iii
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
   KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM
HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME CỦA VI KHUẨN
BACILLUS SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ
NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khoá: 2003 - 2007
Sinh viên thực hiện: BÙI THỊ PHI Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện
TS. NGUYỄN NGỌC HẢI BÙI THỊ PHI

Thành phố Hồ Chí Minh
- 2007 -

iii
LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến:

Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, Ban chủ nhiệm Bộ môn
Công nghệ Sinh học, cùng tất cả Qúy thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá
trình học tại trường.

KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM HIỂU KHẢ NĂNG SINH
ENZYME (AMYLASE, PROTEASE) CỦA VI KHUẨN BACILLUS
SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC"
Giáo viên hƣớng dẫn: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI
Nhằm nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm chăn nuôi và để chế
phẩm sinh học được ứng dụng rộng rãi hơn và có tác dụng tốt hơn trong chăn nuôi,
chúng tôi tiến hành các thí nghiệm về điều kiện nuôi cấy (sục khí liên tục và không
sục khí), thời gian nuôi cấy (24 giờ, 48 giờ), ảnh hưởng của các loại môi trường
nuôi cấy, ảnh hưởng của pH và thời gian nuôi cấy vi khuẩn, nhiệt độ và thời gian
bảo quản chế phẩm để khảo sát khả năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus
subtilis. Kết quả chúng tôi có được:
Phân lập, xác định được 10 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis.
Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy (sục khí liên tục và không sục
khí), thời gian nuôi cấy (nuôi ở 24 giờ và 48 giờ) đến khả năng sinh enzyme
(amylase, protease) của vi khuẩn Bacillus subtilis thì chế độ sục khí liên tục và nuôi
ở 48 giờ vi khuẩn sẽ phát triển và sản sinh enzyme tốt hơn.
Khảo sát ảnh hưởng của các môi trường (rỉ đường + 2% tinh bột, rỉ
đuờng + 1% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột + 0,5% pepton, TSB + 1% tinh bột)
đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn thì ở môi trường rỉ đường + 2% tinh bột cho hoạt
độ enzyme tốt nhất so với 3 loại môi trường còn lại.
Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sự sản xuất enzyme của
các chủng Bacillus subtilis thì ở pH = 7 và thời gian nuôi cấy là 48 giờ, hoạt độ
enzyme của vi khuẩn tốt nhất.
Nhiệt độ 4 - 10
0
C giữ được hoạt độ enzyme tốt hơn ở nhiệt độ 30 - 37
0
C
trong khảo sát về nhiệt độ và thời gian bảo quản chế phẩm.


vi
MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................... iii
TÓM TẮT ................................................................................................................ iv
ABSTRACT ............................................................................................................... v
MỤC LỤC ................................................................................................................ vi
DANH SÁCH CÁC BẢNG ..................................................................................... ix
DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................. x
DANH SÁCH SƠ ĐỒ .............................................................................................. xi
Chƣơng 1: MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề ..................................................................................................... 1
1.2. Mục đích đề tài ............................................................................................. 2
1.3. Yêu cầu đề tài ............................................................................................... 2
Chƣơng 2: TỔNG QUAN ......................................................................................... 3
2.1. Sơ lược về vi khuẩn Bacillus subtilis ........................................................... 3
2.1.1. Lịch sử phát hiện ................................................................................... 3
2.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis ........ 3
2.1.3. Đặc điểm hình thái ................................................................................ 4
2.1.4. Đặc điểm nuôi cấy ................................................................................ 4
2.1.5. Đặc điểm sinh hoá ................................................................................. 5
2.1.6. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis .............. 6
2.1.6.1. Cấu tạo bào tử ................................................................................ 6
2.1.6.2. Khả năng tạo bào tử ....................................................................... 6
2.1.7. Tính chất đối kháng .............................................................................. 6
2.2. Giới thiệu về enzyme amylase và enzyme protease ..................................... 7
2.3.1. Enzyme amylase ................................................................................... 7
2.3.1.1. Lịch sử nghiên cứu ........................................................................ 7
2.3.1.2. Vi sinh vật tạo amylase .................................................................. 7
2.3.1.3. Đặc tính của amylase ..................................................................... 8

