BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

CHƯƠNG TRÌNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NÔNG NGHIỆP, THỦY SẢN
BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI
Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm chế phẩm vi sinh từ các dòng vi
khuẩn có đặc tính đối kháng Vibrio spp. nhằm nâng cao tỉ lệ sống ấu
trùng cá biển và tôm sú

Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II
Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh 8938 TP. Hồ Chí Minh, tháng 6/2011
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI
TRỒNG THỦY SẢN II
__________________

Điện thoại: (08)38299592 Fax: (08)38226807
E-mail:
Website:
Địa chỉ: 116 Nguyễn Đình Chiểu, Quận 1, thành phố Hồ Chí Minh
Họ và tên thủ trưởng tổ chức: Nguyễn Văn Hảo
Số tài khoản: 060.19.00.00047
Ngân hàng: Kho bạc Nhà nước Quận 1, thành phố Hồ Chí Minh
Tên cơ quan chủ quản đề tài: Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn

II. TÌNH HÌNH THỰC HIỆN
1. Thời gian thực hiện đề tài:
- Theo Hợp đồng đã ký kết: từ tháng 01/ năm 2008 đến tháng 12/ năm 2010
- Thực tế
thực hiện: từ tháng 01/năm 2008 đến tháng 12/năm 2010
- Được gia hạn (nếu có):
- Lần 1 từ tháng…. năm…. đến tháng…. năm….
- Lần 2 ….
2. Kinh phí và sử dụng kinh phí:
a) Tổng số kinh phí thực hiện: 1.096 tr.đ, trong đó:
+ Kính phí hỗ trợ từ SNKH: 1.096 tr.đ.
+ Kinh phí từ các nguồn khác: ……………….tr.đ.
+ Tỷ lệ và kinh phí thu hồi đối với dự án (nếu có): ………….
…………………………………….

b) Tình hình cấp và sử dụng kinh phí từ nguồn SNKH:
Theo kế hoạch Thực t
ế đạt được
Số
TT
Thời gian

(khoa học, phổ
thông)
458
458
459,28
459,28
2 Nguyên, vật liệu,
năng lượng
352
352
362,79
362,79
3 Thiết bị, máy móc
45
45
41,15
41,15
4 Xây dựng, sửa chữa
nhỏ
10
10
11,38
11,38
5 Chi khác
231
231
158,06
158,06

Tổng cộng 1.096 1.096 1.032,7 1.032,7

thủy sản Bạc Liêu

4. Tổ chức phối hợp thực hiện đề tài: Không có

5. Cá nhân tham gia thực hiện đề tài:
(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10
người kể cả chủ nhiệm)
Số
TT
Tên cá nhân đăng
ký theo Thuyết
minh
Tên cá nhân đã
tham gia thực hiện
Nội dung tham
gia chính
Sản phẩm
chủ yếu
đạt được
Ghi
chú*
1 Nguyễn Thị Ngọc
Tĩnh
Nguyễn Thị Ngọc
Tĩnh
Chủ nhiệm đề
tài

2 GSTS Nguyễn Văn
Thanh

địa điểm, tên tổ chức hợp tác,
số đoàn, số lượng người tham
gia )
Thực tế đạt được
(Nội dung, thời gian, kinh phí,
địa điểm, tên tổ chức hợp tác,
số đoàn, số lượng người tham
gia )
Ghi
chú*
1 Tên người và tổ chức hợp tác:
GSTS. Peter Bossier,
Laboratory of Aquaculture &
Artemia Reference Center,
Ghent University, Belgium
Nội dung hợp tác: Trao đổi và
học tập các phương pháp phân
lập và tạo chế phẩm vi sinh
ứng dụng trong thủy sản
Đã thực hiện việc hợp tác với tổ
chức nói trên vào tháng 9/2009

7. Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:
Số
TT
Theo kế hoạch
(Nội dung, thời gian, kinh phí,
địa điểm )
Thực tế đạt được
(Nội dung, thời gian,

chẽm bệnh, xác định và phân lập
tác nhân gây bệnh
1/2008 –
5/2008
1/2008 –
9/2008
Nguyễn Thị Ngọc
Tĩnh, Trần Nguyễn
Ái Hằng
2 Phân lập các dòng vi khuẩn có khả
năng phân hủy phân tử quorum
sensing của vi khuẩn Gram âm
(AHL)

