BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

VOÕ THÒ BÍCH VAÂN
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH ENZYM
PROTEASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM
SỢI PHÂN LẬP TỪ RỪNG NGẬP MẶN
CẦN GIỜ LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT
MÃ SỐ: 06-005

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS: TRẦN THANH THỦY

xuất nhờ protease của chúng có tính chất bền vững rất cao và có khoảng pH hoạt động rộng hơn so
với protease từ động vật, thực vật và vi khuẩn. [22]
Trong cơ thể động vật, thực vật quá trình tổng hợp enzym thường gắn liền với yêu cầu sống
của cơ thể. Vì vậy, muốn thu được enzym cần phải phá bỏ tổ chức đó, nguồn thu enzym thường
phải tươi và quá trình thu enzym phải lệ thuộc vào điều kiện tự nhiên. Bên cạnh đó, thời gian thu
họach dài làm cho việc sử dụng động vật, thực vật để sản xuất enzym là không kinh tế và không
đáp ứng được nhu cầu ngày càng cao về enzym của con người.
Hiện tại và tương lai gần, NS vẫn là một trong những đối tượng quan trọng nhất, kinh tế nhất
trong sản xuất enzym ở qui mô công nghiệp vì:
- Chúng có hệ enzym vô cùng phong phú với hoạt tính cao hơn các sinh vật khác.
- Tốc độ sinh trưởng, phát triển nhanh nên có thể sản xuất lượng lớn enzym trong thời gian
ngắn.
- Có thể sử dụng nguồn nguyên liệu đơn giản, dễ kiếm, rẻ tiền trong nuôi cấy NS sinh enzym.
- Việc tinh chế thu enzym ngoại bào thường dễ dàng với mức chi phí thấp.
Các enzym từ NS được sử dụng rộng rải trong CN chế biến thực phẩm (làm tương, nước
chấm…), trong CN enzym (sản xuất amylaza, proteaza, cellulaza…), CN dược phẩm (sản xuất KS,
steroid…), sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, kích thích tố sinh trưởng TV, sản xuất sinh khối NS để
phục vụ chăn nuôi và dinh dưỡng cho người (mycoprotein), dùng NS để xử lý ô nhiễm MT. [4]
Để tận dụng tối đa nguồn lợi to lớn từ NS đồng thời hạn chế các tác hại do NS gây ra, con
người đã tập trung nghiên cứu các vấn đề liên quan đến NS. Trước đây, các nhà nghiên cứu thường
tập trung tìm hiểu NS phân bố ở đất liền. Những năm gần đây, con người mới nhận thấy hết được
tầm quan trọng của hệ sinh thái RNM - HST có năng suất sinh học cao nhất trong các HST. Với
điều kiện sinh thái của RNM con người có thể nghiên cứu khả năng chịu đựng và phục hồi của các
tổ hợp gen. Từ đây, có thể tìm được các chủng NS có hệ gen bền vững, mang nhiều đặc tính có lợi
cho con người.
Hệ sinh thái RNM Cần Giờ là nơi lưu trữ các nguồn gen sinh vật q hiếm, bền vững và có
khả năng chịu đựng điều kiện sống đặc biệt khắc nghiệt. Đây là nơi có hệ VSV vơ cùng phong phú
và đa dạng như NS, vi khuẩn, xạ khuẩn …., trong đó NS chiếm số lượng rất lớn. Có thể thấy RNM
Cần Giờ là kho dự trữ các chủng NS có hoạt tính enzym cao chưa được khai thác.
Thảm thực vật và các hệ động vật có trong RNM Cần Giờ thật sự là các nguồn thức ăn tốt

