độ bền của enzyme.
Photpho ảnh hưởng trực tiếp đến sinh sản của nấm mốc và của vi sinh vật khác.
Ca

nghiệp, y học.
Các loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease như: Bacillus subtilis,
Bacillus cereus, xạ khuẩn: Streptomyces griseus, Streptomyces rimosus,…và một số
loài nấm mốc: Aspergillus oryzae, Aspergillus niger… (Nguyễn Đức Lượng, 2004).

12
2.3.2.2. Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật
Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một nòi vi
sinh vật cũng có thể khác nhau về tính chất. Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt
động thích hợp, … các nhà khoa học đã phân loại các protease vi sinh vật thành bốn
nhóm như sau:
Protease – xerin
Protease – tiol
Protease – kim loại
Protease – acid
Một số tác giả khác chia protease ra làm ba nhóm dựa vào pH hoạt động của
chúng bao gồm:
Protease acid: pH < 3 được ứng dụng trong sản xuất bia và công nghiệp
bánh kẹo.
Protease trung tính: protease trung tính là metalloenzyme, chúng có pH
hoạt động 6 – 7, chúng thường được sản xuất từ Bacillus subtilis, Bacillus
thermoproteolyticus.
Protease kiềm: chúng có khoảng pH hoạt động 9 – 11, trong trung tâm
hoạt động của chúng có serin.
Trong bốn nhóm kể trên, các protease - serin và protease – tiol có khả năng
phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của amino acid.
Ngược lại các protease kim loại, protease acid thường không có hoạt tính esterase
và amidase đối với dẫn xuất của aminoacid.
Các protease – serin có trọng lượng phân tử vào khoảng 20000 – 27000
dalton, trọng lượng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với protease –serin

được tạo thành).
2.3.2.3. Chức năng sinh học của protease vi sinh vật
Theo nhiều tác giả protease ngoại bào và protease nội bào của vi sinh vật có
thể có những vai trò khác nhau đối với hoạt động sống của vi sinh vật.
Protease ngoại bào: phân giải protein và các cơ chất cao phân tử khác có
trong nhiều dung dịch thành các dạng phân tử thấp để vi sinh vật dễ dàng hấp thụ.
Protease nội bào : cho đến nay các protease nội bào còn đang được nghiên
cứu và cũng chưa biết rõ vai trò của chúng trong tế bào. Theo Hiroishi (1976), các
protease nội bào có thể có vai trò quan trọng hơn protease ngoại bào, chúng có thể
hoàn thành một số chức năng sau:
Phân giải các peptide được đưa từ môi trường ngoài vào thành các acid
amin để tổng hợp protein trong tế bào hoặc đôi khi dùng làm nguồn C, N, S.
Tham gia trong quá trình cải tiến một số phân tử protein, enzyme, điều này
có thể có ‎ nghĩa đối với việc hình thành và nảy mầm của bào tử vi sinh vật.
Protease nội bào cũng có thể tham gia trong việc hoàn thiện chuỗi
polypeptide đã được tổng hợp (Waller, 1963 ; Pine, 1969). Ngoài ra, protease nội
bào cũng có thể có tác dụng phân huỷ các protein vô dụng tổng hợp sai do đột biến,

14
hoặc cũng có thể tham gia vào quá trình sinh trưởng của vi sinh vật (trích Lê Minh
Cẩm Ngọc, 2005).
2.3.2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của vi
sinh vật
Quá trình tổng hợp enzyme nói chung cũng như tổng hợp protease ở vi sinh
vật chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như : ẩm độ, nhiệt độ, pH, độ thông
thoáng, thành phần môi trường
Ảnh hưởng của nhiệt độ : nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng
sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật cũng như tính chất của enzyme được tổng
hợp. Mỗi loại vi sinh vật có nhiệt độ thích hợp có khác nhau. Tuy nhiên, đa số các
vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme không bền với nhiệt độ và bị kiềm hãm nhanh

2.3. Giới thiệu về probiotic
2.4.1. Định nghĩa
Theo Fuller (1989; trích dẫn Lã Văn Kính, 1998), định nghĩa probiotic như
một thức ăn bổ sung vi sinh vật sống, có tác động có lợi đến động vật chủ thông qua
việc cải tiến cân bằng vi sinh vật đường ruột.
2.4.2. Chức năng sinh học
Làm tăng thức ăn ăn vào và làm tăng khả năng tiêu hoá nhờ hệ thống
enzyme.
Tổng hợp vitamin nhóm B và vitamin K ở manh tràng và đại tràng.
Trung hoà độc tố ruột, khử độc và phân huỷ một số chất có độc tính.
Giúp ổn định hệ vi sinh vật đường ruột.
2.4.3. Một số chế phẩm probiotic thông dụng
Hiện nay trên thị trường có bán rất nhiều chế phẩm sinh học dưới nhiều dạng
khác nhau như:
ENZYMBIOSUB của công ty vacxin và sinh phẩm số 2.
Chế phẩm men vi sinh EBS của công ty vacxin và sinh phẩm số 2.
BACIFLORA For Shrimp của công ty liên doanh Bio - Pharmachemie .

16
VIME - BACTEVIT của công ty Gấu Vàng.
Ngoài ra còn có rất nhiều loại chế phẩm nước ngoài như: PROTEXIN,
UNLEASH, hay FLORAZYMEEFA.
2.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm có vi khuẩn Bacillus
subtilis
 Trong nông nghiệp:
Theo tài liệu của Lê Minh Cẩm Ngọc (2005), ứng dụng của Bacillus subtilis
trong nông nghiệp được tiến hành như sau:
Chăn nuôi:
Viện bào chế Pharimex và viện Pasteur Nha Trang đã sản xuất chế phẩm
Biousubtyl để trị bệnh tiêu chảy phân trắng ở heo con.

3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
3.1.1. Thời gian
Đề tài được thực hiện từ tháng 3/2007 đến tháng 7/2007.
3.1.2. Địa điểm
Phòng thí nghiệm vi sinh - Khoa Chăn Nuôi Thú Y - Trường Đại Học Nông
Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu thí nghiệm
3.2.1. Đối tƣợng khảo sát
Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được phân lập từ đất.
3.2.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
3.2.2.1. Thiết bị
Tủ sấy, máy hấp tiệt trùng (autoclave), tủ lạnh, cân điện tử, máy lắc (vortex),
lò vi sóng, kính hiển vi, tủ ấm, …
3.2.2.2. Dụng cụ
Lam, đèn cồn, que cấy, que trang, đũa thuỷ tinh, ống nghiệm, đĩa petri,
micropipete, giá ống nghiệm, …
Tất cả các dụng cụ thuỷ tinh dùng trong thí nghiệm đều phải được rửa sạch,
bao gói và hấp tiệt trùng ở 121
0
C /15 phút.
19

3.3. Nội dung nghiên cứu
Phân lập loài vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất
Khảo sát khả năng sinh hai loại enzyme (protease, amylase) của vi khuẩn
và các yếu tố ảnh hưởng.
Xây dựng quy trình sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học.
Khảo sát sự thay đổi hoạt độ của enzyme chế phẩm trong thời gian bảo quản.
3.4. Phƣơng pháp thực hiện đề tài
3.4.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất