28
3.3.1.2. Khảo sát khả năng tăng sinh khối và enzyme của Bacillus subtilis trên môi
trường nhân giống cấp 2
Sau khi chọn lọc được môi trường nhân giống cấp 1 tốt nhất chúng tôi tiến hành xác định
môi trường nhân giống cấp 2 tối ưu nhất. Cách bố trí thí nghiệm được thực hiện như sau:
Môi trường sử dụng là môi trường bán rắn gồm 5 loại môi trường A, B, C, D và E
có bổ sung CaCO
3
2% để ổn định pH môi trường. Tất cả các loại môi trường trước khi
đem nuôi cấy đều được hấp khử trùng ở 121
o
C trong 15 - 20 phút. Các thành phần môi
trường này được trình bày chi tiết ở mục 1.11 phần phụ lục.
Lượng giống sử dụng ở môi trường nhân giống cấp 2 là 10%, với độ ẩm 60 – 65%, pH
= 7. Từng loại môi trường được đặt trong các khay bằng nhựa có kích cỡ 0,5 × 0,25 ×
0,08 m, mỗi khay chứa 0,6 kg môi trường. Trong quá trình nuôi phải giữ ẩm cho môi
trường bằng cách phủ vải ẩm. Sau thời gian 72 giờ nuôi bắt đầu thu hoạch sau đó đem
sản phẩm này kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn và hoạt độ enzyme amylase, protease.
Sau khi kiểm tra trên tất cả các môi trường A, B, C, D và E chúng tôi tìm được môi
trường nhân giống cấp 2 cho sinh khối và hoạt độ enzyme cao nhất để tiến hành sản
xuất. Mỗi môi trường thí nghiệm được lập lại 3 lần.
Số lượng tế bào vi
khuẩn
Hoạt độ
enzyme amylase
Hoạt độ
enzyme protease
Môi
trường
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần3

giống cấp 2 tối ưu
Khoáng hỗn
hợp
Hấp khử trùng 121
0
C
trong 20 - 25 phút
Đổ lên khay
Làm nguội đến 37
o
C
Nuôi 72 giờ ở nhiệt độ
phòng
Giống Bacillus subtilis 10%
Sấy khô 40 - 45
o
C
Đánh tơi
Xay mịn
Đóng gói, kiểm tra và
b
ảo
q
uản
Sơ đồ 3.2. Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis
Chế phẩm chứa Bacillus
subtilis

30
3.3.1.4. Kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn và hoạt độ enzyme
31
3.3.2. Đối với Lactobacillus acidophilus
Phân l
ập
Chế phẩm Antibio
(
chứa L. acido
p
hilus
)
MRSA
MRSB tăng sinh (24 giờ /37
o
C)
Môi trường sữa đặc có đường
Môi trường sữa đậu nành
24 giờ, nhiệt độ phòng
Kiểm tra
Số lượng vi khuẩn có trong 1ml Độ chua Therne
Chọn khuẩn lạc điển hình
Kiểm tra sinh hóa
Xác định Lactobacillus acidophilus
Sơ đồ 3.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đối với Lactobacillus acidophilus
Kiểm tra, đóng gói và
b
ảo
q
uản

/
00 10
-2
10
-3
10
-1
Môi trường phân lập
MRSA
Chọn khuẩn lạc điển hình,
nhuộm Gram và thử các phản
ứng sinh hóa
Môi trường giữ giống
MRSA
Cấy giữ giống
Cách tiến hành
Sơ đồ 3.4. Quy trình phân lập vi khuẩn Lactobacillus acidophilus
Cho 1 gam chế phẩm Antibio hòa vào 9 ml nước muối sinh lý (nồng độ 9
o
/
oo
) sau đó
lắc đều sao cho dung dịch trở nên đồng nhất ta được dung dịch có nồng độ pha loãng 10
-1
.
Tiếp theo lấy 1ml dung dịch 10
-1

thống như:
o Quan sát hình dạng tế bào khuẩn lạc và sự bắt màu khi nhuộm Gram.
o Thử nghiệm bằng các phản ứng sinh hóa.
Phản ứng
Kết quả
Lên men
đường
Kết quả
Indol
VP
MR
Citrat
Nitrat
Di động
Catalase
Khả năng đông vón sữa

Lactose
Sucrose
Glucose
Manitol
Rabinose 3.3.2.2. Khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn và độ chua Therne trên môi trường sữa
đặc có đường
Giống L. acidophilus sau khi phân lập được tăng sinh trên môi trường MRSB trong
thời gian 24 giờ ở 37
o
C. Sau đó cho lượng giống 5 % vừa tăng sinh này vào môi trường

20
.
o Tương tự ở nồng độ 15% đậu có: NB
0
, NB
10
, NB
15
và NB
20
.
o Ở nồng độ 20% đậu có: NC
0
, NC
10
, NC
15
và NC
20
.
Sau thời gian nuôi cấy là 24 giờ, pH = 6,5 - 7 ở nhiệt độ phòng chúng tôi tiến hành
kiểm tra độ chua Therne và số lượng tế bào vi khuẩn tương tự như thí nghiệm 3.3.2.2.
Độ chua Therne Số lượng tế bào vi khuẩn
Nồng độ
đậu nành
Kí
hiệu
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3
NA
0

NC
15

20%
NC
203.3.2.4. Tiến hành sản xuất thử chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus
Từ kết quả khảo sát độ chua và số lượng tế bào vi khuẩn ở hai loại môi trường sữa
đặc có đường và sữa đậu nành chúng tôi chọn được môi trường tối ưu nhất để tiến
hành sản xuất thử chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus.
Sau 24 giờ nuôi trên môi trường tối ưu ở nhiệt độ phòng với lượng giống cho vào là
5%. Chúng tôi bắt đầu thu hoạch và đem phối trộn với bột đậu nành khô đã qua khử

35
trùng (sấy 100
o
C trong 2giờ). Tỷ lệ phối trộn là 1:1 sau đó đem sấy ở nhiệt độ 40 - 45
o
C
trong 2 ngày sao cho sản phẩm khô hoàn toàn. Sản phẩm này được xây mịn, đóng gói
sau đó đem kiểm tra và bảo quản ở nhiệt độ phòng.
3.3.2.5. Kiểm tra sản phẩm sau thời gian bảo quản
Sản phẩm sau khi sấy khô chúng tôi tiến hành kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn có
trong 1 gam sản phẩm và sau thời gian bảo quản 10 và 20 ngày bằng phương pháp
đếm số lượng tế bào sống trên thạch (được trình bày chi tiết ở mục 3.5 phần phụ lục).
3.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
3.4.1. Xử lý số liệu
Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Minitab release 13.20 để so sánh sự

chúng tôi tiến hành theo dõi các chỉ tiêu về số lượng, khả năng sinh enzyme amylase,
protease với kết quả như sau.
4.1.1.1. Khả năng tăng sinh khối
Bảng 4.1. Số lượng tế bào Bacillus subtilis trên từng loại môi trường nhân giống cấp 1
Ghi chú : Chữ a, b, c, d chỉ sự khác biệt về mặt thống kê giữa từng loại môi trường
Qua bảng 4.1 chúng tôi nhận thấy số lượng tế bào trung bình ở môi trường rỉ đường
có bổ sung 2% tinh bột là cao nhất ở mức 1,92 ×10
10
cfu/ml. Kết quả xử lý thống kê
cho thấy có sự khác biệt giữa các loại môi trường là có ý nghĩa (P < 0,01).
4.1.1.2. Khả năng sinh enzyme amylase và protease
Sau 48 giờ nuôi ở nhiệt phòng chúng tôi tiến hành kiểm tra hoạt độ enzyme amylase
bằng phương pháp Wolhgemuth và enzyme protease bằng phương pháp Gross + Fuld.
Kết quả ghi nhận được môi trường rỉ đường có bổ sung 2% tinh bột có khả năng cho hoạt
độ enzyme amylase cao nhất là 256 W
0
/ml và protease là 128 Hđp/ml. Qua xử lý thống kê
chúng tôi nhận thấy có sự khác biệt giữa các môi trường là rất có ý nghĩa (P < 0,001). Kết
quả khảo sát được trình bày ở bảng 4.2.
Môi Trường Edward Fragie Nomura
pepton-
gelatin
Rỉ đường +
2% tinh bột
Lặp lại (n)
X
(×10

0,2455
12,78

37
Bảng 4.2. Hoạt độ enzyme amylase và protease trên từng loại môi trường nhân
giống cấp1
Môi trường
Enzyme Đối chứng (+) có enzyme: dung dịch không có màu xanh
Đối chứng (-) không có enzyme: dung dịch có màu xanh

Edward Fragie Nomura
pepton-
gelatin
Rỉ đường +
2% tinh bột
Amylase
Lặp lại (n)
X
(W
0
/ml)
SD
Cv%
3
8
a
0

0
3
13,33
b
4,6188
34,64
3
16
b
0
0
3
32
c
0
3
128
d
0
0 0
Hình 4.1. Xác định hoạt độ amylase theo phương pháp Wolhegemuth
2
1
4
1
8
1
16
1
32