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái quát về RNM Cần Giờ TP Hồ Chí Minh
Huyện Cần Giờ tiếp cận với biển Đơng hiện hữu một khu RNM đan xen với hệ thống sơng
rạch dày đặc chứa đựng các HST mang tính đa dạng sinh học cao với nhiều lồi động thực vật đặc
hữu của miền dun hải Việt Nam. Đó là khu RNM Cần Giờ nằm gọn trong địa giới huyện Cần
Giờ và rừng Sác huyện Nhơn Trạch tỉnh Đồng Nai
Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ được hình thành ở hạ lưu sơng Đồng Nai – Sài Gòn
nằm ở cửa ngõ Đơng Nam thành phố Hồ Chí Minh. Phía Bắc giáp tỉnh Đồng Nai, phía Nam giáp
biển Đơng, phía Tây giáp tỉnh Tiền Giang và Long An, phía Đơng giáp tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu.
Tổng diện tích Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ là 75.740 ha, trong đó, vùng lõi 4.721 ha,
vùng đệm 41.139 ha, và vùng chuyển tiếp 29.880 ha.

RNM Cần Giờ
giới hạn bởi các đoạn sơng, rạch, tắc như sơng Sồi Rạp, sơng Vàm Sát, rạch
Đơn, tắc An Nghĩa, sơng Lòng tàu, tắc Rổi, sơng Đồng Tranh, tắc Nước Hội, sơng Thị Vải, sơng
Gò Gia , sơng Cái Mép và biển Đơng, từ bắc xuống Nam dài 28km, từ Đơng sang Tây dài 30km.
Thổ nhưỡng phát triển trên một đầm mặn mới, do phù sa sơng Sài Gòn và sơng Đồng Nai
mang đến và lắng đọng tạo thành nền đất. Đất Cần Giờ được cấu tạo bởi q trình trầm tích sét, q
trình phèn hố và q trình nhiễm mặn.
Khí hậu Cần Giờ nóng ẩm và chịu chi phối của qui luật gió mùa cận xích đạo với hai mùa
mưa nắng rõ rệt.
Lượng mưa: thấp nhất TP. Hồ Chí Minh, trung bình 1300 – 1400mm/năm, mùa mưa thường
bắt đầu từ tháng 4 và kết thúc vào tháng 10, lượng mưa thường tập trung vào tháng 6 và tháng 9.

[35]
- Chế độ nhiệt: Biên độ nhiệt trong ngày từ 5 – 7

đậu, dừa và các vườn cây ăn trái [34].
* Khu hệ động vật
Theo khảo sát sơ bộ của dự án khả thi khu bảo tồn tự nhiên RNM Cần Giờ năm 1999 cho
thấy:
+ Khu hệ ĐV thuỷ sinh không xương sống trên cạn có 9 loài lưỡng thê, 31 loài bò sát, 4 loài
có vú. Trong đó có 11 loài bò sát có tên trong sách đỏ Việt Nam như: tắc kè (gekko gekko), kỳ đà
nước (varanus salvator), trăn đất (python molurus), trăn gấm (python reticulatus), rắn cạp nong
(bungarus fasciatus), rắn hổ mang (naja naja), rắn hổ chúa (ophiophagus hannah), vích (chelonia
mydas), cá sấu hoa cà (crocodylus porosus)…

[34].

+ Khu hệ chim có khoảng 130 loài thuộc 47 họ, 17 bộ. Trong đó có 51 loài chim nước và 79
loài không phải chim nước sống trong nhiều sinh cảnh khác nhau [35].

Phân vùng khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ: Tổng diện tích khu dự trữ sinh quyển RNM Cần
Giờ là 75.740 ha, trong đó vùng lõi 4.721 ha, vùng đệm 41.139 ha và vùng chuyển tiếp 29.880 ha
[35] .

* Khu hệ VSV
- Vi khuẩn
VK cùng với nấm tạo nên một thành phần quan trọng trong hệ sinh thái RNM. Là những SV
phân huỷ, chúng đóng vai trò trung tâm về mặt chức năng trong HST này. Số lượng VK trong RNM
chiếm tỉ lệ khá cao, đặc biệt là trong trầm tích các quần thể VK dị dưỡng nhiều gấp 2-3 lần lớp nước
trên mặt, các quần thể trên nền bùn lớn gấp vài lần trên nền cát [34]. Nhiều loài sống trên các giá thể
bề mặt rắn bằng chất nhầy dính bám. Do đó, VK có thể tạo nên một bề mặt mỏng trên mặt bùn tạo
điều kiện cho các loài tảo, cỏ biển và cây ngập mặn phát triển.
- Nấm
Khu hệ nấm trong RNM nhiều và rất đa dạng. Phần lớn là vi nấm, chỉ có một số loài có kích
thước lớn. Nấm đóng vai trò quan trọng trong RNM, cùng với VK chúng góp phần phân huỷ nhanh

Bên cạnh các giá trị về lâm sản như than, gỗ, củi, thức ăn, thuốc… RNM còn đóng vai trò
quan trọng trong việc điều hòa khí hậu, mở rộng diện tích đất bồi, hạn chế xói lở và quá trình xâm
thực bờ biển.

RNM

cung cấp chất hữu cơ để tăng năng suất cho vùng ven biển, là nơi sinh sản hoặc
ươm nuôi của nhiều loài hải sản có giá trị kinh tế cao như tôm, cua, cá,…
Mặt khác, RNM còn có tác dụng làm chậm dòng chảy và phát tán rộng nước triều, làm giảm
mạnh độ cao của sóng khi triều cường. Hạn chế tác hại của sóng thần và bão lớn, hạn chế xâm nhập
mặn và bảo vệ nước ngầm. RNM bảo vệ đa dạng sinh học, điều chỉnh nồng độ muối của MT, làm
sạch MT nước khi có lũ lụt, lũ quét, sạt lở đất [4][18].
1.2 Sơ lược veà NS RNM Cần Giờ
1.2.1 Vị trí phân loại.
Theo G.C.Ainsworth (1973): Hệ thống của giới nấm bao gồm hai ngành: Myxomycota và
Eumycota. Eumycota bao gồm 5 ngành phụ: Mastigomycotina, Deuteromycotina, Zygomycotina,
Ascomycotina và Basidiomycotina [41]
Ngành phụ Deuteromycotina được chia

theo 3 lớp: [42
]
+ Blastomycetes: Khuẩn ty không phát triển hoặc phát triển yếu; dạng cơ thể giống như nấm
men và có sự nảy chồi.
+ Hyphomycetes: Khuẩn ty thật, không nảy chồi; sợi nấm bất dục hoặc sinh BT trên cuống,
không có sự tập trung thành túi BT hay cụm cuống BT.
+ Coelomycetes: Khuẩn ty thật, BT tập trung trong túi BT hoặc trên cụm cuống BT:
Lớp Hyphomycetes được chia thành 3 bộ: Moniliales, Melanconiales và Sphaeropsidales.
Sợi nấm (hypha) có dạng hình ống phân nhánh, bên trong chứa chất nguyên sinh có thể
chuyển động, đường kính 1-30µm (thông thường là 5-10 µm).
Đỉnh sợi nấm có hình chóp nón không tăng trưởng, có tác dụng bảo vệ phần ngọn của sợi
nấm. Phần này chất nguyên sinh không có nhân và chứa ít cơ quan tử. Tiếp đến là phần tăng trưởng
chứa nhiều nhân, nhiều cơ quan tử và nhiều enzym. Đây là phần quyết định sự tăng trưởng và phân
nhánh của sợi nấm. Dưới nữa là phần thành cứng - phần thành thục của sợi nấm. Bắt đầu từ phần
này trở xuống là chấm dứt sự tăng trưởng của sợi nấm [4] [44].
Nhân tế bào được bao bọc bởi màng nhân, trên màng nhân có nhiều lỗ nhỏ, trong nhân có
hạch nhân (nucleolus). Trong tế bào nấm còn có ty thể (mitochondrion), mạng nội chất
(endoplasmic reticulum), dịch bào hay không bào (vacuolus), ribosome, bào nang (vesicle), thể
golgi [4], các giọt lipid, các tinh thể (chrystal) và các vi thể đường kính 0,5-1,5 nm (microbody), các
thể vôrônin đường kính 0,2µm (Woronin body), thể chitô đường kính 40-70 nm (chitosome)…
Ngoài ra trong tế bào chất còn có các vi quản rỗng ruột, đường kính 25 nm (microtubule), các vi sợi
đường kính 5-8 nm (microfilament), các thể màng biên (plasmalemmasome)
Hình 1.1: Sợi nấm có vách ngăn và sợi nấm không có vách ngăn


Vách tế bào
Màng tế bào
Nhân
Thể
golgi
Không bào
Ti thể
Luới
nội chất
Nhân

đáng quí như khả năng sinh ra các sản phẩm giúp khống chế VSV có hại mà NS có thể cải thiện MT
sống cũng như giúp con người nâng cao khả năng điều trị bệnh tật.
Đa số các NS từ RNM đều có khả năng chịu mặn cao. Chúng có thể sinh trưởng ở nồng độ
muối từ 1,5 % - 2,5%. Thậm chí, một số nấm sợi RNM còn có thể sinh trưởng ở nồng độ muối 30%
[13]. Đây là một đặc điểm rất có ý nghĩa sinh thái đối với RNM.
Tóm lại, NS ở RNM có những đặc tính sinh học rất đáng quí cần được khai thác nhằm phục
vụ nhu cầu và lợi ích của con người. Tuy nhiên, những nghiên cứu về NS RNM còn rất khiêm tốn,
chưa tương xứng với qui mô và tiềm năng của chúng,
1.2.3 Sinh sản của NS

Nói chung, NS sinh sản dưới 2 hình thức: vô tính và hữu tính
Sinh sản vô tính
NS sinh sản vô tính thể hiện qua 2 dạng: sinh sản dinh dưỡng bằng đoạn sợi nấm phát triển
dài ra hoặc phân nhánh và sinh sản bằng các loại bào tử.
Bào tử kín: được tạo thành từ đỉnh một sợi nấm được phân hóa làm nhiệm vụ sinh sản.
Bào tử trần: là loại bào tử vô tính thường gặp nhất ở nấm. Chúng có hình dạng, kích thước,
kết cấu hết sức phong phú. Tế bào sinh bào tử trần gọi là giá (hay cuống) bào tử trần (conidiophore).
1.2.4 Vai troø cuûa NS
NS được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm nhiều do khả năng sinh các chất có họat
tính sinh học được ứng dụng rộng rãi, lợi ích kinh tế cao như: nguồn enzym, các chất kháng sinh,
các axit hữu cơ, các chất có khả năng phân giải nguồn cacbonhydrat [5],[9].

Họat tính enzym thủy phân ngoại bào.
Enzym là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa học trong và ngoài cơ
thể [22]. Đến nay, các nhà khoa học đã tìm được khoảng 3.500 loại enzym, trong đó phần lớn là
enzym từ thực vật và VSV. NS có tiềm năng lớn nhất sinh các lọai enzym ngoại bào mạnh, phân
giải và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ, vô cơ khó tan trong tự nhiên. Một số enzym đã được tinh
sạch, nghiên cứu kỹ và ứng dụng phổ biến như: xellulase, protease, amylase, pectinase và kinase
[5].
 Enzym cellulase: Cellulase là một nhóm nhiều enzym xellulase C
1
( endo cellulase),
cellulase C
x
(exoxellulase) và xellobiaza có tác dụng thủy phân cellulose tạo thành glucose. Các
VSV có hoạt tính cellulase cao là các loài vi khuẩn, xạ khuẩn chịu nhiệt và NS. Trong đó, các
chủng NS thuộc chi Trichoderma, Penicillium, Aspergillus,….có khả năng sinh enzym cellulase
được sử dụng trong chăn nuôi để nâng cao sự tiêu hóa cellulose ở động vật. Ngoài ra chúng còn
được dùng trong sản xuất glucose từ bã và sản phẩm thải ở của công nghiệp rừng, làm phân bón,
xử lí rác thải[17],[18].
 Enzym protease: Protease là nhóm enzym thủy phân protein thành peptit và axit amin
bằng cách cắt đứt các liên kết peptid. Protease gồm có proteinaza và peptidaza chúng có tính đặc
hiệu tương đối rộng. Protease NS có khoảng pH hoạt động rộng hơn so với protease động vật và vi
khuẩn, người ta chia protease NS thành ba nhóm: protease axit, protease kiềm và protease trung
tính. NS có khả năng phân giải mạnh protein thường gặp thuộc các chi Penicillium, Aspergillus…
Protease NS thường được dùng nhiều trong sản xuất nước chấm, sản xuất bánh mì, bánh quy
….[8], [10],[20].

