i
LỜI CẢM ƠN

Sau gần 3 tháng thực tập tại phòng Vi sinh vật – Viện Sinh học Nông
Nghiệp, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, dưới sự hướng dẫn của PGS
– TS. Lương Đức Phẩm nên tôi đã hoàn thành cuốn luận văn này.
Qua đây tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS – TS.
Lương Đức Phẩm người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm và tận tình
chỉ bảo cho tôi trong suốt quá trình thực tập, cùng các anh chị phòng Vi
sinh vật, những người đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt
nhiệm vụ của mình.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Nha
Trang, cùng toàn thể các thầy cô giáo trong Viện Công nghệ sinh học đã
tận tình chỉ bảo và truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong những
năm học vừa qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh, chị đang công tác tại Viện Sinh
học Nông Nghiệp, trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội và các bạn cùng
thực tập đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình cùng toàn thể bạn bè
thân thiết, những người đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học
tập, nghiên cứu.

Hà Nội, tháng 6 – 2009
Sinh viên

Nguyễn Thị Phương Như

ii
MỤC LỤC
Trang
Phần I TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................................3

khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme của các chủng Bs, Bm,
BM.............................................................................................................24
2.2.8. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan lên khả năng sinh
trưởng của các chủng Bs, Bm, BM .............................................................25
Phần III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN................................26
3.1. Phân lập chủng Bacillus ..........................................................................27
3.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc...............................................................27
3.3. Đặc điểm hình thái tế bào ....................................................................28
3.4. Nghiên cứu hoạt tính Catalase .............................................................30
3.5. Nghiên cứu khả năng sinh enzym thuỷ phân tinh bột, protein của ba
chủng Bs, Bm và BM.....................................................................................31
3.6. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng của các chủng Bs, Bm và BM trên
môi trường không có chất cảm ứng ............................................................33
3.7 Nghiên cứu quá trình sinh trưởng và sinh enzmy amylaza của 3
chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là tinh
bột tan ........................................................................................................34
3.7.1. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và
BM trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan...................................34
3.7.2. Nghiên cứu quá trình sinh enzyme của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm
và BM trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan..............................35
3.8 Nghiên cứu quá trình sinh trưởng và sinh enzmy proteaza của 3 chủng
vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein...............37
3.8.1. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và
BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein ..............................................37
iv
3.8.2. Nghiên cứu quá trình sinh enzyme proteaza của 3 chủng vi khuẩn
Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein .........................39
3.9. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng và sinh enzyme của các chủng Bs,
Bm, BM trên môi trường có bổ sung CaCO3 .................................................41
3.9.1. Nghiên cứu nuôi vi khuẩn trong môi trường có CaCO3 thu

là cazein......................................................................................................................40
Hình 13: Hoạt tính enzyme proteaza của chủng BM trên môi trường có chất cảm ứng
là cazein......................................................................................................................40
Hình 14: Ảnh hưởng của CaCO
3
đến sinh enzyme trên môi trường có tinh bột tan của
chủng Bs.....................................................................................................................42
Hình 15: Ảnh hưởng của CaCO
3
đến sinh enzyme trên môi trường có tinh bột tan của
chủng Bm...................................................................................................................42
Hình 16: Ảnh hưởng của CaCO
3
đến sinh enzyme trên môi trường có tinh bột tan của
chủng BM...................................................................................................................43
Hình 17: Ảnh hưởng của CaCO
3
đến sinh enzyme trên môi trường có cazein của
chủng Bs.....................................................................................................................44
vi
Hình 18: Ảnh hưởng của CaCO
3
đến sinh enzyme trên môi trường có cazein của
chủng Bm...................................................................................................................45
Hình 19: Ảnh hưởng của CaCO
3
đến sinh enzyme trên môi trường có cazein của
chủng BM...................................................................................................................45
Hình 20: Ảnh hưởng của độ hiếu khí lên hoạt tính enzyme amylaza của 3 chủng Bs,
Bm và BM trên ở môi trường có bổ sung CaCO

