Đề tài: " Nghiên cứu tuyển
chọn một số chủng vi khuẩn
Bacillus có hoạt tính enzyme
proteaza kiềm"
Nguyễn Thị Phương Như
ii
MỤC LỤC
Trang
Phần I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Đại cương về Bacillus 4
1.2. Protease 10
1.2.1. Tính chất, đặc điểm của protease 10
1.2.2. Ứng dụng của protease 12
1.2.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng protease trong sản xuất ở Việt
Nam 15
Phần II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
2.1 Đối tượng – Vật liệu 17
2.1.1. Đối tượng 17
2.1.2. Vật liệu 17
2.1.2.1.Thiết bị 17
2.1.3. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 18
2.1.3.1. Môi trường NA (dùng để phân lập, giữ giống và nuôi cấy)
(g/l): 18
2.1.3.2. Môi trường thử hoạt tính amylase, protease 18
2.1.3.3. Cách chuẩn bị môi trường 19
2.2. Các phương pháp nghiên cứu 19
2.2.1. Phương pháp phân lập 19
2.2.2. Phương pháp giữ giống cấy chuyển 19
2.2.3. Một số phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn 20
2.2.3.1. Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc 20
2.2.3.2. Phương pháp làm tiêu bản tế bào sống 20
2.2.3.3. Phương pháp nhuộm Gram 21
BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein 37
iv
3.8.2. Nghiên cứu quá trình sinh enzyme proteaza của 3 chủng vi khuẩn
Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein 39
3.9. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng và sinh enzyme của các chủng Bs,
Bm, BM trên môi trường có bổ sung CaCO3 41
3.9.1. Nghiên cứu nuôi vi khuẩn trong môi trường có CaCO3 thu
amylaza 41
3.9.2. Nghiên cứu nuôi vi khuẩn trong môi trường có CaCO3 thu
proteaza 44
3.10. Ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan 47
3.11. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH tới sự sinh trưởng và phát triển của
ba chủng nghiên cứu 50
3.12. Nghiên cứu sử dụng bột đậu tương làm nguồn nguyên liệu thay thế 51
3.13. Nghiên cứu đồ thị tổng hợp động học của quá trình lên men 54
Phần IV KẾT LUẬN 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO 58
v
DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1: Phân lập khuẩn lạc chủng Bs 27
Hình 2: Phân lập khuẩn lạc chủng Bm 28
Hình 3: Phân lập khuẩn lạc chủng BM 28
Hình 4: Hình thái tế bào chủng Bs 29
Hình 5: Hình thái tế bào của chủng BM 29
Hình 6: Hình thái tế bào của chủng Bm 30
Hình 7: Thử hoạt tính phân giải protease và amylase của 3 chủng Bs, Bm và BM 32
Hình 8: Hoạt tính enzyme amylase của chủng Bs trên môi trường có chất cảm ứng là
tinh bột tan 36
chủng Bm 45
Hình 19: Ảnh hưởng của CaCO
3
đến sinh enzyme trên môi trường có cazein của
chủng BM 45
Hình 20: Ảnh hưởng của độ hiếu khí lên hoạt tính enzyme amylaza của 3 chủng Bs,
Bm và BM trên ở môi trường có bổ sung CaCO
3
49
Hình 21: Ảnh hưởng của độ hiếu khí lên hoạt tính enzyme proteaza của 3 chủng Bs,
Bm và BM trên ở môi trường có bổ sung CaCO
3
50
Hình 22: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng Bs, Bm
và BM 51
Hình 23: Đồ thị biến đổi pH, hoạt độ enzyme proteaza và mật độ tế bào của Bs trong
môi trường bột đậu tương có CaCO
3
55 vii
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 3.1: Đường kính phân giải của các enzym và các chủng sinh ra: 31
Bảng 3.2: Sự sinh trưởng của 3 chủng Bs, Bm, và BM trên môi trường không có
chất cảm ứng 33
Bảng 3.3. Sự sinh trưởng của chủng Bs trên môi trường có tinh bột tan 34
Bảng 3.4. Sự sinh trưởng của chủng Bm trên môi trường có tinh bột tan 34
Bảng 3.5. Sự sinh trưởng của chủng BM trên môi trường có tinh bột tan 35
long móng ở bò lợn nhưng chúng cũng có thể đem lại cho chúng ta nguồn
lợi vô cùng to lớn nếu ta biết, hiểu chúng và biết sử dụng chúng vào mục
đích sẽ giúp cho cuộc sống con người tốt đẹp hơn.
Từ thời xa xưa, con người đã biết ứng dụng những hoạt tính có lợi
của vi sinh vật phục vụ cho đời sống của mình như tạo ra các loại rượu quý
nhờ quá trình lên men của vi sinh vật, những bài thuốc chữa bệnh từ vi sinh
vật
Ngày nay chúng ta đang sống ở thế kỷ 21, thế kỷ của khoa học kỹ
thuật thì công nghệ sinh học và đặc biệt là công nghệ vi sinh càng chứng tỏ
ưu thế của mình.
Hiện nay đã có rất nhiều chất có hoạt tính sinh học khác nhau đã
được tổng hợp từ vi sinh vật đã được đưa vào sản xuất ở mức độ công
nghiệp để phục vụ cho nghiên cứu, công - nông nghiệp, y học và đời sống
của con người.
Các chủng vi khuẩn như: Bacillus, Lactobacillus… đã và đang được
sử dụng trong các chế phẩm sinh học để phục vụ cho các ngành sản xuất
như: rượu, bia, công nghiệp dệt, thuộc da, y học, bổ sung vào thức ăn gia
súc, thức ăn trong nuôi trồng thủy sản, phân hủy thức ăn thừa của tôm, phế
thải hữu cơ làm sạch môi trường nuôi trồng thủy sản là nhờ khả năng sinh
enzyme thủy phân amylaza, proteaza, xenlulaza của chúng.
2
Xuất phát từ thực tế đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
”Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính
enzyme proteaza kiềm”. Với các nội dung sau:
1. Phân lập từ đất vườn qua trung gian là cỏ khô và khoai tây để chọn
các chủng Bacillus.
2. Nghiên cứu các đặc điểm về hình thái tế bào khuẩn lạc, nghiên
cứu một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng đã được tuyển chọn.
3. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy để thu sinh khối có hoạt tính
cao.
Bacillaceae, có nội bào tử hình ovan có khuynh hướng phình ra ở một đầu.
Bacillus được phân biệt với các loài vi khuẩn sinh nội bào tử khác bằng
hình dạng tế bào hình que, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí
không bắt buộc. Tế bào Bacillus có thể đơn hoặc chuỗi và chuyển động
bằng tiêm mao. Nhờ khả năng sinh bào tử nên vi khuẩn Bacillus có thể tồn
tại trong thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau và rất phổ biến
trong tự nhiên nên có thể phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau như đất,
nước, trầm tích biển, thức ăn, sữa, nhưng chủ yếu là từ đất nơi mà đóng
vai trò quan trọng trong chu kỳ C và N [ 10 ]
Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại
sinh nhờ sử dụng các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acid
hữu cơ, Một vài loài có thể lên men carbohydrat tạo thành glycerol và
butanediol; một vài loài như Bacillus megaterium thì không cần chất hữu
cơ để sinh trưởng, một vài loài khác thì cần acid amin, vitamin B. Hầu hết
đều là loài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30 - 45
0
C, nhưng cũng
có nhiều loài ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 65
0
C [11].
Đa số Bacillus sinh trưởng ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 –
10 như Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = 2 – 6 như
Bacillus acidocaldrius.
Bacillus có khả năng sản sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease,
cellulase…), do đó chúng được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp,
trong bảo vệ môi trường, …
Sau đây là một số loài Bacillus thường gặp trong tự nhiên: 5
nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm. Chúng
phát tán rộng rãi. Chúng là một thể nghỉ sinh ra vào cuối thời kỳ sinh
trưởng phát triển của vi khuẩn. Chúng không có khả năng trao đổi chất nên
6
có thể sống được vài năm đến vài chục năm, thậm chí đến 200 – 300 năm
[1].