3.4.1.1. Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn ....................................... 19

viii
3.4.1.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis........................ 19
3.4.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập được ............ 20
3.4.2. Các thí nghiệm về vi khuẩn Bacillus subtilis ...................................... 21
3.4.2.1. Ảnh hưởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả
năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis .......................................... 21
3.4.2.2. Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn
Bacillus subtilis ............................................................................................. 22
3.4.2.3. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sự sản xuất
enzyme của các chủng Bacillus subtilis. ...................................................... 23
3.4.3. Thử nghiệm thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm từ Bacillus
subtilis ............................................................................................................. 25
3.4.3.1. Quy trình thực hiện ...................................................................... 25
3.4.3.2. Kiểm tra chế phẩm trong thời gian bảo quản .............................. 25
Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 26
4.1. Khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis ...................................... 26
4.1.1. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis ................ 26
4.1.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis .......... 26
4.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh hóa ................................................................ 27
4.2. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến
khả năng sinh enzyme amylase và protease của các chủng vi khuẩn. .................. 29
4.3. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt độ enzyme của vi
khuẩn Bacillus subtilis .......................................................................................... 31
4.4. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sản xuất enzyme của các
chủng Bacillus subtilis .......................................................................................... 33
4.5. Khảo sát thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm sau khi sản xuất ......... 34
Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 36
5.1. Kết luận ...................................................................................................... 36


xi
DANH SÁCH SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3.1: Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất ................................................ 20
Sơ đồ 3.2: Định danh vi khuẩn Bacillus subtilis (theo Nguyễn Ngọc Thanh Xuân, 2006). .. 21

1
Chƣơng 1
MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề

Xây dựng quy trình sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học.
Khảo sát sự thay đổi hoạt độ của enzyme chế phẩm trong thời gian
bảo quản.
3
Chƣơng 2
TỔNG QUAN
2.1. Sơ lƣợc về vi khuẩn Bacillus subtilis
2.1.1. Lịch sử phát hiện
Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ
chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lỵ cho
các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Việc điều trị phải đợi đến những năm
1949 - 1957, khi Henrry và các cộng sự tách được chủng thuần khiết của Bacillus
subtilis. Từ đó “subtilis therapy” có nghĩa là "thuốc subtilis" ra đời trị các chứng
viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu hoá. Ngày nay, vi
khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong y học, chăn nuôi,

 Điều kiện phát triển: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu là 37
0
C
 Nhu cầu O
2
: Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng lại có khả năng
phát triển yếu trong môi trường thiếu oxy.
 Độ pH: Bacillus subtilis thích hợp nhất với pH = 7,0 - 7,4.
 Môi trường
Môi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa không đều,
có tâm sẫm màu, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm. Sau 1 - 4 ngày bề mặt nhăn
nheo, màu hơi nâu.
Môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạo thành màu xám, rìa nhăn gợn sóng.
Môi trường gelatin: phát triển và làm tan chảy gelatin.
Thạch khoai tây: phát triển đều, màu vàng lấm tấm hạt.
5
Môi trường canh TSB: Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo
màng nhăn, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, lắc lên khó tan đều.
2.1.5. Đặc điểm sinh hoá
Lên men không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, mannitol,
saccharose, xylose, arabinose.
Indol (-), VP (+), Nitrat (+), H
2
S (-), NH
3
(+), catalase (+), amylase (+),
casein (+), citrat (+), di động (+), hiếu khí (+).
Phản ứng sinh hoá Kết quả
Hoạt tính catalase +
Sinh indol -

Sự tạo bào tử diễn ra gồm nhiều giai đoạn, tổng cộng gần 8 giờ để hoàn tất.
Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và nhân tập
trung tại một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc lại và tạo
thành tiền bào tử (Prospore). Tiền bào tử bắt đầu được bao bọc dần bởi các lớp
màng. Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử. Khi bào tử trưởng thành, tế bào
dinh dưỡng tự phân giải và bào tử được giải phóng khỏi tế bào mẹ. Khi gặp điều
kiện thuận lợi, bào tử sẽ hút nước và bị trương ra. Sau đó, vỏ của chúng bị phá huỷ
và bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào mới. Mỗi tế bào dinh dưỡng chỉ tạo ra
một bào tử (Lê Đỗ Mai Phương, 2004).
2.1.7. Tính chất đối kháng
Với vi sinh vật gây bệnh, mỗi loài sinh vật khác nhau sẽ thích hợp ở điều
kiện môi trường khác nhau, sinh khuẩn lạc khác nhau. Thay đổi môi trường hoặc
các yếu tố môi trường bất lợi là làm thay đổi điều kiện sống, làm hạn chế hoặc ức
chế sự phát triển của vi sinh vật. Thực tế khi môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự
hiện diện của Bacillus subtilis với một số lượng lớn sẽ xảy ra sự cạnh tranh dinh

7
dưỡng. Cạnh tranh không gian sinh sống giữa vi khuẩn và nấm. Do vi khuẩn phát
triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi
trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm bị ức
chế (Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Thuận, 1976).
2.2. Giới thiệu về enzyme amylase và enzyme protease
2.3.1. Enzyme amylase
2.3.1.1. Lịch sử nghiên cứu
Những nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên về enzyme nói chung và về enzyme
amylase nói riêng được bắt đầu vào những năm 1811 – 1814. Những nghiên cứu
này gắn liền với tên tuổi của nhà bác học người Nga – Viện sĩ K.S Kirhof. Ông
nghiên cứu quá trình phân giải tinh bột dưới tác dụng của dịch chiết đại mạch nảy mầm
(malt) và nhận thấy rằng trong malt có chứa các chất phân giải tinh bột thành đường.
Các enzyme amylase có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật,

 α-amylase:
α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α – 1,4 - glucoside nằm ở phía
bên trong phân tử cơ chất (tinh bột, glycogen và polysaccharide) một cách ngẫu
nhiên, không theo một trật tự nào. Khi tác dụng lên tinh bột, enzyme này giải phóng
ra glucose ở dạng α- mutamer, nên năm 1924 Kuhn gọi nó là α-amylase.
α-amylase không chỉ thuỷ phân hồ tinh bột mà nó thuỷ phân cả hạt tinh bột
còn nguyên, song với tốc độ rất chậm. Dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể
chuyển thành maltotrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên,
α-amylase thường thuỷ phân tinh bột thành dextrin phân tử thấp không cho màu với
iod và một ít maltose, do đó α-amylase có tác dụng làm giảm độ nhớt của hồ tinh
bột rất mạnh (dịch hoá).
Tinh bột α-amylase α- dextrin + maltose + glucose
(hoặc glucogen) (nhiều) (ít)
α-amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng,
α -amylase bền nhiệt hơn so với các amylase khác. Tất cả các α-amylase đều bị
kiềm hãm bởi kim loại nặng như: Cu
2+
, Ag
+
, Hg
2+
. So với α-amylase của nấm mốc,
amylase của vi khuẩn có hoạt lực dextrin hoá trội hơn hoạt lực đường hóa.

9
α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị vỡ, còn
α-amylase vi khuẩn lại có khả năng phân huỷ các hạt tinh bột còn nguyên lẫn hồ
tinh bột (Popadicts và cộng sự, 1971). Amylase của Bacillus subtilis phân giải tinh
bột còn nguyên 2 – 2,5 lần nhanh hơn so với α-amylase của nấm mốc (Lixiuk và
Popadicts, 1969) (trích Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005).

2.3.1.4. Sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật
Khi nuôi vi sinh vật tạo amylase có hai quá trình liên quan mật thiết với
nhau: quá trình tổng hợp sinh khối vi sinh vật và quá trình tích tụ enzyme trong tế
bào hay ngoài môi trường.
Amylase của Bacillus subtilis được tạo thành ở vi khuẩn trong giai đoạn đã
hoặc đang kết thúc quá trình sinh trưởng. Cả trong môi trường nuôi cấy lẫn trong
bản thân tế bào vi khuẩn “ trẻ ” đều không tìm thấy amylase. Amylase ngoại bào
được tổng hợp ở tế bào đang chuyển sang thời kỳ tự phân.
2.3.1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp amylase
 Ảnh hưởng của thành phần môi trường:
Ảnh hưởng của nguồn cacbon dinh dưỡng: Các nguồn cacbon và năng
lượng dễ hấp thu có tác dụng kiềm hãm sinh tổng hợp amylase (nồng độ tinh bột tối
thích trong nuôi cấy chìm là 0,5 – 0,7%). Để có hoạt lực α–amylase cao cần 6% tinh
bột, oligo – 1,6 – glucozidase cần 2% tinh bột.
Ảnh hưởng của nguồn nitơ dinh dưỡng: Cho nguồn nitơ nhất định vào môi
trường có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác.
Nguồn nitơ hữu cơ: gelatin, casein, nước chiết ngô.
Ảnh hưởng của acid amin: Acid amin có ảnh hưởng tốt tới sinh lí của vi
sinh vật tạo enzyme amylase do: acid amin có thể đồng thời vừa là nguồn cacbon,
nitơ, vừa là nguồn năng lượng; một số acid amin riêng rẽ đóng vai trò quan trọng
trong sinh tổng hợp nhiều acid amin khác và trong quá trình chuyển hoá amin.
Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng: Các nguyên tố đa lượng và vi
lượng có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và tổng hợp các enzyme amylase của vi
sinh vật.
Mg
2+
ảnh hưởng đến độ bền của enzyme.
Photpho ảnh hưởng trực tiếp đến sinh sản của nấm mốc và của vi sinh vật khác.
Ca
2+