Bảng 3.10: Ảnh hưởng của CaCO
3
đến sự sinh trưởng trên môi trường có cazein
của 3 chủng Bs, Bm và BM ...............................................................................46
Bảng 3.11: Ảnh hưởng của độ hiếu khí lên khả năng sinh trưởng của 3 chủng Bs,
Bm, BM ............................................................................................................48
Bảng 3.12: Ảnh hưởng của độ hiếu khí tới khả năng sinh trưởng của 3 chủng Bs,
Bm, BM trên môi trường có bổ sung CaCO
3
.....................................................48
Bảng 3.13: Ảnh hưởng của bột đậu tương lên khả năng sinh proteaza, amylaza
của ba chủng Bs, Bm, BM.................................................................................52
Bảng 3.14: Ảnh hưởng của nồng độ CaCO
3
đến khả năng sinh amylaza, proteaza
trên môi trường có bột đậu tương ......................................................................53
1
MỞ ĐẦU

Vi sinh vật trong tự nhiên rất phong phú và đa dạng. Chúng ở xung
quanh ta: trong đất, trong nước, không khí thậm chí cả trong cơ thể con
người. Chúng có thể gây cho ta cả những bất lợi khôn lường như những
bệnh lao, dịch hạch, dịch tả, đại dịch cúm ở người và gia cầm, lở mồm,
long móng ở bò lợn... nhưng chúng cũng có thể đem lại cho chúng ta nguồn
lợi vô cùng to lớn nếu ta biết, hiểu chúng và biết sử dụng chúng vào mục
đích sẽ giúp cho cuộc sống con người tốt đẹp hơn.
Từ thời xa xưa, con người đã biết ứng dụng những hoạt tính có lợi
của vi sinh vật phục vụ cho đời sống của mình như tạo ra các loại rượu quý
nhờ quá trình lên men của vi sinh vật, những bài thuốc chữa bệnh từ vi sinh
vật...


3

Phần I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
4
1.1. Đại cương về Bacillus
Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn Gram dương. Thuộc chi
Bacillaceae, có nội bào tử hình ovan có khuynh hướng phình ra ở một đầu.
Bacillus được phân biệt với các loài vi khuẩn sinh nội bào tử khác bằng
hình dạng tế bào hình que, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí
không bắt buộc. Tế bào Bacillus có thể đơn hoặc chuỗi và chuyển động
bằng tiêm mao. Nhờ khả năng sinh bào tử nên vi khuẩn Bacillus có thể tồn
tại trong thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau và rất phổ biến
trong tự nhiên nên có thể phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau như đất,

nguyên thủy xác định mà không cần bổ sung thêm yếu tố kích thích sinh
trưởng. Sự sinh trưởng phát triển của chúng góp phần làm hỏng các nguyên
liệu có nguồn gốc động thực vật. Chúng không sinh trưởng trên thực phẩm
có tính axit ở điều kiện tối ưu. Chúng là nguyên nhân gây hư hỏng bánh mì.
Phần lớn thông tin chúng ta có về đặc điểm sinh học, hóa sinh, di truyền
của các vi khuẩn Gram dương khác đều nhận được từ việc nghiên cứu
Bacillus subtilis [13].
Chúng là những vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, kích thước
( 3 – 5) x 0,6 m.
Chúng phát triển riêng rẽ như những sợi đơn bào ít khi kết chuỗi sợi
[13]. Khuẩn lạc khô, vô màu hay xám nhạt, có thể màu trắng hơi nhăn hoặc
tạo ra lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, mép nhăn hoặc lồi lõm nhiều
hay ít, bám chặt vào môi trường thạch.
Bacillus subtilis sinh trưởng tốt nhất ở 36
0
C – 50
0
C, tối đa khoảng
60
0
C. Là loại ưa nhiệt cao. Bào tử của Bacillus subtilis cũng chịu được
nhiệt khá cao.
Bào tử hình bầu dục, kích thước 0,6m – 0,9m. Phân bố không theo
nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm. Chúng
phát tán rộng rãi. Chúng là một thể nghỉ sinh ra vào cuối thời kỳ sinh
trưởng phát triển của vi khuẩn. Chúng không có khả năng trao đổi chất nên
6
có thể sống được vài năm đến vài chục năm, thậm chí đến 200 – 300 năm
[1].
Vi khuẩn Bacillus subtilis được xem là vi sinh vật điển hình vì có