Ngày nay, nhu cầu sử dụng axit hữu cơ từ VSV ngày càng nhiều. Các axit hữu cơ như axit
acetic, axit lactic và một số axit hữu cơ khác được ứng dụng nhiều trong công nghệ chế biến mủ
cao su, trong công nghiệp nhẹ và cả trong y học. Năm 2004, Võ Thị Hạnh đã nghiên cứu sản xuất
axit citric bằng A. niger từ rỉ đường mía và bã khoai mì. Ngoài ra, các nhà khoa học Nhật Bản
tổng hợp được chất kích thích sinh trưởng Giberelin từ hai chủng F. monoforme và F. oxysporum
[19], [20]
1.2.5 Tình hình nghiên cứu nấm sợi RNM trên thế giới và Việt Nam
Hiện nay, có khoảng 800 - 1000 loài nấm biển được định loại (Hawkswworth et al., 1995;
Jones, 1995), trong khi đó có một số lượng lớn các loài nấm trên đất liền đã được phân loại. Sự hiểu
biết của loài người về nấm RNM và vai trò của chúng đối với khu HST này còn quá ít và chưa đầy
đủ (Agate A.D., Subramania, C.V và Anuci, V.1998). Sự nghiên cứu về nấm RNM mới chỉ được
các nhà nấm học quan tâm từ năm 1950.
Theo cơ sở dữ liệu (chưa đầy đủ) của mạng nấm RNM toàn cầu có thể thấy nhiều nước đã và
đang tích cực nghiên cứu phân loại và hệ thống hoá các loài nấm biển có mặt ở vùng RNM của họ.
Cụ thể: Ấn Độ đã phân loại được 170 loài, Hồng Kông: 170 loài, Đài Loan: 7 loài, Trung Quốc: 2
loài, Singapore: 116 loài, Nhật: 26 loài, Úc: 67 loài, Mỹ: 18 loài, Malaysia: 164 loài, Indonesia: 7
loài, Thái Lan: 83 loài, Brasil: 48 loài, Mexico: 94 loài, Kuwait: 14 loài, Đức: 4 loài. Qua đó, có thể
thấy phân loại nấm biển RNM còn rất ít và chưa đáp ứng đủ yêu cầu cấp bách cho sự tiến bộ của
ngành VSV học [35].
Năm 1988, Agate A.D, Subramania C.V và Vanuci M đã nêu ra tám lĩnh vực nghiên cứu
cấp bách của VSV học RNM cần được các nhà khoa học giải quyết. Trong đó, có lĩnh vực phân loại
và hệ thống hoá cơ bản các loài VSV của RNM trên thế giới.
Năm 1979, Kohlmeyer là người đầu tiên đánh giá vai trò quan trọng của các nấm đối với các
chu trình tuần hoàn vật chất trong hệ sinh thái RNM. Ông đã nhận dạng được 43 loài nấm bậc cao,
bao gồm 23 loài thuộc Ascomycetes, 17 loài thuộc Deuteromycetes và 3 loài thuộc Basidiomycetes.
Năm 1990, Hyde đã liệt kê 120 loài nấm RNM trên toàn thế giới. Trong đó, bao gồm 87 loài
thuộc Ascomycetes, 31 loài thuộc Deuteromycetes và 2 loài thuộc Basidiomycetes.
Những nghiên cứu gần đây đã phát hiện ra một số lượng lớn loài mới, thậm chí là chi mới.
Bộ sưu tập nấm RNM ở Macau và Hồng Kông tìm được 45 loài mới, 28 loài trong số mới này tìm
được ở Macau và 21 loài được tìm thấy ở Hồng Kông (Vrijmoed et al., 1994)

cấu thành từ 4 nguyên tố chính là cácbon, hiđro, oxy và nitơ
.
Các loại prôtêin đơn giản gồm các axit
amin nối nhau nhờ các liên kết peptit bền vững. Các loại prôtêin phức tạp hơn có liên kết thêm với
các nhóm bổ sung. Prôtêin chiếm tới trên 50% khối lượng khô của tế bào và là vật liệu cấu trúc của
tế bào
.

Cấu trúc của prôtêin
Các axit amin nối với nhau bởi liên kết peptit hình thành nên chuỗi pôlipeptit. Đầu mạch
pôlipeptit là nhóm amin (của axit amin thứ nhất), cuối mạch là nhóm cacbôxyl (của axit amin cuối
cùng). Một phân tử prôtêin đơn giản có thể chỉ được cấu tạo từ vài chục axit amin nhưng cũng có
những phân tử prôtêin bao gồm nhiều chuỗi pôlipeptit với số lượng axit amin rất lớn.
Chức năng của protein
Prôtêin là thành phần không thể thiếu được của mọi cơ thể sống. Chúng đóng vai trò cốt lõi
của cấu trúc nhân, của mọi bào quan, đặc biệt là hệ màng sinh học Các enzym có bản chất là prôtêin
đóng vai trò xúc tác cho các phản ứng sinh học.
Một số prôtêin có vai trò như những “xe tải” vận chuyển các chất trong cơ thể (ví dụ
hêmôglôbin).
H
2
O
Tham gia cấu thành các kháng thể có tác dụng bảo vệ cơ thể tránh khỏi sự xâm hại của vi
khuẩn, nâng cao sức đề kháng của cơ thể
Điều tiết áp lực thẩm thấu: Nếu trong bữa ăn bị thiếu protein lâu ngày, hàm lượng protein
trong huyết tương sẽ hạ thấp, thành phần nước trong máu sẽ thấm quá nhiều vào các mô xung
quanh, gây ra phù nề do thiếu dinh dưỡng.
Các hoocmôn - phần lớn là prôtêin – có chức năng điều hoà quá trình trao đổi chất trong tế bào
và trong cơ thể (ví dụ insulin điều hoà lượng đường trong máu).



H CHCO – NH CH COOH


R
1
R
2
R
n

H
2
N CH COOH + H
2
NCHCO – NHCHCOOH

R
1
R
2
R
n H
2
O
Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc
hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng.

Năm 2007 Th.S Phan Thị Thanh Quế sử dụng hệ enzym protease của nấm mốc Aspergilus
oryzae để thủy phân protein thịt cá trong chế biến nước mắm.
Ngoài những nghiên cứu về protease của NS còn có những công trình nghiên cứu về các chất
có hoạt tính sinh học từ NS như:
Các chế phẩm từ NS được nghiên cứu và sử dụng phòng trừ nhiều loại côn trùng, VSV gây
hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau ( Harman và Kubicek, 1998)
Từ NS RNM người ta đã thu được một số chất kháng sinh mới có khả năng chống các VSV
gây bệnh đã nhờn các loại thuốc kháng sinh hiện có ( Isaka M, Suyarnsestakorn C, Tanticharoen M,
Kongsaeree P, Thebtaranonth Y, 2002)
Năm 2007 Phan Thanh Phương khảo sát khả năng sinh kháng sinh của các chủng nấm sợi
phân lập từ RNM Cần Giờ TP. Hồ Chí Minh.
Năm 2001 Nguyễn Quang Huy, Cù Việt Nga, Lưu Thị Bích Thảo, Đặng Thị Cẩm Hà phân
lập được một số chủng NS phân giải các thành phần hydrocacbua thơm và các hợp chất mạch vòng
benzen trong dầu mỏ.
Năm 2007 Phạm Thị Thanh Thuý đã nghiên cứu khả năng phân giải carbuahydro của một số
chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ.
 Một số ứng dụng của protease [39], [28]
Trong chế biến thực phẩm

