NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12
2.2.1. Cách tiếp cận vấn đề nghiên cứu 12
2.2.2. Phƣơng pháp phân lập vi sinh vật 13
2.2.3. Phƣơng pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh protease mạnh nhất: đƣợc đánh giá
qua hoạt tính sinh protease 15
2.2.4. Phƣơng pháp xác định khả năng sinh trƣởng 16
2.2.5. Phƣơng pháp định danh chủng vi khuẩn (theo phƣơng pháp truyền thống) 17
2.2.6. Phƣơng pháp xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp 19
2.2.7. Phƣơng pháp nuôi cấy và thu canh trƣờng chứa enzyme của chủng đã phân lập
trên môi trƣờng nhân giống cấp 2 22
2.3. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 25
CHƢƠNG III 26
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26
3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG SINH PROTEASE CAO SỐNG
BÁM TRÊN CÁ CHIM VÂY VÀNG 26
3.2. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP 28
3.3. ĐẶC ĐIỀM SINH HÓA CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP 29
3.3.1. Khả năng lên men các loại đƣờng 29
3.3.2. Khả năng sinh hơi 31
3.3.3. Khả năng chịu muối 32
3.3.4. Khả năng di động 32
3.4. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH PROTEASE CỦA
CHỦNG R2.1.5 PHÂN LẬP ĐƢỢC 33
3.4.1. Thời gian nuôi cấy thích hợp 33
3.4.2. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp 35
3.4.3. pH thích hợp 36
3.5. THỬ NGHIỆM NUÔI CẤY CHỦNG R2.1.5 TRÊN MÔI TRƢỜNG NHÂN
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Cá chim vây vàng (Trachinotus blochii) 4
Hình 2.1. Cách thức tiếp cận vấn đề nghiên cứu 13
Hình 2.2. Quá trình phân lập vi sinh vật 15
Hình 2.3. Quá trình tuyển chọn vi khuẩn sinh protease 16
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm định danh vi khuẩn theo phƣơng pháp truyền thống
17
Hình 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy tối ƣu 19
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian nuôi cấy tối ƣu 20
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ƣu 21
Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH nuôi cấy tối ƣu 22
Hình 2.9. Sơ đồ quy trình sản xuất protease từ chủng đã phân lập trên môi trƣờng nhân
giống cấp 2 24
Hình 3.1. Hoạt tính protease của các chủng tuyển chọn đƣợc 28
Hình 3.2. Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng R2.1.5 dƣới độ phóng đại X-100 29
Hình 3.3 Một số hình ảnh về khả năng lên men đƣờng của các chủng vi khuẩn đƣợc
tuyển chọn 31
Hình 3.4. Khả năng sinh hơi của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 31
Hình 3.5. Khả năng chịu muối của các chủng vi khuẩn 32
Hình 3.6. Khả năng di động của các chủng vi khuẩn 33
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh trƣởng và hoạt tính
enzyme của chủng R2.1.5 34

xuất khẩu đứng hàng thứ 3 chỉ sau dệt may và dầu khí. Năm 2010, sản lƣợng khai thác
thủy sản là 2.450,8 ngàn tấn, kim ngạch xuất khẩu thủy sản đạt 4,94 tỷ USD; sản lƣợng
nuôi trồng thủy sản năm 2010 lên 2.706,8 ngàn tấn đã đƣa Việt Nam đứng thứ 6 trong
số 10 nhà xuất khẩu thủy sản hàng đầu của thế giới và đứng thứ 5 trong khu vực châu
Á sau Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia và Philippines.
Để đẩy mạnh phát triển ngành thủy sản và khẳng định chủ quyền biển đảo, Chính
phủ đã định hƣớng phải tăng cƣờng khai thác đánh bắt xa bờ và đẩy mạnh phát triển
nuôi các loài cá biển có giá trị kinh tế, trong đó có cá chim vây vàng - đối tƣợng nuôi
mới, có giá trị kinh tế cao. Tuy vậy muốn phát triển nuôi bền vững các đối tƣợng này
cần phải sản xuất thức ăn có chứa các chế phẩm vi sinh vật hữu ích (probiotics) giúp
tăng sức đề kháng, tăng khả năng tiêu hóa của cá trong điều kiện nuôi công nghiệp và
hạn chế ô nhiễm môi trƣờng. Song hiện tại Việt Nam việc nghiên cứu chƣa nghiên cứu
về chế phẩm probiotics dùng cho nuôi thủy sản còn rất hạn chế. Đặc biệt đối với cá
chim vây vàng, hiện chƣa có chế phẩm dạng này. Xuất phát từ thực tế trên, em đƣợc
Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học giao thực hiện đề tài “Nghiên cứu phân lập một
số chủng vi khuẩn có hoạt tính protease sống bám trên cá chim vây vàng”, với mục
đích phân lập, tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có hoạt tính enzyme protease ứng
dụng trong nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotics dùng trong sản xuất thức ăn cho
cá chim vây vàng.
Nội dung của đề tài:
1) Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn sinh protease cao sống bám
trên cá chim vây vàng,
2

GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân
2) Xác định một số đặc tính của chủng có hoạt tính sinh protease cao,
3) Xác định một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh protease của chủng phân
lập được
Do thời gian và kinh phí có hạn nên báo cáo này chắc hẳn sẽ còn có các hạn
chế, em kính mong nhận đƣợc các ý kiến góp ý của quý thầy cô và bạn bè đồng nghiệp

biệt, điều kiện biển tự nhiên ở nƣớc ta rất thích hợp với loài cá chim trắng vây vàng. Vì
môi trƣờng sống của loại cá này là vùng biển ấm, vị trí rất thích hợp, những vùng vịnh,
đầm phá, eo biển, biển nội địa ít sóng gió. Bên cạnh đó, là chất lƣợng nƣớc tốt, độ mặn
nƣớc biển tƣơng đối ổn định. Nguồn thức ăn cho cá có tự nhiên, thức ăn tổng hợp đơn
giản và giá thành không quá đắt.
Cá chim vây vàng còn có một tên gọi khác là cá sòng mũi hếch hay cá chim
trứng. Là loài cá ăn tạp, thiên về động vật, cá có thể kiếm thức ăn ở trong cát, cá trƣởng
thành có thể bắt những động vật vỏ cứng nhƣ: ngao, cua, ốc. Giai đoạn cá giống thức
ăn là động vật phù du và động vật đáy, chủ yếu là luân trùng, nauplius của Artemia. Cá
con ăn tôm cá nhỏ, hai mảnh vỏ nhỏ. Thức ăn chính của cá trƣởng thành là các loại tôm
cá nhỏ.Trong điều kiện ƣơng nuôi cá dài 2 cm thức ăn là cá tạp xay nhỏ, tôm tép băm
nhỏ, thức ăn tổng hợp. Cá trƣởng thành ăn tôm nhỏ và thức ăn công nghiệp hoặc hoàn
toàn thức ăn công nghiệp trong nuôi thƣơng phẩm. Sau đây là hệ thống phân loại của
cá chim vây vàng:
Nghành: Vertebrata
Lớp: Osteichthyes
Bộ: Perciformes
Họ: Carangidae
Giống: Trachinotus
Loài: Trachinotus blochii Lacepede, 1801
4

GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân
Theo Borut Forlan (2004) cá chim vây vàng sống ở vùng biển hở và đƣợc tìm
thấy ở Thái Bình Dƣơng, Đại Tây Dƣơng, Ấn Độ Dƣơng. Ở châu Á, cá chim vây vàng
phân bố ở miền Nam Nhật Bản, Indonesia, Trung Quốc (Hoàng Hải, Đông Hải, Quảng
Đông, Phúc Kiến, Hải Nam), Đài Loan. Ở Việt Nam, cá chim vây vàng đƣợc tìm thấy
trên vịnh Bắc Bộ, miền Trung và Nam Bộ.

Hình 1.1 Cá chim vây vàng (Trachinotus blochii)

sinh vật có hại, do đó sẽ hạn chế đƣợc mầm bệnh phát triển để gây bệnh cho tôm cá.
Đồng thời chế phẩm probiotic giúp ổn định độ pH của nƣớc, ổn định màu nƣớc do
probiotic hấp thu chất dinh dƣỡng hòa tan trong nƣớc nên hạn chế tảo phát triển nhiều.
Thành phần chế phẩm probiotic thƣờng có những nhóm vi sinh vật sau:
- Các nhóm vi sinh vật cơ bản: Vi khuẩn lactic, Vi khuẩn Bacillus, Vi khuẩn
quang dƣỡng khử H
2
S – vi khuẩn tía lƣu huỳnh, Nấm men (men rƣợu Saccharomyses).
- Các nhóm vi sinh vật phụ: Nhóm vi khuẩn nitrat (Nitrosomonas và
Nitrobacter), Nhóm xạ khuẩn, Nhóm nấm mốc.
1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Tại Nhật Bản, chế phẩm probiotic có tên gọi là E.M (các vi sinh vật hữu hiệu) do
giáo sƣ, tiến sỹ Teruo Higa, Trƣờng đại học Ryukyus, Okinawa, Nhật Bản đề xuất năm
1980 đã đƣợc sử dụng nhiều trong chăn nuôi, trồng trọt cũng nhƣ bảo vệ môi trƣờng
đều cho kết quả khả quan (Higa, 1980). Đến nay chế phẩm này đƣợc hơn 80 nƣớc và
vùng lãnh thổ sử dụng, đặc biệt là khu vực Châu Á và Thái Bình Dƣơng trong đó có
Trung Quốc, Hàn Quốc, Thái Lan và Việt Nam.
Griffith (1995) thông báo nhờ việc đƣa probiotic vào nuôi tôm giống ở Ecuador
trong năm 1992, mà các trại nuôi tôm giống giảm thời gian nghỉ để làm vệ sinh ở các
6

GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân
bể nuôi từ 7 ngày trong một tháng đến 21 ngày trong một năm, sản lƣợng tôm giống
tăng 35%, và giảm sử dụng các chất diệt khuẩn đến 94% .
Ở Châu Á đã có nhiều nghiên cứu sử dụng các chế phẩm vi sinh trong nuôi tôm,
đặc biệt ở Thái Lan. Jiravanichpaisal & cộng sự (1997) đã sử dụng Lactobacillus sp.
trong nuôi tôm sú (P. monodon Fabrius) . Ở Trung Quốc, nghiên cứu probiotic trong
nuôi thủy sản đƣợc tập trung vào vi khuẩn quang hợp. Qiao Zhenguo & cộng sự (1992)
nghiên cứu 3 chủng vi khuẩn quang hợp sử dụng cho tôm (P. chinensis) bằng cách cho
vào thức ăn hoặc cho và nƣớc nuôi tôm cho thấy có sự gia tăng khả năng phát triển của


GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân
Những nghiên cứu về việc sử dụng chế phẩm probiotics trong lĩnh vực thủy sản
chỉ ra rằng các probiotics có một số lợi ích sau: làm ổn định chất lƣợng nƣớc và nền
đáy trong ao nuôi tôm cá, nâng cao sức khoẻ và sức đề kháng cho tôm, cá nuôi, giảm
thiểu ô nhiễm môi trƣờng ao nuôi và xung quanh do nuôi trồng thuỷ sản gây nên và
nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn (Verschuere et al., 2000). Các đánh giá về hiệu quả
môi trƣờng của chế phẩm sinh học chỉ ra rằng các chủng vi sinh vật trong các chế
phẩm probiotics có khả năng phân giải nhanh xác tảo tàn, thức ăn thừa, hoặc có tác
dụng xử lý các chất hữu cơ lơ lửng, cạnh tranh và làm giảm vi khuẩn gây bệnh trong
nƣớc, xử lý ô nhiễm bùn đáy ao nuôi (Zhou et al., 2009).
Một số công trình nghiên cứu trên thế giới đã công bố cho thấy sử dụng các chế
phẩm probiotics trong thức ăn nuôi trồng thuỷ sản còn có các lợi ích nhƣ sau:
- Giúp làm giảm stress cho tôm cá qua đó cải thiện sức khỏe của động vật nuôi
đồng thời làm giảm tác động có hại của thức ăn thừa đến môi trƣờng.
- Do quy luật cạnh tranh và loại trừ vi khuẩn gây bệnh, các vi sinh vật có lợi trong chế
phẩm probiotics sẽ cạnh tranh và làm giảm sự phát triển cũng nhƣ độc tính của vi
khuẩn gây bệnh. Vì thế chế phẩm probiotics sẽ giúp cân bằng hệ vi sinh vật đƣờng ruột
và giảm thiểu vi sinh vật gây bệnh trong đƣờng ruột của vật nuôi.
- Mặt khác, một số lọai vi khuẩn có lợi trong chế phẩm probiotics nhƣ Bacillus
subtilis, nấm men còn là nguồn cung cấp dinh dƣỡng protein, vitamin, nhất là sản xuất
ra các enzyme tiêu hóa nhƣ protease, amylase, Vì thế khi bổ sung chế phẩm probiotics
có khả năng sinh enzyme vào thức ăn nuôi động vật thủy sản nhất là nuôi tôm nói
chung và thức ăn nuôi tôm hùm nói riêng sẽ làm tăng cƣờng quá trình tiêu hóa thức ăn
trong đƣờng ruột của tôm và giảm chi phí thức ăn.
- Quan trọng hơn, các vi sinh vật có lợi trong chế phẩm probiotics nhƣ các lọai vi
khuẩn lactic còn kích thích tăng cƣờng hệ miễn dịch của động vật thủy sản chống lại vi
sinh vật gây bệnh nên nguy cơ dịch bệnh ở vật nuôi sẽ đƣợc giảm thiểu. Do vậy khi sử
dụng chế phẩm probiotics trong thức ăn nuôi động vật thủy sản nói chung và cá chim
8