2.1 Thu mẫu ấu trùng tôm sú và cá
chẽm, nghiền mẫu, ly tâm và bảo
quản ở -80
0
C
4/2008 –
6/2008
4/2008 –
6/2008;
1/2010 –
3/2010
Nguyễn Thị Ngọc
Tĩnh, Trần Nguyễn
Ái Hằng
2.2 Phân lập các dòng vi khuẩn có khả
năng phân hủy phân tử AHL

4/2009 –
3/2010
4/2009 –
6/2009;
4/2010 –
6/2010
Nguyễn Thị Ngọc
Tĩnh, Trần Nguyễn
Ái Hằng
4.2 Khảo sát các đặc tính probiotic
của các chủng vi khuẩn riêng lẻ và
hỗn hợp vi khuẩn ở qui mô pilot
4/2009 –
3/2010
4/2009 –
8/2010
Nguyễn Thị Ngọc
Tĩnh, Đặng Tố Vân
Cầm, Vũ Hồng Như
Yến
5 Định danh các chủng vi khuẩn đã
được tuyển chọn làm chế phẩm vi
sinh sử dụng phương pháp sinh
học phân tử và phương pháp
truyền thống
1/2010 –
9/2010
5/2009 –
9/2009
Nguyễn Thị Ngọc

1 Chế phẩm vi sinh sử
dụng cho trại giống
cá biển
kg 5,0 10,5
2 Chế phẩm vi sinh sử
dụng cho trại giống
tôm sú
kg 5,0 15,6
- Lý do thay đổi (nếu có):

b) Sản phẩm Dạng II:
Yêu cầu khoa học
cần đạt

Số
TT
Tên sản phẩm

Theo kế hoạch Thực tế
đạt được
Ghi chú

1 Qui trình công nghệ phân
lập và sản xuất sinh khối
chế phẩm vi sinh
Qui trình dễ áp
dụng, tạo ra
chế phẩm vi
sinh ở qui mô
1kg / 3 giờ

trên động vật thủy sản”
01 01 Tạp chí Khoa học và
Công nghệ - Viện Khoa
học Công nghệ Việt Nam
(chấp nhận đăng)
2 Báo cáo thuyết trình “Kết
quả phân lập các chủng vi
khuẩn probiotic đối kháng
Vibrio spp. và bước đầu
ứng dụng trong ương nuôi
ấu trùng cá chẽm và tôm
sú”
Kỷ yếu Hội nghị Công
nghệ sinh học toàn quốc
khu vực phía Nam năm
2009 - Lý do thay đổi (nếu có):

d) Kết quả đào tạo:
Số lượng
Số
TT
Cấp đào tạo, Chuyên
ngành đào tạo
Theo kế hoạch Thực tế đạt
được
Ghi chú
(Thời gian kết

- Lý do thay đổi (nếu có):

e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đã được ứng dụng vào thực tế
Số
TT
Tên kết quả
đã được ứng dụng
Thời gian
Địa điểm
(Ghi rõ tên, địa
chỉ nơi ứng
dụng)
Kết quả
sơ bộ
1
2

2. Đánh giá về hiệu quả do đề tài mang lại
a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:
(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình độ công
nghệ so với khu vực và thế giới…)
Với các kết quả nghiên cứu đạt được, đề tài sẽ đóng góp vào lĩnh vực KH&CN
có liên quan đến việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong việc phân lập và
tạo chế
phẩm vi sinh có đặc tính ức chế quorum sensing và đối kháng nhóm vi khuẩn
gây bệnh và ứng dụng trong sản xuất giống tôm sú và cá biển, đồng thời xây dựng qui
trình cho các đối tượng thủy sản khác.
b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:
(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do đề tài, dự án tạo ra so với các sản
phẩm cùng loại trên thị trường…)

Lần 6 10/2010 Đang tiếp tục định danh và thử nghiệm ở
điều kiện trại giống. Đề tài thực hiện đúng
tiến độ so với thuyết minh và hợp đồng.
II Kiểm tra định kỳ
Lần 1 12/2008 Chủ nhiệm đề tài bám sát đề cương, triển
khai tốt.
Lần 2 11/2009 CNĐT đã bám sát đề cương. Chú ý định
hướng phát triển của sản phẩm là kháng
bệnh. Cần chú ý sự tương thích khi phát triển
hỗn hợp sản phẩm.

Lần 3 8/2010 Đề nghị CNĐT khẩn trương hoàn thiện và
làm báo cáo tổng kết. Chuẩn bị đầy đủ hồ sơ
để nghiệm thu đề tài đúng thời hạn.
III Nghiệm thu cơ
sở
12/2010 Đề tài được xếp loại “Đạt”, đủ điều kiện
đánh giá kết quả đề tài ở cấp Nhà nước.
IV Nghiệm thu cấp
Nhà nước
3/2011 Đề tài được xếp loại “Khá”
Chủ nhiệm đề tài
(Họ tên, chữ ký)


2.2. Phương pháp nghiên cứu 17
2.3. Kết quả nghiên cứu 19
2.3.1. Thí nghiệm gây nhiễm trên ấu trùng tôm sú 19
2.3.1.1. Thí nghiệm 1 20
2.3.1.2. Thí nghiệm 2 20
2.3.1.3. Thí nghiệm 3 20
2.3.1.4. Thí nghiệm 4 21
2.3.1.5. Thí nghiệm 5 21
2.3.1.6. Thí nghiệm 6 22

ii
2.3.2. Thí nghiệm gây nhiễm trên cá chẽm hương 23
2.3.2.1. Thí nghiệm 1 23
2.3.2.2. Thí nghiệm 2 23
2.3.2.3. Thí nghiệm 3 23
2.3.2.4. Thí nghiệm 4 24
2.3.2.5. Thí nghiệm 5 24
2.3.2.6. Thí nghiệm 6 25
Chương 3 – PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN
HỦY PHÂN TỬ QUORUM SENSING CỦA VI KHUẨN GRAM ÂM 26
3.1. Vật liệu nghiên cứu 26
3.2. Phương pháp nghiên cứu 26
3.2.1. Thu nhận hệ vi sinh vật đường ruột 26
3.2.2. Phân lập vi khuẩn có đặc tính phân hủy phân tử AHL 27
3.2.3. Định danh bằng phương pháp sinh hóa 27
a) Nhuộm Gram 27
b) Định danh 27
3.3. Kết quả nghiên cứu 28
3.3.1. Biến động giá trị pH của môi trường phân lập 28
3.3.2. Mật độ vi sinh vật qua các đợt phân lập 30

5.2.1. Đánh giá tính an toàn đối với vật chủ 49
5.2.1.1. Đ
ánh giá tính an tòan đối với ấu trùng cá chẽm 49
a. Nhóm vi khuẩn phân lập từ cá chẽm 49
b. Nhóm vi khuẩn phân lập từ tôm sú 50
5.2.1.2. Đánh giá tính an tòan đối với ấu trùng tôm sú 51
a. Nhóm vi khuẩn phân lập từ cá chẽm 51

b. Nhóm vi khuẩn phân lập từ tôm sú 52
5.2.2. Đánh giá khả năng bảo vệ vật chủ gây nhiễm với Vibrio spp. 53

iv
5.2.2.1. Khả năng bảo vệ ấu trùng cá chẽm gây nhiễm với Vibrio parahaemolyticus 53
a. Nhóm vi khuẩn phân lập từ cá chẽm 53
b. Nhóm vi khuẩn phân lập từ tôm sú 54
5.2.2.2. Khả năng bảo vệ ấu trùng tôm sú gây nhiễm với Vibrio alginolyticus 54
a. Nhóm vi khuẩn phân lập từ cá chẽm 54
b. Nhóm vi khuẩn phân lập từ tôm sú 55
5.2.3. Khảo sát đặc tính tương thích giữa các chủng vi khuẩn 56
5.2.4. Khảo sát các đặc tính probiotic ở quy mô pilot 57
5.2.4.1. Thí nghiệm trên cá chẽm hương 57
a. Thí nghiệm 1 57
b. Thí nghiệm 2 60
c. Thí nghiệm 3 63
d. Thí nghiệm 4 66
5.2.4.2. Thí nghiệm trên ấu trùng tôm sú 71
a. Thí nghiệm 1 71
b. Thí nghiệm 2 72
c. Thí nghiệm 3 75
d. Thí nghiệm 4 78

CHẾ PHẨM VI SINH 96
7.1. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 96
7.1.1. Khảo sát sự tăng trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn ở các điều kiện nuôi
cấy khác nhau 96
7.1.2. Tạo chế phẩm vi sinh từ các hỗn hợp vi khuẩn đã tuyển chọn, khảo sát thời
gian bảo quản 96
7.1.2.1. Thiết bị và chất mang sử dụng 96
7.1.2.2. Thí nghiệm khảo sát tỉ lệ phối trộn và nhiệt độ bảo quả
n tối ưu 97
7.1.3. Thử nghiệm sản phẩm ở điều kiện trại giống 98

vi
7.2. Kết quả nghiên cứu 98
7.2.1. Khảo sát sự tăng trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 98
a. Khảo sát sự tăng trưởng trong các môi trường khác nhau 98
b. Khảo sát sự tăng trưởng ở các giá trị pH khác nhau 99
c. Khảo sát sự tăng trưởng ở các giá trị nhiệt độ khác nhau 99
d. Khảo sát đường cong tăng trưởng theo thời gian 100
7.2.2. Xác định chất mang, tỉ lệ phối trộn và nhiệt độ bảo quản tối
ưu 101
a. Xác định chất mang thích hợp 101
b. Xác định tỉ lệ phối trộn và nhiệt độ bảo quản tối ưu 101
7.2.3. Kết quả thử nghiệm sản phẩm ở điều kiện sản xuất 103
a. Kết quả thử nghiệm ở trại giống cá chẽm 103
b. Kết quả thử nghiệm ở trại giống tôm sú 104
Chương 8 – CÁC KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC VÀ THẢO LUẬN 105
8.1. Các kết quả khoa học công nghệ 105
8.1.1. Khảo sát tác nhân gây bệnh Vibrio spp. trên ấu trùng tôm sú và cá chẽm 105
8.1.2. Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy phân tử quorum sensing
(phân tử AHL) của vi khuẩn Gram âm 105

harveyi 4
Bảng 1.2. Các yếu tố cấu thành trong chiến lược kiểm sóat hệ vi sinh trong ương
nuôi ấu trùng thủy sản 6
Bảng 1.3. Một số phân tử tín hiệu của các loài vi khuẩn gây bệnh trên động vật
thủy sản 8
Bảng 2.1. Tỉ lệ sống của ấu trùng tôm sú (%) sau 24 giờ gây nhiễm (thí nghiệm 2) 20
Bảng 2.2. Tỉ lệ sống của ấu trùng tôm sú (%) sau 24 giờ gây cảm nhiễm
(thí nghiệm 3) 21
Bảng 2.3. Tỉ lệ sống của ấu trùng tôm sú (%) sau 24 giờ gây cảm nhiễm
(thí nghiệm 4) 21
Bảng 2.4. Tỉ lệ sống của ấu trùng tôm sú (%) sau 24 giờ gây cảm nhiễm
(thí nghiệm 5) 22
Bảng 2.5. Tỉ lệ sống của ấu trùng tôm sú (%) sau 24 giờ gây cảm nhiễm
(thí nghiệm 6) 22
Bảng 2.6. Tỉ lệ sống của cá chẽm hương (%) sau 48 giờ gây cảm nhiễm
(thí nghiệ
m 2) 23
Bảng 2.7. Tỉ lệ sống của cá chẽm hương (%) sau 48 giờ gây cảm nhiễm
(thí nghiệm 3) 24
Bảng 2.8. Tỉ lệ sống của cá chẽm hương (%) sau 48 giờ gây cảm nhiễm
(thí nghiệm 4) 24
Bảng 2.9. Tỉ lệ sống của cá chẽm hương (%) sau 48 giờ gây cảm nhiễm
(thí nghiệm 5) 25
Bảng 2.10. Tỉ lệ sống của cá chẽm hương (%) sau 48 giờ gây cảm nhiễm
(thí nghiệm 6) 25

ix
Bảng 3.1. Khoảng biến thiên giá trị pH ở các nghiệm thức qua các đợt phân lập 28
Bảng 4.1. Kết quả tổng hợp các đặc tính probiotic in vitro của các chủng vi khuẩn
khảo sát 40

Bảng 7.5. Mật độ vi khuẩn (log CFU/ml) sau 48 giờ nuôi cấy ở các giá trị nhiệt độ
khác nhau 100
Bảng 7.6. Độ ẩm của sản phẩm ở các tỉ lệ phối trộn khác nhau . 102
Bảng 7.7. Mật độ vi khuẩn tổng số trong sản phẩm ở các nhiệt độ bảo quản và ở các
thời điểm khác nhau. 103
Bảng 7.8. Kết quả thử nghiệm sản phẩm BioFish-RIA2 104
Bảng 7.9. Kết quả thử nghiệm sản phẩm BioShrimp-RIA2 104
Bảng 8.1. Các chủng vi khuẩn đạt giá trị RPS cao nhất ở các thí nghiệm gây nhiễm trên
ấu trùng tôm sú và cá chẽm 107
Bảng 8.2. Kết quả định danh của bốn chủng được tuyển chọn 109
Bảng 8.3. Các sản phẩm khoa học và công nghệ của đề tài 111 xi
DANH SÁCH HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Hệ thống quorum sensing ở Vibrio harveyi 10
Hình 1.2. Sơ đồ các phương pháp bẻ gãy quá trình quorum sensing ở vi khuẩn. 11

Hình 5.6. Tỉ lệ sống của ấu trùng tôm sú 24 giờ sau khi bổ sung các chủng vi khuẩn
phân lập từ cá chẽm. 51
Hình 5.7. Tỉ lệ sống của ấu trùng tôm sú 24 giờ sau khi bổ sung các chủng vi khuẩn
phân lập từ tôm sú thương phẩm và tôm sú post. 52
Hình 5.8. Mật độ Vibrio tổng số trung bình trong nước bể ương cá ch
ẽm (Thí
nghiệm 1). 58
Hình 5.9. Tỉ lệ sống của ấu trùng cá chẽm tại thời điểm 14 ngày (Thí nghiệm 1) 59
Hình 5.10. Mật độ Vibrio tổng số trung bình trong nước bể ương cá chẽm
(Thí nghiệm 2) 60
Hình 5.11. Tỉ lệ sống cá chẽm hương vào ngày tuổi thứ 30 (Thí nghiệm 2) 62
Hình 5.12. Chiều dài trung bình cá chẽm hương 30 ngày tuổi (Thí nghiệm 2) 63
Hình 5.13. Mật độ Vibrio tổng số trung bình trong nước bể ương cá chẽm (Thí
nghiệm 3) 64
Hình 5.14. T
ỉ lệ sống cá chẽm hương vào ngày tuổi thứ 30 (Thí nghiệm 3) 65
Hình 5.15. Chiều dài cá chẽm hương vào ngày tuổi thứ 30 (Thí nghiệm 3) 66
Hình 5.16. Mật độ Vibrio tổng số trung bình trong nước bể ương cá chẽm
(Thí nghiệm 4) 68
Hình 5.17. Tỉ lệ sống cá chẽm hương vào ngày tuổi thứ 30 (Thí nghiệm 4) 69
Hình 5.18. Trọng lượng khô cá thể cá chẽm hương vào ngày tuổi thứ 30 (Thí
nghiệm 4) 70
Hình 5.19. Mật độ Vibrio tổng số trung bình trong nước bể ương tôm sú (Thí
nghiệm 1) 72
Hình 5.20. Mật độ Vibrio tổng số trung bình trong nước bể ương tôm sú (Thí
nghiệm 2) 73
Hình 5.21. Tỉ lệ sống ấu trùng tôm sú ở giai đọan PL13 (Thí nghiệm 2) 74
Hình 5.22. Mật độ Vibrio tổng số trung bình trong nước bể ương tôm sú (Thí

xiii

MA Marine Agar
MBV Monodon baculovirus
ODHL Oxo-decanoyl homoserine lactone
PL Postlarvae
QS Quorum sensing
TCBS Thiosulphate citrate bile salt
TSA Tryptic Soy Agar
TSB Tryptic Soy Broth
VEM Vietnamese effective microorganisms
YHV Yellow-head virus
WSSV White spot syndrome virus