Trong công nghiệp chế biến thịt, protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một
phần protein trong thịt. Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm: từ Streptomyces fradiae tách được
chế phẩm keratineza thuỷ phân được keratin rất có giá trị để sản xuất dịch đạm từ da, lông vũ. Để
thuỷ phân sâu sắc và triệt để protein (trong nghiên cứu, chế tạo dịch truyền đạm y tế) cần dùng các
protease có tính đặc hiệu cao và tác dụng rộng. Muốn vậy, người ta thường dùng phối hợp cả 3 loại
protease của 3 loài: vi khuẩn, nấm mốc, thực vật với tỷ lệ tổng cộng 1- 2% khối lượng protein cần
thuỷ phân
Trong chế biến thuỷ sản: Khi sản xuất nước mắm (và một số loài mắm) thời gian chế biến
thường dài, hiệu suất thuỷ phân (độ đạm) lại phụ thuộc rất nhiều địa phương, phương pháp gài nén,
nguyên liệu cá. Hiện nay, quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện, trong đó sử
dụng chế phẩm protease thực vật (bromelain và papain) và từ VSV để rút ngắn thời gian làm và cải

có tác dụng làm da, tóc mềm mại, tách biểu bì đã chết, tạo sự phát triển lớp da non.
Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong số ngành khác như:
- Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và sản
xuất một số thức ăn kiêng.
- Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm
thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao.
- Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine, KS
1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tổng hợp protease của NS a. Nguồn
cacbon
Trong MT nuôi cấy NS sinh protease nhất thiết phải có protein làm chất cảm ứng và nguồn
cacbon. NS có khả năng đồng hóa rất nhiều nguồn cacbon khác nhau. Nguồn cacbohydrat là dễ hấp
thu nhất, trong đó glucose là nguồn cacbon duy nhất tham gia vào phản ứng trong ba chu trình
chuyển hóa: con đường Embden Meyerhof (1930), Pentose và Entner Doudoroff [24],[25]. Nguồn
cacbon cho sinh trưởng của NS thường dùng là glucose.
b. Nguồn nitơ
Các nguồn nitơ có ý nghĩa rất quan trọng đối với sự phát triển của NS. Nguồn nitơ dễ hấp thụ
nhất là NH
4
+
và NO
3
-
, chúng thâm nhập vào tế bào dễ dàng và ở đó chúng tạo nên các nhóm imin
và amin.
Các muối amon của axit hữu cơ thích hợp đối với dinh dưỡng của NS hơn là muối amon vô
cơ. Cơ chất dùng để cảm ứng NS sinh protease thường là bột đậu nành, cám, ngô, casein, cao
thịt,…[28].
c. Độ ẩm
Độ ẩm trong MT lên men bán rắn là hàm lượng nước có trong cơ chất rắn. Các cơ chất khác
nhau có khả năng giữ nước khác nhau từ 30-80% (Moo-Young, 1983). Trong quá trình nuôi cấy NS