4
,
NO
2
, H
2
S, số lƣợng vi khuẩn Aeromonas và Pseudomonas trong ao nuôi cá tra. Hơn
nữa, ở ao dùng chế phẩm sinh học, tình trạng cá khỏe và không có biểu hiện nhiễm
bệnh. Trong ao không sử dụng chế phẩm sinh học, cá bị nhiễm ký sinh trùng (15 – 20
9

GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân
con/10x10) và có biểu hiện bệnh nhiễm khuẩn từ ngày thứ 20-25, sau khi điều trị thì cá
bị hao hụt, tỷ lệ sống giảm và tăng trƣởng không đều. Cuối cùng, sử dụng chế phẩm
sinh học còn làm tăng tỉ lệ sống đạt 33,26% so với ao đối chứng không sử dụng chế
phẩm là 26% và làm giảm hệ số chuyển hóa thức ăn là 0,6 so với đối chứng là 0,8.
Sử dụng probiotics có tác dụng trên nhiều mặt và có nhiều triển vọng. Tuy nhiên,
tại Việt Nam chƣa có những nghiên cứu đầy đủ về vai trò của vi sinh vật, đặc biệt là
chƣa có các nghiên cứu bổ sung chúng vào thành phần thức ăn viên cho nuôi cá chim
vây vàng.
Do vậy việc “Nghiên cứu phân lập một số chủng vi khuẩn có hoạt tính protease
sống bám trên cá chim vây vàng” với mục đích sử dụng cho sản xuất probiotics làm
thức ăn cho cá chim vây vàng là một hƣớng nghiên cứu cần thiết.


Nƣớc cất : 1 lít ;
pH = 8,5 ± 0,2
Hoà tan các thành phần, điều chỉnh pH theo yêu cầu rồi chia vào các bình tam
giác. Hấp ở nhiệt độ 121
o
C trong 10 phút. Khi bảo quản phải vặn chặt nắp bình, để
tránh bay hơi nƣớc và pH bị thay đổi.
Môi trƣờng lên men đƣờng (Môi trƣờng cơ bản)
Pepton : 10 g
NaCl : 30 g;
Cao thịt bò : 3 g;
11

GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân
Phenol đỏ : 0,04 g;
Nƣớc cất : 1 lít;
pH = 7,0 ± 0,2
Hoà tan các thành phần trên, chỉnh pH rồi rót 2,5 ml vào các ống nghiệm. Hấp ở
nhiệt độ 121
0
C trong 10 phút. Pha các loại dung dịch cacbonhydrat 50% (nhƣ: sucrose,
lactose,D-mannitol, mantose ) trong nƣớc cất rồi lọc vô trùng. Thêm 0,278 ± 0,002 ml
dung dịch này vào ống nghiệm chứa 2,5 ml môi trƣờng cơ bản. Môi trƣờng cuối cùng
có nồng độ carbohydrat là 5%.
Môi trƣờng thạch thƣờng
Pepton 10g
Nƣớc mắm 20ml
Nƣớc cất 1000ml
Môi trƣờng nhân giống cấp 2
Bột đậu nành 30%

Hòa tan phenol tinh thể vào 100 ml nƣớc cất (dung dịch 2).
Trộn đều dung dịch 1 và dung dịch 2 đem lọc, ta có thuốc nhuộm Fuschin.
Dung dịch xanh methylen
Rƣợu ethylic: 300 ml
Xanh methylen: 25 g
Hòa tan xanh methylen vào rƣợu rồi lọc (dung dịch 1).
Dịch lọc 1 thêm 1 ml KOH 1% và 1000 ml nƣớc cất.
Dung dịch nƣớc muối sinh lý
Hoà tan 8,5 g NaCl trong 1 lít nƣớc cất. Hấp khử trùng ở nhiệt độ 121
0
C trong 15
phút rồi để nguội.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Cách tiếp cận vấn đề nghiên cứu
Đề tài sử dụng cách tiếp cận kế thừa và chọn lọc các phƣơng pháp phân lập tuyển
chọn các chủng probiotics có khả năng sinh enzyme protease theo sơ đồ:
13

GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân

Hình2.1. Cách thức tiếp cận vấn đề nghiên cứu
2.2.2. Phƣơng pháp phân lập vi sinh vật
Mục tiêu của thí nghiệm là tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn sinh protease mạnh
nhất. Thí nghiệm đƣợc thực hiện theo các bƣớc sau:
Xử lý mẫu
Phân lập
• Phân lập vi khuẩn tổng số trên môi trƣờng TSB
• Tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính protease
Xác định hình thái
• Xác định các đặc điểm hình thái

, pha loãng ra ống nghiệm có nồng độ thấp hơn 10
-2
bằng
cách hút 1ml từ ống nghiệm 10
-1
cho vào 9 ml dung dịch nƣớc muối sinh lý đã hấp khử
trùng ở ống nghiệm khác, rồi đƣa lên máy vortex để trộn đều, thu đƣợc ống nghiệm có
độ pha loãng mẫu 10
-2
, tiếp tục làm tƣơng tự, ta có các ống nghiệm có độ pha loãng
mẫu 10
-3
, 10
-4
, 10
-5
, 10
-6
,10
-7
, 10
-8
.
- Môi trƣờng TSB đƣợc chuẩn bị, hấp khử trùng và phân phối vào các đĩa petri,
mỗi đĩa 10-15ml. Dùng pipet man hút 0.1 ml dịch đã pha loãng nhỏ vào đĩa thạch đã
ghi tên mẫu, nồng độ và ngày phân lập. Dùng que cấy tran trang đều dịch mẫu trên mặt
thạch. Sau đó cất và nuôi cấy mẫu phân lập ở 37
0
C. Sau khoảng 48h vi khuẩn đã phát
triển trên đĩa thạch tiến hành quan sát, tách và thuần khiết khuẩn lạc.

0
C trong môi trƣờng dịch thể, sau
24h tiến hành ly tâm dịch nuôi cấy với tốc độ 8000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch
enzyme nhỏ vào lỗ thạch đã khoan trên đĩa petri chứa môi trƣờng cơ chất. Để vào tủ
ấm 30
0
C sau 24h xác định vòng phân giải.
Sử dụng thuốc thử Liugol, thuốc thử không bắt màu với phần cơ chất bị phân
giải, tạo ra vòng phân giải.
Tủ ấm 37
0
C
16

GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân
Hoạt tính enzyme đƣợc xác định theo công thức:
H D d

Trong đó D: đƣờng kính vòng phân giải + đƣờng kính lỗ khoan
d: đƣờng kính lỗ khoan

Hình 2.3. Quá trình tuyển chọn vi khuẩn sinh protease
2.2.4. Phƣơng pháp xác định khả năng sinh trƣởng
Để đánh giá khả năng sinh trƣởng của vi khuẩn cũng nhƣ khả năng tích lũy sinh


Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm định danh vi khuẩn theo phƣơng pháp truyền
thống
Phƣơng pháp nhuộm gram
- Nguyên tắc của phƣơng pháp: Vi khuẩn Gram (-) bắt màu hồng của thuốc
nhuộm fuchsin, vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím của violet.
- Cách tiến hành:
Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch hòa vào một giọt nƣớc cất
trên phiến kính, để khô tự nhiên. Sau đó cố định mẫu trên ngọn lửa đèn cồn. Tiến hành
nhuộm bằng crystal violet trong 1 phút, rửa với nƣớc cất. Tiếp tục nhỏ dung dịch
Liugol, để một phút rồi lại rửa bằng nƣớc cất, thấm khô. Tẩy cồn trong 15 – 20 giây và
Nuôi cấy vi khuẩn đƣợc tuyển
chọn
Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn
Test sinh hóa
Định danh vi khuẩn
18

GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân
rửa lại bằng nƣớc cất sau đó phủ dung dịch fuchsin lên lam kính trong 30 giây, đổ bỏ
dung dịch và rửa qua nƣớc. Dùng giấy thấm để thấm hoặc để khô tự nhiên. Khảo sát
hình thái tế bào và tính chất bắt màu của vi khuẩn dƣới kính hiển vi với vật kính dầu
X -100.
Phƣơng pháp xác định khả năng chịu muối
Cấy vi khuẩn lên đĩa petri chứa môi trƣờng thạch thƣờng với các nồng độ muối
khác nhau từ 1-12%, giữ trong tủ ấm. Sau 24h, quan sát nếu vi khuẩn vẫn phát triển
chứng tỏ chúng có khả năng chịu muối
Phƣơng pháp xác định khả năng lên men đƣờng
- Rót 5 ml môi trƣờng cơ bản vào các ống nghiệm. Thêm 0,5 ml dung dịch từng
loại đƣờng vào từng ống nghiệm tƣơng ứng sao cho môi trƣờng cuối cùng có nồng độ