Các loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease như: Bacillus subtilis,
Bacillus cereus, xạ khuẩn: Streptomyces griseus, Streptomyces rimosus,…và một số
loài nấm mốc: Aspergillus oryzae, Aspergillus niger… (Nguyễn Đức Lượng, 2004).

12
2.3.2.2. Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật
Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một nòi vi
sinh vật cũng có thể khác nhau về tính chất. Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt
động thích hợp, … các nhà khoa học đã phân loại các protease vi sinh vật thành bốn
nhóm như sau:
Protease – xerin
Protease – tiol
Protease – kim loại
Protease – acid
Một số tác giả khác chia protease ra làm ba nhóm dựa vào pH hoạt động của
chúng bao gồm:
Protease acid: pH < 3 được ứng dụng trong sản xuất bia và công nghiệp
bánh kẹo.
Protease trung tính: protease trung tính là metalloenzyme, chúng có pH
hoạt động 6 – 7, chúng thường được sản xuất từ Bacillus subtilis, Bacillus
thermoproteolyticus.
Protease kiềm: chúng có khoảng pH hoạt động 9 – 11, trong trung tâm
hoạt động của chúng có serin.
Trong bốn nhóm kể trên, các protease - serin và protease – tiol có khả năng
phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của amino acid.
Ngược lại các protease kim loại, protease acid thường không có hoạt tính esterase
và amidase đối với dẫn xuất của aminoacid.
Các protease – serin có trọng lượng phân tử vào khoảng 20000 – 27000
dalton, trọng lượng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với protease –serin
vào khoảng 33800 – 48400 dalton. Protease – tiol và nhiều protease – acid cũng có

2.3.2.3. Chức năng sinh học của protease vi sinh vật
Theo nhiều tác giả protease ngoại bào và protease nội bào của vi sinh vật có
thể có những vai trò khác nhau đối với hoạt động sống của vi sinh vật.
Protease ngoại bào: phân giải protein và các cơ chất cao phân tử khác có
trong nhiều dung dịch thành các dạng phân tử thấp để vi sinh vật dễ dàng hấp thụ.
Protease nội bào : cho đến nay các protease nội bào còn đang được nghiên
cứu và cũng chưa biết rõ vai trò của chúng trong tế bào. Theo Hiroishi (1976), các
protease nội bào có thể có vai trò quan trọng hơn protease ngoại bào, chúng có thể
hoàn thành một số chức năng sau:
Phân giải các peptide được đưa từ môi trường ngoài vào thành các acid
amin để tổng hợp protein trong tế bào hoặc đôi khi dùng làm nguồn C, N, S.
Tham gia trong quá trình cải tiến một số phân tử protein, enzyme, điều này
có thể có ‎ nghĩa đối với việc hình thành và nảy mầm của bào tử vi sinh vật.
Protease nội bào cũng có thể tham gia trong việc hoàn thiện chuỗi
polypeptide đã được tổng hợp (Waller, 1963 ; Pine, 1969). Ngoài ra, protease nội
bào cũng có thể có tác dụng phân huỷ các protein vô dụng tổng hợp sai do đột biến,

14
hoặc cũng có thể tham gia vào quá trình sinh trưởng của vi sinh vật (trích Lê Minh
Cẩm Ngọc, 2005).
2.3.2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của vi
sinh vật
Quá trình tổng hợp enzyme nói chung cũng như tổng hợp protease ở vi sinh
vật chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như : ẩm độ, nhiệt độ, pH, độ thông
thoáng, thành phần môi trường...
Ảnh hưởng của nhiệt độ : nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng
sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật cũng như tính chất của enzyme được tổng
hợp. Mỗi loại vi sinh vật có nhiệt độ thích hợp có khác nhau. Tuy nhiên, đa số các
vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme không bền với nhiệt độ và bị kiềm hãm nhanh
chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp.