BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
NGUYỄN THỊ NHÃ VY

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH HOẠT CHẤT ĐỐI
KHÁNG VI SINH VẬT GÂY BỆNH CHO CÂY
TRỒNG CỦA CÁC CHỦNG NẤM SỢI PHÂN LẬP
TỪ RỪNG ĐÀ LẠT TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là kết quả của quá trình tự tìm tòi nghiên cứu của
chính tôi, không sao chép bất cứ thành quả của công trình nghiên cứu nào và tôi
hoàn toàn chịu trách nhiệm trước các nội dung đã trình bày trong luận văn.

MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa.
Lời cám ơn.
Lời cam đoan.
Mục lục.
Danh mục các chữ viết tắt.
Danh mục các bảng.
Danh mục cách hình vẻ, đồ thị.
MỞ ĐẦU
Chương 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.2.1 Phương pháp VSV 63
2.2.2 Phương pháp quan sát hình thái nấm sợi 65
2.2.3 Các phương pháp hoá sinh 66
2.2.4 Thử hoạt tính đối kháng với các chủng nấm bệnh cho cây trồng 70
2.2.5 Phương pháp kiểm tra độ bền nhiệt của hoạt chất đối kháng 71
2.2.6 Phương pháp bảo quản giống nấm sợi trên môi trường thạch có lớp
d
ầu khoáng 72
2.2.7 Phương pháp xử lí số liệu bằng toán thống kê đơn giản. 72
2.2.8 Phương pháp định danh vi nấm bằng phương pháp giải trình tự ở
công ty Nam Khoa. 72

Chương 3 : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 Kết quả phân lập và thuần khiết các chủng nấm sợi từ rừng Đà Lạt 76
3.2 Khảo sát khả năng sinh hoạt chất đối kháng của các chủng nấm sợi phân lập
được 77
3.3 Tuyển chọn những chủng nấm sợi có họat tính đối kháng cao 81
3.4 Khảo sát phổ đối kháng với VSV gây bệnh 83
3.5 Các đặc
điểm sinh học và phân loại của các chủng nấm sợi đã được tuyển
chọn 90
3.5.1 Đặc điểm hình thái, phân loại 90
3.5.2 Một số đặc điểm sinh lý, sinh hoá của các chủng nấm sợi nghiên cứu
95
3.6 Bước đầu ứng dụng các chủng nấm sợi được tuyển chọn để phòng và trị
bệnh cho cây Địa Lan (Cymbidium) 110
3.6.1 Ứng dụng chủ
ng Trichoderma atroviride trong phòng bệnh cho cây
Địa Lan (Cymdibium) 110
3.6.2 Ứng dụng chủng ĐTN4.19 trong trị bệnh thối rễ ở cây Địa Lan

TBT: Trung bình tháng
TBN: Trung bình năm

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Hiệu quả việc sử dụng phối hợp glucose và galactose đối với sự
phát triển của Aspergillus niger (nuôi cấy tĩnh ở 20oC trong 7 ngày).
Bảng 1.2: Diện tích gieo trồng rau và hoa cắt cành từ năm 1996-2005.
Bảng 3.1 : Kết quả khảo sát khả năng sinh hoạt chất đối kháng của các
chủng nấm phân lập từ rừng Đà Lạt – Lâm Đồng ở các vị trí lấy mẫu.
B
ảng 3.2 : Kết quả thống kê hoạt chất đối kháng của các chủng nấm sợi
phân lập từ rừng Đà Lạt – Lâm Đồng.
Bảng 3.3 : Những chủng nấm sợi có hoạt tính đối kháng cao.
Bảng 3.4: Khảo sát khả năng đối kháng với VSV gây bệnh ở cây trồng của
các chủng nấm sợi được tuyển chọn.
Bảng 3.5: Đặc điểm phân loại của chủng nấm s
ợi ĐTN3.8.
Bảng 3.6: : Hoạt tính enzyme của các chủng sợi được tuyển chọn.
Bảng 3.7: Khả năng đồng hoá nguồn Cacbon, Nitơ khác nhau của các
chủng nấm sợi đã được tuyển chọn.
Bảng 3.8: Khảo sát ảnh hưởng của độ pH tới sự sinh trưởng, phát triển của
các chủng nấm sợi được tuyển chọn.
Bảng 3.9: Khảo sát ảnh hưởng của độ pH lên hoạ
t tính đối kháng của 2

Hình 3.10: Khả năng đồng hóa nguồn Nitơ khác nhau
Hình 3.11: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng, phát triển của các chủng
nghiên cứu.
Hình 3.12: Đốt Trấu và Dớn làm giá thể trồng Địa Lan và bổ sung
Trichoderma atroviride.
Hình 3.13: Cây Địa Lan được trồng trên các loại giá thể khác nhau
Hình 3.14: Rễ cây Địa Lan sau 3 tháng trồng trên các lo
ại giá thể khác
nhau.
Hình 3.15: Ứng dụng chủng ĐTN4.19 trong trị bệnh thối rễ cho cây Địa
Lan DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ
Đồ thị 3.1: Khả năng đồng hóa nguồn Cacbon khác nhau của 2 chủng nấm
sợi được tuyển chọn.
Đồ thị 3.2: Khả năng đồng hóa nguồn Nitơ khác nhau của hai chủng nấm
sợi đã được tuyển chọn.
Đồ thị 3.3: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng, phát triển của hai chủng
nấm sợi được tuyển chọn.
Đồ thị
3.4: Ảnh hưởng độ pH ban đầu lên hoạt chất đối kháng của 2 chủng
nấm sợi được tuyển chọn.
Đồ thị 3.5: Ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng, phát triển của hai

các hoạt ch
ất đối kháng chống lại các sâu, bệnh đó. Trên con đường tìm kiếm những
giống VSV có khả năng kháng sâu, kháng bệnh mới có hoạt tính cao. Chúng tôi
nhắm đến nấm sợi và tiến hành nghiên cứu những khả năng tuyệt vời của nó trong
phòng trừ sâu, bệnh. Hi vọng trên vùng đất Đà Lạt – Lâm Đồng với đặc điểm khác
2
biệt về địa hình, thời tiết – khí hậu, chúng ta có thể tìm ra những chủng nấm sợi có
những đặc tính ưu việt mới trong phòng trừ bệnh hại cây trồng.
Theo thông tin mà chúng tôi thu thập được, hiện nay có rất ít các công trình
nghiên cứu về khu hệ nấm sợi ở rừng Đà Lạt. Tài liệu duy nhất mà chúng tôi thu
thập được đó là đề tài: Nghiên cứu khu hệ vi nấm gây bệnh và có lợi cho cây
thông vùng Đà Lạt – Lâm Đồng n
ăm 2004 do Viện Khoa học và công nghệ Miền
Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới, Phân viện Sinh học tại Đà Lạt (Nay là Viện Sinh
Học Tây Nguyên) thực hiện. Còn các đề tài về tìm hiểu khả năng sinh hoạt chất đối
kháng của hệ nấm sợi rừng Đà Lạt chưa thấy có tài liệu nào được công bố.
Xuất phát từ thực tế trên, việc tiến hành thực hiện đề tài : “Nghiên cứu kh
ả
năng sinh hoạt chất đối kháng VSV gây bệnh cho cây trồng của các chủng nấm sợi
phân lập từ rừng Đà Lạt” là việc làm rất cần thiết.
2. Mục đích đề tài
Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng sinh hoạt chất đối
kháng có thể ức chế, tiêu diệt các VSV gây bệnh cây trồng.
3. Nội dung nghiên cứu đề tài:
- Phân lậ
p và thuần khiết các chủng nấm sợi từ rừng Đà Lạt.
- Xác định khả năng sinh hoạt chất đối kháng của các chủng nấm sợi
phân lập được và tuyển chọn các chủng nấm sợi có hoạt tính đối kháng cao.
- Thử khả năng ức chế các VSV gây bệnh ở cây trồng để tiến tới chọn
ra những chủng nấm sợi tiêu biểu.

Chương 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Chương 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chương 3 : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Kết Luận và Kiến nghị
4
8. Nơi thực hiện đề tài
- Phòng thí nghiệm Vi Sinh thuộc khoa Sinh – ĐH Sư Phạm Tp. HCM.
- Phòng thí nghiệm Vi Sinh thuộc khoa Sinh – ĐH Đà Lạt.
- Phòng thí nghiệm Vi Sinh – Viện Sinh học Tây Nguyên.
- Vườn Địa Lan 45 Bạch Đằng Phường 7 Đà Lạt. 5
Chương 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Nấm sợi
1.1.1 Đặc điểm cơ bản của nấm sợi.
Nấm học (Mycology) được khai sinh bởi nhà thực vật học người Ý tên là
Pier Antonio Micheli (1729) qua tài liệu công bố “giống cây lạ” (Nova Plantarum
Genera) nhưng theo Giáo sư Ekriksson Gunnan (1978) thì người có công nghiên
cứu sâu về nấm sợi lại là Elias Fries (1794-1874).
Theo Elizabeth Tootyll (1984) nấm sợi có khoảng 5.100 giống và 50.000 loài
được mô tả. Tuy nhiên, ước tính có trên 100.000 đến 250.000 loài nấm hiện diện
trên trái
đất. [45]
1.1.1.1 Hình dạng, kích thước, cấu tạo của nấm sợi
1.1.1.1.1 Hình dạng và kích thước
Một số ít nấm ở thể đơn bào có hình trứng (yeast=nấm men), đa số có hình


Hình 1.2: Sự phát triển của hệ sợi nấm
7
Phần lớn sợi nấm có dạng trong suốt, ở một số nấm, sợi nấm mang sắc tố tạo
nên màu tối hay mà sặc sỡ. Sắc tố của một số nấm còn tiết ra ngoài môi trường và
làm đổi màu khu vực có nấm phát triển. Một số nấm còn có các chất hữu cơ tạo nên
các tinh thể trên bề mặt khuẩn lạc. Vì bào tử của nấm thường có màu nên khuẩn lạc
th
ường có màu. [46]
1.1.1.1.2 Cấu tạo của nấm sợi
Tế bào nấm sợi có thành phần cấu tạo cơ bản như các loài nấm lớn và ở các
nhóm sinh vật có nhân thực khác, nghĩa là gồm thành tế bào, chất nguyên sinh, nhân
tế bào, không bào và các thể ẩn nhập.
Thành tế bào dày khoảng 0,2µm, nhưng có tính phản quang mạnh nên có thể
phân biệt được rõ ràng ở kính hiển vi quang học. [4]
Vách tế bào nấm cấu tạo bởi vi sợi chitin và có hoặc không có cellulose.
Chitin là thành phần chính của vách tế bào ở hầu hết các loài nấm trừ nhóm
Oomycetina. Những vi sợi chitin được hình thành nhờ vào enzyme chitin syntase.
Nhân tế bào được bao bọc bởi màng nhân, trên màng nhân có nhiều lổ thủng,
trong nhân có hạch nhân (nucleolus). Thường có nhiều nhân tập trung ở phần ngọn
của sợi nấm. Trong các tế bào phía sau ngọn thường chỉ có 1-2 nhân. Nhân của nấm
thường nhỏ, khó thấy rõ dưới kính hiển vi quang học. Nhân của tế bào nấm có hình
cầu hay bầu dụ
c với màng đôi phospholipid và protein dầy 0,02µm, bên trong màng
nhân chứa ARN và DNA.
Trong tế bào nấm chứa mạng nội chất (endoplasmic reticulum), thể
ribosomes (ribosome), không bào (vacuoles), bào nang (vesicle), thể Golgi (Golgi
body, Golgi apparatus, dictyosome), các giọt lipid (lipid droplet), các tinh thể
(chrystal) và các vi thể đường kính 0,5-1,5nm (microbody), các thể Vôrônin đường
kính 0,2µm (Woronin body), thể Chitôxôm đường kính 40-70nm (chitosome)…ty