cám để sản xuất amylase khoảng 36-40 giờ, nhưng nuôi A .oryzae để thu protease khoảng 48 – 52
giờ [25].
1.3.5 Nuôi cấy và thu nhận enzym từ NS [20]
Nuôi cấy
Nuôi cấy NS để thu enzym người ta thường dùng MT bán rắn
Môi trường bán rắn thường là các nguyên liệu tự nhiên như: cám, ngô, bột đậu tương,… Môi
trường bán rắn hay dùng nhất là cám. Chất lượng cám ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh tổng hợp
enzym, muốn nâng cao hoạt tính một số enzym cần thêm vào cám các chất cảm ứng như bột đậu
tương giàu protein, bã khoai mì giàu tinh bột, củ cải đường giàu pectin và xelullose,….Ngoài ra, cần
bổ sung thêm khoảng 15 – 20% trấu, rơm băm vụn, mùn cưa…để tạo độ xốp.cho MT.
Môi trường bán rắn cần được làm ướt tới độ ẩm 60 – 65% rồi đem thanh trùng. Môi trường
được tãi mỏng ra các khay đã được thanh trùng với lớp dày khoảng 2-2.5cm hoặc trong các bình
tam giác, để nguội tới 30
0
C thì tiến hành cấy giống.
Quá trình nuôi cấy NS trên môi trường bán rắn được chia làm 3 thời kì:
Khoảng 10-14 giờ đầu bào tử trương nở bắt đầu nảy mầm, thời kì này chưa hình thành enzym
Thời kì giữa kéo dài khoảng 14-18 giờ, mốc phát triển nhanh hô hấp mạnh, sợi nấm có thể
quan sát thấy bằng mắt thường
Thời kì thứ ba kéo dài trong khoảng 10-20 giờ ,thời gian này các quá trình trao đổi chất vẫn
tiếp tục nhưng yếu dần việc tạo thành enzym của tế bào vẫn tiếp tục
Tùy thuộc vào đặc tính sinh lý của từng chủng NS, thời gian nuôi cấy có thể kết thúc tại điểm
mà lượng enzym tạo thành tối đa.
Các phương pháp thu nhận enzym [20], [24]
* Chiết rút enzym từ MT bán rắn :
Nguyên tắc: dựa trên khả năng hòa tan trong nước của các enzym
Các bình tam giác đã cấy giống sau khi nuôi đủ thời gian, thu lấy MT đem nghiền mịn bằng
cách giã trên cối với sự trợ giúp của cát thạch anh hoặc bột thủy tinh đã được rửa sạch và sấy khô.
Cát hay bột thủy tinh làm tăng khả năng phá vỡ tế bào của VSV mà không làm thay đổi bản chất
enzym. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 Vật liệu
2.1.1 Đối tượng
- Các chủng nấm sợi phân lập từ các mẫu đất, thân, lá cây ở 4 xã RNM Cần Giờ TP.
HCM: Tam Thơn Hiệp, An Thới Đơng, Long Hòa, Lý Nhơn
-
Bột đậu tương ,mua ở chợ Tân Định – TP. HCM
-

Cám gạo, trấu

mua ở Vĩnh Long

- Các VSV kiểm định: E.coli, B. subtilis được cung cấp từ viện Pasteur – TP. HCM
- Chế phẩm enzym protease của Cơng ty TNHH dinh dưỡng Á Châu (VN) tỉnh Đồng Nai.
2.1.2 Hóa chất – thiết bị
 Hóa chất
- Glucose, sorbitol, maltose, sucrose, lactosse, pepton, cazein, kitin, tinh bột tan, agar, cồn.
- K
2
HPO
4
, KCl, NaCl, NaOH, NaNO
3
, MgSO
4

K
2
HPO
4
1,0g
MgSO
4
0,5g
KCl 0,5g
FeSO
4
0,1g
Glucose 20g
Agar 20g
Nước biển 1000ml
pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/30 phút
 MT2: Glucose Yeast Agar (YEA) MT nuôi cấy NS [32]
Cao nấm men 4g
Agar 20g
Glucose 20g
Nước biển 1000ml
pH = 5,5 – 6.0. Khử trùng 1 atm/30 phút
 MT3 thử hoạt tính enzym cellulose [30]
NaNO
3
3,5g
K
2
HPO
4

.7H
2
O 0,01g
Cazein 10g
Agar 20g
Nước biển 1000ml
pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/30 phút
 MT 5: thử hoạt tính amylase [30]
NaNO
3
3,5g
K
2
HPO
4
1.5g
MgSO
4
.7H
2
O 0,5g
KCl 0,5g
FeSO
4
.7H
2
O 0,01g
Tinh bột tan 15g
Agar 20g
Nước biển 1000ml

Khử trùng 121
0
C trong 30 phút
 MT 8: thử hoạt độ enzym protease [20]
Dung dịch NaOH 0,5N
Acid trichloacetic 10%
Casein 1% (R55)
Tyrosine (R57)
Thuốc thử Folin- Ciocalteu (R56)
 MT9: MT phát hiện khả năng phân giải dầu [21]
KH
2
PO
4
: 3.3g
MgSO
4
: 0.4g
KNO
3
: 3g
Na
2
HPO
4
: 0.7g