Bào từ hình bầu dục và kéo dài 0,5 – 0,9 m, nằm ở vị trí bất kỳ
trong tế bào, tế bào Bacillus mensentericus không bị phình to khi mang bào
tử.
Khuẩn lạc bám chặt vào môi trường thạch, có khi dính vào môi
trường, mỏng, nhăn nheo, xám nhạt – trắng, có thể màu Crem, vàng nâu,
hồng hoặc đen như Bacillus mensentericus niger ( đen ), Bacillus
mensentericus ruber (hồng).
Bacillus mensentericus sinh trưởng và phát triển tốt nhất ở nhiệt độ
36 – 45
0
C tối đa 50 – 55
0
C. pH = 4,5 – 5 thì nó ngừng phát triển.
Bacillus mensentericus có hoạt tính amylase và protease lớn hơn hẳn
Bacillus subtilis, nhưng lên men đường lại kém hơn.
Hai loại trực khuẩn này rất phổ biến trong tự nhiên, chúng lây nhiễm
làm hư hỏng thực phẩm, nhất là các thực phẩm có chứa nitơ và các sản
phẩm giàu đường ( bánh kẹo, hoa quả) đây cũng là loại được ứng dụng vào
ngành công nghệ sản xuất enzyme protease, amylase… Ngoài ra, nó còn
sinh ra một loại hợp chất có hoạt tính kháng với một số vi khuẩn khác ( như
Vibrio) gọi là bacterioxin, ở Bacillus subtilis gọi là subtilin hay Irutin A, B
Bacillus cereus
Đây là loại có mối quan hệ gần gũi với Bacillus anthracis, Bacillus
mycoides, Bacillus thuringiensis. Bào tử của chúng phát tán khắp nơi, trong
đất, không khí… Chúng thường sinh sôi nảy nở trên thực phẩm như cơm và
có thể sinh ra độc tố làm cho thực phẩm hư hỏng. Chúng được áp dụng để
8
sản xuất kháng sinh, giống Bacillus này có độc tính, gây ngộ độc thực
phẩm [13].
Tế bào Bacillus cereus dày, kích thước (1 – 1,5) x (3 – 5)m, có khi

Chúng thường đứng riêng rẽ. Bào tử hình bầu dục, có kích cỡ ( 0,8 – 1)
m, nằm cuối tế bào làm cho đầu tế bào hơi phồng to lên [3].
Về nhu cầu dinh dưỡng, Bacillus brevis yêu cầu một hỗn hợp axit
amin cho sinh trưởng và phát triển, không cần bổ sung vitamin [13] .
Bacillus simplex
Khuẩn lạc giống khuẩn lạc B.cereus, phẳng, khá khuyếch tán, với bề
mặt hơi xù xì (dạng bột hoặc hạt nhỏ), hơi lõm, màu đục, mép lồi lõm. Đặc
biệt khuẩn lạc của Bacillus simplex có khả năng sinh sắc tố lục nhạt, vàng
và tiết vào môi trường [3].
Tế bào của nó nhỏ bé, có kích thước (2 – 5) x 0,6m, thường đứng
riêng rẽ không kết thành chuỗi.
Bào tử hình bầu dục, có kích thước 0,6 x 0,9 m, nằm lệch tâm.
Bacillus lincheniformis
Chúng được áp dụng trong việc sản xuất loại vỏ bao poly D –
glutamate và phẩm đỏ cùng với nhiều chủng khác.
Bào tử của chúng phát tán chủ yếu trong đất. Chúng sinh trưởng phát
triển trên các loại thực phẩm. Đặc biệt chúng có khả năng sản xuất ra
bacitracin, một kháng sinh có ích trong y học, nên chúng được ứng dụng
phổ biến trong công nghiệp dược [13].
10
1.2. Protease
1.2.1. Tính chất, đặc điểm của protease
Protease là enzyme xúc tác cho sự thủy phân liên kết peptid [ - CO-
NH-] giữa các loại acid amin trong phân tử protein (hay các nhóm
polypeptide). Sản phẩm thủy phân là các acid amin, sản phẩm trung gian là
các peptide có mạch dài ngắn khác nhau và peptone – sản phẩm thủy phân
không hoàn toàn của protein

H
2

1
R
x
R
2

R
2
R
1

R
x
11
nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi
sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để
và đa dạng.
Người ta cũng phân loại protease theo vùng pH hoạt động tối thích:
protease acid, trung tính và kiềm tính. Tuy nhiên sự phân loại này chỉ có ý
nghĩa thực dụng không thật sự chính xác vì pH hoạt động tối thích của mỗi
enzyme còn phụ thuộc vào bản chất cơ chất và nhiều yếu tố khác nữa [7].
Vi khuẩn B.subtilis là một trong những nhóm vi sinh vật gây thối rữa
tạo nhiều protease ngoại bào và đây là một enzyme protease kiềm (protease
serin). Enzyme này có pH tối ưu trong vùng kiềm (9 – 11) và chứa một
nhóm serin quan trọng ở trung tâm hoạt động.
*Sự phân giải protein ( quá trình thối rữa )
Khác với lên men, cơ chất của quá trình thối rữa là protein. Protein là
thành phần quan trọng của xác động thực vật và vi sinh vật. Protein thường
chứa khoảng 15 – 17 % Nitơ (tính theo chất khô). Nếu như tổng lượng
cacbon trong cơ thể sinh vật sống trên mặt đất là khoảng 7 tỷ tấn thì tổng

dụng từ khá lâu trong các ngành công nghiệp sản xuất phomat, thuộc da,
làm bánh mỳ, làm trong bia tươi, thủy phân các protein, làm mềm thịt… thì
protease từ vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu từ 1950, mặc dù từ 1918
– 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng sinh protease từ xạ khuẩn
[6]. Do vậy, ngày nay protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành
công nghiệp thực phẩm, công nghiệp nhẹ, công nghiệp dược, nông
nghiệp…
 Ứng dụng trong xử lý nước thải và bảo vệ môi trường
Protease đã được sử dụng dưới dạng chế phẩm thô để xử lý các chất
protein tồn đọng trong môi trường. Vi sinh vật có khả năng sinh protease
cũng được ứng dụng trong lĩnh vực phân hủy sinh học.
 Trong công nghiệp thực phẩm
13
Trong sản xuất thịt, protease được sử dụng làm mềm thịt nhờ sự thủy
phân một phần protein trong thịt, kết quả là làm cho thịt có độ mềm thích
hợp và tăng hương vị thịt sau chế biến. Phương pháp làm mềm thịt nhờ tác
dụng của protease cho phép nâng cao chất lượng thịt đưa vào chế biến, làm
tăng tỷ lệ thịt có thể đưa vào sản xuất và rút ngắn thời gian chín của thịt
nhiều lần.
Người ta cũng dùng protease để sản xuất dịch đạm thủy phân từ các phế
liệu giàu protein như thịt vụn, da… Người ta sử dụng dịch đạm thủy phân
làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và bổ sung vào thức ăn
gia súc. Dùng protease để thủy phân thường ít bị hao hụt axit amin như khi
dùng phương pháp hóa học.
Trong công nghiệp sữa, protease được dùng để sản xuất phomat nhờ
hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng. Để làm đông tụ sữa có thể dùng
rennin, pepxin hoặc một số protease vi sinh vật có hoạt tính làm đông tụ
sữa được tách từ nấm mốc và vi khuẩn. Trong số các enzyme này, rennin là
enzyme có giá trị đặc biệt, cho phép thu được sản phẩm có chất lượng cao
nhất còn các protease vi sinh vật thì ngoài khả năng làm đông tụ sữa còn có