thức ăn cacbon nào đó có thể
được đánh giá bằng nhiều chỉ tiêu khác nhau như mức
độ sinh trưởng tối đa của hệ sợi nấm, mức độ hình thành tối đa số lượng bào tử,
mức độ tích lũy tối đa các chất chuyển hoá. Sự sinh trưởng tối đa của hệ sợi nấm
thường không phù hợp với sự tích lũy tối đa các sản phẩm trao đổi chất. Hầu hế
t các
loại nấm sợi có thể đồng hoá trực tiếp mantose, lactose, melibiose, rỉ đường…
Nhiều loại nấm sợi còn có khả năng đồng hoá cả các hợp chất hữu cơ rất bền vững
hoặc rất độc đối với nhiều loại sinh vật khác (hợp chất n-alcan, alkaloid, phenol,
sterin, nhiều chất kháng sinh, nhiều độc tố). [4], [13]
9
Các loài nấm sợi thường không có những đòi hỏi nghiêm khắc đối với một
loại thức ăn cacbon nào. Chúng thường có khả năng sử dụng nhiều loại cacbon khác
nhau, tuy nhiên có thể là loại hợp chất cacbon này được đồng hoá tốt hơn loại hợp
chất khác. Trong nhiều trường hợp nếu có mặt trong môi trường vài nguồn Cacbon
khác nhau chúng sẽ phát triển mạnh mẽ hơn so với khi chỉ có riêng biệt từng loạ
i
một. Có thể lấy nghiên cứu của Horr ở bảng 1.1 làm ví dụ:
Bảng 1.1: Hiệu quả việc sử dụng phối hợp glucose và galactose đối với sự
phát triển của Aspergillus niger (nuôi cấy tĩnh ở 20
o
C trong 7 ngày).
Loại đường Nồng độ (g/l)
Trọng lượng khô của hệ
sợi nấm
Galactose Glucose


ra. Ngược lại với muối amon, nitrat là những muối có tính kiềm sinh lý, sau khi
nấm sợi đồng hoá gốc NO
3
-
trong môi trường sẽ tích lũy lại các cation Na
+
, K
+
… và
do đó làm tăng độ pH của môi trường.
10
Nhiều tác giả nhận thấy khả năng đồng hoá amon sunfat của nấm sợi sẽ được
tăng cường rõ rệt khi bổ sung thêm vào môi trường một số ít acid hữu cơ như acid
lactic, acid malic.
Ngoài các nguồn Nitơ vô cơ, nấm sợi còn có thể sử dụng tốt nhiều nguồn
Nitơ hữu cơ như protein, pepton, peptide, acid amin…[4]
Một số loài như Aspergillus flavus, Tricoderma lignorum, Myrothecium
verrucaria… có khả năng đồng đó tr
ực tiếp Nitơ phân tử [13]
Bằng các phương pháp phân tích quang phổ người ta đã xác định được tất cả
các chất khoáng có chứa trong tế bào vi nấm. Một số các nguyên tố khoáng có
những chức năng sinh lý và chức năng cấu trúc đã được biết rõ, nhưng nhiều
nguyên tố khoáng khác cho đến nay vẫn chưa được làm sáng tỏ về vai trò sinh lý
của chúng.
Theo Alexopoulos và Mims (1979) cho biết nguồn dưỡng chất cần thiết cho
nấm đượ
c xếp theo thứ tự sau: C, O, H, N, P, K, Mg, S, B, Mn, Cu, Zn, Fe, Mo và
Ca. Các nguyên tố này hiện diện trong các nguồn thức ăn vô cơ đơn giản như
glucose, muối ammonium sẽ được nấm hấp thu dễ dàng, nếu từ nguồn thức ăn
hữu cơ phức tạp nấm sẽ sản sinh và tiết ra bên ngoài các loại enzyme thích hợp để

C đến 27
o
C
và nhiệt độ tối đa mà chúng có thể chịu đựng được là 35
o
C đến 40
o
C, cá biệt có một
số ít loài có thể sống sót ở 0
o
C và ở 60
o
C. Một trong những yếu tố ảnh hưởng đến
sự sinh trưởng và phát triển của nấm sợi rõ rệt là pH, bình thường chúng tăng
trưởng ở pH=6 nhưng pH tối hảo là 5-6,5, một số loài phát triển tốt ở pH < 3 và một
số ít phát triển ở pH > 9 (Ingold, 1967). Môi trường kiềm hoặc acid, thì nấm sợi
không hoặc tăng trưởng rất yếu. [13][45].
Oxi cũng cần cho sự phát triển của nấm sợi vì chúng là nhóm hi
ếu khí bắt
buộc và sự phát triển sẽ ngưng khi không có oxi và dĩ nhiên nước là yếu tố cần thiết
cho sự phát triển.
Theo Alexopoulos và Minns (1979) cho biết nấm sợi có thể phát triển liên
tục trong 400 năm hay hơn nếu các điều kiện môi trường đều thích hợp cho sự phát
triển của chúng.
Nấm sợi không có diệp lục tố nên chúng cần được cung cấp dinh dưỡng từ
bên ngoài (nhóm dị dưỡng), một số
sống sót và phát triển nhờ khả năng ký sinh
(sống ký sinh trong cơ thể động vật hay thực vật) hay hoại sinh (saprophytes) trên
xác bã hữu cơ, cũng có nhóm nấm rễ hay địa y sống cộng sinh với nhóm thực vật
nhất định. [45]

ại sau:
- Chồi hình thành từ tế bào nấm men: Cryptococcus và Candida là
những loại bào tử tản đơn giản nhất, gọi là bào tử chồi (blastospores)
13
- Giống Ustilago có những sợi nấm có xuất hiện tế bào có vách dầy gọi
là bào tử vách dầy còn gọi là bào tử áo (chlamydospores). Vị trí của bào tử
vách dầy ở sợi nấm có thể khác nhau tùy loài.
- Giống Geotrichum và Oospora có sợi nấm kéo thẳng, vuông hay chử
nhật và tế bào vách dầy gọi là bào tử đốt (arthrospores).
1.1.1.3.2 Sinh sản hữu tính
Sinh sản hữu tính xảy ra khi có sự kết hợp giữa hai giao tử đực và cái
(gametes) có trải qua giai đoạn giảm phân. Quá trình sinh sản hữu tính trải qua 3
giai đoạn:
- Tiếp hợp tế bào chất (plasmogamy) với sự hòa hợp 2 tế bào trần
(protoplast) của 2 giao tử.
- Tiếp hợp nhân (karyogamy) với sự hòa hợp 2 nhân của 2 tế bào giao
tử để tạo một nhân nhị bội (diploid).
- Giảm phân (meiosis) giai đoạn này hình thành 4 bào tử đơn bội
(haploid) qua sự giảm phân từ
2n NST (nhị bội) thành n NST (đơn bội).
Theo Machlis (1966) tất cả các giai đoạn trên kể cả giai đoạn tạo cơ quan
sinh dục được điều khiển bởi một số kích thích tố sinh dục (sexual hormones).
Cơ quan sinh dục của nấm sợi có tên là túi giao tử (gametangia) có 2 loại: cơ
quan sinh dục đực gọi là túi đực (antheridium) chứa các giao tử đực (antherozoids),
còn cơ quan sinh dục cái gọi túi noãn (oogonium) chứa giao tử cái hay noãn, khi có
sự kết hợp gi
ữa giao tử đực và noãn sẽ tạo thành bào tử, bào tử di động được gọi là
bào tử động (zoospores).
Kiểu hai sợi nấm có giới tính đực và cái tiếp hợp nhau sinh ra bào tử có tên
là tiếp hợp tử (myxospores), tiếp hợp tử là đặc trưng của nhóm nấm Myxomycetes.