Vi khuẩn Bacillus subtilis được xem là vi sinh vật điển hình vì có
những đặc tính tiêu biểu không gây hại nên đây là một trong những vi
khuẩn được sử dụng để sản xuất enzyme và các hóa chất đặc biệt như:
amylase, protease, inosine, ribosides, acid amin, subtilisin [14]. Ngoài ra
nhờ khả năng bám dính proton lên bề mặt mà B. subtilis có thể loại bỏ được
chất thải phóng xạ như Thorium (IV) và Plutonium (IV) [12]. Đặc biệt,
B.subtilis được sử dụng trong lên men Natto của Nhật – một thực phẩm
chức năng rất bổ dưỡng cho sức khỏe [15].
Bacillus megaterium
Megaterium có nghĩa là “ con thú lớn” [13]. Tế bào của nó khá lớn
khoảng gấp hơn 2 lần tế bào của Bacillus subtilis, chiều ngang (1,2 –
1,5)m có thể đến 2 m, dài từ 3 – 12 m, ở các ống nuôi già thì tế bào
ngắn hơn, tròn hơn, đôi khi hình thoi với đầu hẹp lại. Tế bào chứa nhiều hạt
nhỏ và chất dinh dưỡng dự trữ (hạt mỡ, glycogen) [2].
Bào tử lớn hình ovan hay bầu dục, kích thước 1,5 x (0,7-1)m, bào
tử lớn nhất có đường kính từ 1,2 đến 1,5 m [13]. Chúng nằm lệch tâm
thường theo chiều ngang hoặc xiên của tế bào.
Khuẩn lạc tròn đều không thùy, không nếp, mép tròn đều hoặc hơi
lượn sóng, trông giống giọt bạch lạp, lồi nhẵn, nhưng thường có vòng viền
quanh đồng tâm trên bề mặt, màu trắng sữa hay đục.
Sinh trưởng trên môi trường dinh dưỡng đơn giản không cần thêm
bất kỳ một yếu tố sinh trưởng nào.
Bacillus megaterium cũng sản sinh ra các enzyme tương tự
B.subtilis, do đó nó cũng được ứng dụng nhiều trong công nghiệp.
mycoides, Bacillus thuringiensis. Bào tử của chúng phát tán khắp nơi, trong
đất, không khí… Chúng thường sinh sôi nảy nở trên thực phẩm như cơm và
có thể sinh ra độc tố làm cho thực phẩm hư hỏng. Chúng được áp dụng để
8
sản xuất kháng sinh, giống Bacillus này có độc tính, gây ngộ độc thực
phẩm [13].
Tế bào Bacillus cereus dày, kích thước (1 – 1,5) x (3 – 5)m, có khi
dài hơn, chúng đứng riêng rẽ hay xếp chuỗi. Bào tử hình bầu dục kích
thước 0,9 x (1,2 – 1,5)m nằm lệch tâm, tế bào chất của nó chứa các hạt và
không bào [2]. Khuẩn lạc của Bacillus cereus phẳng, khá khuyếch tán, hơi
lõm, trắng đục, mép lồi lõm [3] .
Bacillus pumilus
Bào tử phát tán rộng khắp mọi nơi, thường B.pumilus có mặt trong
đất nhiều hơn subtilis.
Khuẩn lạc nhỏ, xung quanh viền mờ lan không ranh giới. Tế bào của
nó gần giống tế bào B.subtilis.
Bacillus polymyxa
Bacillus polymyxa có khuẩn lạc vô màu, phẳng hoặc lồi , trơn, nhày,
lan dần ra xung quanh, mép đôi khi có thùy.
Tế bào của Bacillus polymyxa có kích thước (0,6 – 1) x (2 – 7)m,
đứng riêng rẽ hay xếp thành đôi, chuỗi ngắn. Khi hình thành bào tử tế bào
đó sẽ phồng lên hình quả chanh [3].
Bào tử hình bầu dục kéo dài, trên bề mặt cắt ngang như hình sao.