Quá trình làm tơ tự nhiên tương đối phức tạp và khó khăn. Chúng ta
đã biết tơ là sợi ngoại bào được nhả ra bởi cặp tuyến trùng của con tằm. Sợi
tơ gồm hai sợi fibroin sơ cấp dính lại với nhau nhờ lớp vỏ bằng xerixin.
Sau khi tách hết xerixin thì sẽ được sợi fibroin tinh khiết. Sợi thu được khi
kéo ở kén ra thường có chứa 30% xerixin. Muốn tách xerixin thì phải nấu
tơ tằm trong dung dịch xà phòng trong thời gian từ 1,5 – 2 giờ. Chỉ sau khi
có sự gia công này tơ mới bắt đầu kéo chỉ. Một lượng nhỏ xerixin nằm lại
trên lụa làm giảm độ đàn hồi của lụa, làm cho lụa bắt màu không đồng đều
15
và khó trang trí trên lụa. Người ta đã sử dụng chế phẩm protease từ nấm
mốc, vi khuẩn để tách lượng xerixin còn lại này [8].
Ngoài ra, protease còn được ứng dụng trong công nghiệp mỹ phẩm, y
học:
 Trong hương phẩm và mỹ phẩm: dưới tác dụng của protease trong
kem, các biểu b́ của da đã chết được tách ra, da non sẽ xuất hiện trên bề
mặt, đồng thời sự phát triển lông (tóc) cũng chậm lại.
 Trong công nghiệp y học: các chế phẩm protease cũng được sử dụng
để sản xuất các môi trường dinh dưỡng hỗn hợp có protein dùng trong nuôi
cấy vi khuẩn và các vi sinh vật khác. Chẳng hạn, môi trường dinh dưỡng để
nuôi các vi sinh vật sản xuất ra các kháng sinh kháng độc. Dĩ nhiên, các
protein có trong môi trường phải ở dạng dễ đồng hóa đối với vi sinh vật.
Do đó, phải thủy phân sơ bộ các protein bằng protease để cô đặc và tinh
khiết các huyết thanh kháng độc để chữa bệnh (huyết thanh kháng độc) [8].
1.2.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng protease trong sản xuất ở
Việt Nam
Ở Việt Nam protease chịu kiềm cũng đang được nghiên cứu ở Viện
công nghệ sinh học thuộc trung tâm Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ
Quốc Gia, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên (Đại Học Quốc Gia Hà Nội), Đại
Học Bách Khoa Hà Nội, viện Công nghệ Thực Phẩm, viện Sinh Học Nhiệt
Đới thành phố Hồ Chí Minh và một số trường Đại Học, Viên nghiên cứu

Các chủng được phân lập từ đất vườn, cỏ khô quanh Viện Sinh học
Nông nghiệp trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội, và khoai tây.
2.1.2. Vật liệu
2.1.2.1.Thiết bị
- Tủ cấy vô trùng - Bình tam giác
- Cân điện tử - Bếp ga
- Kính hiển vi quang học - Máy lắc
- Tủ ấm - Máy đo OD
- Tủ sấy - Tủ lạnh
- Nồi hấp thanh trùng - Máy đo pH
- Bình trụ - Các dụng cụ khác: Pipet, đầu típ, nồi,
đũa thủy tinh, đĩa petri, lam kính,…

2.1.2.2. Hóa chất
Các hóa chất phòng Vi sinh vật – Viện sinh học Nông nghiệp –
Trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội
NaCl Cao men
Agar Glucose
KI Cazein
Iốt Tinh bột tan
Fucshin HgCl
2

Cao thịt Tím gential
Pepton Cồn 96
0

Trích đoạn Phương pháp nhuộm Gram Nghiên cứu khả năng thủy phân tinh bột, protein

---