xi
DANH SÁCH SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3.1: Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất 20
Sơ đồ 3.2: Định danh vi khuẩn Bacillus subtilis (theo Nguyễn Ngọc Thanh Xuân, 2006). 21

1
Chƣơng 1
MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay, nền kinh tế ngày càng phát triển cùng với những tiến bộ khoa
học đã làm cho cuộc sống con người có nhiều thay đổi lớn. Càng ngày đời sống tinh
thần vật chất càng cao, do đó nhu cầu về chất lượng sản phẩm cũng tăng cao đòi hỏi
những nhà sản xuất phải nâng cao chất lượng sản phẩm của mình để đáp ứng nhu
cầu của người tiêu dùng.
Với mục đích bảo vệ sức khỏe cho người sử dụng sản phẩm chăn nuôi, bảo
vệ môi trường sống không bị ô nhiễm bởi các hoá chất độc hại, người ta hạn chế
hoặc cấm sử dụng một số loại thuốc, đặc biệt là thuốc kháng sinh và thay thế thuốc
kháng sinh bằng các chế phẩm sinh học. Chế phẩm sinh học hay còn gọi là
“probiotic” bao gồm các vi sinh vật sống có lợi, có tính đối kháng cao khi
3
Chƣơng 2
TỔNG QUAN
2.1. Sơ lƣợc về vi khuẩn Bacillus subtilis
2.1.1. Lịch sử phát hiện
Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ
chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lỵ cho
các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Việc điều trị phải đợi đến những năm
1949 - 1957, khi Henrry và các cộng sự tách được chủng thuần khiết của Bacillus
subtilis. Từ đó “subtilis therapy” có nghĩa là "thuốc subtilis" ra đời trị các chứng
viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu hoá. Ngày nay, vi
khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong y học, chăn nuôi,
thực phẩm (trích Lý Kim Hữu, 2005).
2.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis
 Đặc điểm phân loại:
Theo phân loại của Bergy (1994) Bacillus subtilis thuộc:
Bộ: Eubacteriales
Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis
Hình 2. 1. Vi khuẩn Bacillus subtilis
www.microscopyconsulting.com/ Gallery/pages/Ba

có tâm sẫm màu, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm. Sau 1 - 4 ngày bề mặt nhăn
nheo, màu hơi nâu.
Môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạo thành màu xám, rìa nhăn gợn sóng.
Môi trường gelatin: phát triển và làm tan chảy gelatin.
Thạch khoai tây: phát triển đều, màu vàng lấm tấm hạt.
5
Môi trường canh TSB: Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo
màng nhăn, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, lắc lên khó tan đều.
2.1.5. Đặc điểm sinh hoá
Lên men không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, mannitol,
saccharose, xylose, arabinose.
Indol (-), VP (+), Nitrat (+), H
2
S (-), NH
3
(+), catalase (+), amylase (+),
casein (+), citrat (+), di động (+), hiếu khí (+).
Phản ứng sinh hoá
Kết quả
Hoạt tính catalase
+
Sinh indol
-
MR
+
VP
+
Sử dụng citrate
+
Khử nitrate

chất, vì vậy có thể giữ ở trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm (Lê Đỗ Mai Phương, 2004).
Bào tử khác tế bào dinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hoá học và tính chất sinh lý.
2.1.6.2. Khả năng tạo bào tử
Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo
bào tử trong những điều kiện nhất định. Bacillus subtilis có khả năng hình thành
bào tử theo chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi
(dinh dưỡng trong môi trường bị kiệt quệ) (Tô Minh Châu, 2000).
Sự tạo bào tử diễn ra gồm nhiều giai đoạn, tổng cộng gần 8 giờ để hoàn tất.
Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và nhân tập
trung tại một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc lại và tạo
thành tiền bào tử (Prospore). Tiền bào tử bắt đầu được bao bọc dần bởi các lớp
màng. Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử. Khi bào tử trưởng thành, tế bào
dinh dưỡng tự phân giải và bào tử được giải phóng khỏi tế bào mẹ. Khi gặp điều
kiện thuận lợi, bào tử sẽ hút nước và bị trương ra. Sau đó, vỏ của chúng bị phá huỷ
và bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào mới. Mỗi tế bào dinh dưỡng chỉ tạo ra
một bào tử (Lê Đỗ Mai Phương, 2004).
2.1.7. Tính chất đối kháng
Với vi sinh vật gây bệnh, mỗi loài sinh vật khác nhau sẽ thích hợp ở điều
kiện môi trường khác nhau, sinh khuẩn lạc khác nhau. Thay đổi môi trường hoặc
các yếu tố môi trường bất lợi là làm thay đổi điều kiện sống, làm hạn chế hoặc ức
chế sự phát triển của vi sinh vật. Thực tế khi môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự
hiện diện của Bacillus subtilis với một số lượng lớn sẽ xảy ra sự cạnh tranh dinh

7
dưỡng. Cạnh tranh không gian sinh sống giữa vi khuẩn và nấm. Do vi khuẩn phát
triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi
trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm bị ức
chế (Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Thuận, 1976).
2.2. Giới thiệu về enzyme amylase và enzyme protease
2.3.1. Enzyme amylase

Hiện nay người ta đã biết rõ có 6 loại enzyme amylase trong đó α-amylase,
β-amylase, gluco-amylase (γ-amylase) thủy phân các liên kết α – 1,4 - glucoside của
tinh bột và các polysaccharide; 3 amylase còn lại (dextrine – 6 - glucanhidrolase,
amilopectin - 6 - glucanhidrolase, oligodexin - 6 - glucanhidrolase hay dextrinase)
thuỷ phân các liên kết α – 1,6 - glucoside trong polysaccharide và các dextrin cuối.
Các enzyme amylase có nguồn gốc khác nhau thì thường khác nhau về tính
chất, cơ chế tác dụng cũng như sản phẩm cuối cùng của sự thuỷ phân.
 α-amylase:
α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α – 1,4 - glucoside nằm ở phía
bên trong phân tử cơ chất (tinh bột, glycogen và polysaccharide) một cách ngẫu
nhiên, không theo một trật tự nào. Khi tác dụng lên tinh bột, enzyme này giải phóng
ra glucose ở dạng α- mutamer, nên năm 1924 Kuhn gọi nó là α-amylase.
α-amylase không chỉ thuỷ phân hồ tinh bột mà nó thuỷ phân cả hạt tinh bột
còn nguyên, song với tốc độ rất chậm. Dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể
chuyển thành maltotrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên,
α-amylase thường thuỷ phân tinh bột thành dextrin phân tử thấp không cho màu với
iod và một ít maltose, do đó α-amylase có tác dụng làm giảm độ nhớt của hồ tinh
bột rất mạnh (dịch hoá).
Tinh bột α-amylase α- dextrin + maltose + glucose
(hoặc glucogen) (nhiều) (ít)
α-amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng,
α -amylase bền nhiệt hơn so với các amylase khác. Tất cả các α-amylase đều bị
kiềm hãm bởi kim loại nặng như: Cu
2+
, Ag
+
, Hg
2+
. So với α-amylase của nấm mốc,
amylase của vi khuẩn có hoạt lực dextrin hoá trội hơn hoạt lực đường hóa.

amylopeptin, panose, isomantose và mantose tới glucose.
Đa số glucoamylase đều thuộc loại enzyme acid, thể hiện hoạt lực tối đa ở
vùng pH 3,5 – 5.
Glucoamylase bền với acid nhưng lại kém bền với tác dụng của rượu
etylic, aceton.