Chúng phát tán rộng, kích thước dài khoảng (1,7 – 2,6)m, nằm giữa tế bào
[13]. Loại vi khuẩn này làm giảm pectin và polysaccarit trong cây. Chúng
còn có khả năng cố định đạm.
Chúng thường sinh trưởng phát triển trên thực vật đang bị hỏng. Vì
vậy người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm. Môi trường kem và
những môi trường có tính axit yếu phù hợp với loại vi khuẩn này. Chúng là
nguồn để sản xuất kháng sinh polymyxin. Đây là một loại vi khuẩn rất phổ
NH-] giữa các loại acid amin trong phân tử protein (hay các nhóm
polypeptide). Sản phẩm thủy phân là các acid amin, sản phẩm trung gian là
các peptide có mạch dài ngắn khác nhau và peptone – sản phẩm thủy phân
không hoàn toàn của protein
H
2
N – CH – CO – NH – CH – CO -…- NH – CH – COOH H
2
N – CH – COOH + H
2
N – CH – COOH + … + H
2
N – CH – COOH Protease là một nhóm enzyme phân giải protein ( gồm proteinase,
peptidase, desaminase,…) mà phần lớn được tế bào tiết ra ngoài và hoạt
động ở bên ngoài tế bào.
Protease có chức năng sinh học rất đa dạng, đóng vai trò quan trọng
trong việc điều hòa quá trình trao đổi chất ở sinh vật sống. Ngoài chức
năng xúc tác cho phản ứng thủy phân protein thành acid amin và các hợp
chất có phân tử lượng thấp mà các tế bào có thể dễ dàng hấp thu, protease
còn có vai trò quyết định trong thiết lập, duy trì sự cân bằng giữa tổng hợp
và phân giải protein. Bên cạnh đó chúng còn tham gia vào quá trình hình
thành và nảy mầm bào tử của vi sinh vật, quá trình đông tụ máu, điều chỉnh
huyết áp, biến hình các enzyme và điều hòa biểu hiện gen [4]. So với
enzyme còn phụ thuộc vào bản chất cơ chất và nhiều yếu tố khác nữa [7].
Vi khuẩn B.subtilis là một trong những nhóm vi sinh vật gây thối rữa
tạo nhiều protease ngoại bào và đây là một enzyme protease kiềm (protease
serin). Enzyme này có pH tối ưu trong vùng kiềm (9 – 11) và chứa một
nhóm serin quan trọng ở trung tâm hoạt động.
*Sự phân giải protein ( quá trình thối rữa )
Khác với lên men, cơ chất của quá trình thối rữa là protein. Protein là
thành phần quan trọng của xác động thực vật và vi sinh vật. Protein thường
chứa khoảng 15 – 17 % Nitơ (tính theo chất khô). Nếu như tổng lượng
cacbon trong cơ thể sinh vật sống trên mặt đất là khoảng 7 tỷ tấn thì tổng
lượng nitơ sinh ra cũng tới 10 – 25 tỷ tấn. Trong lớp đất sâu 30cm bao
quanh trái đất và người ta còn thấy thường xuyên có khoảng 3 – 7,5 tỷ tấn
nitơ mà phần lớn là tồn tại trong các hợp chất hữu cơ chứa nitơ. Sự phân
giải các hợp chất chứa nitơ có ý nghĩa rất lớn đối với nông nghiệp và đối
với vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Người ta gọi quá trình này là
quá trình amon hóa.
Muốn phân giải protein cũng như đối với các hợp chất cao phân tử
khác, đầu tiên vi sinh vật phải tiết ra các enzyme phân giải protein ngoại
bào và làm chuyển hóa protein thành các hợp chất có phân tử lượng nhỏ
hơn (các polypeptid và các olygopeptid). Các chất này hoặc tiếp tục được
phân hủy thành axitamin nhờ các peptidase ngoại bào, hoặc được xâm nhập
12
ngay vào tế bào vi sinh vật sau đó mới chuyển hóa thành axit amin. Một
phần các axit amin này được các vi sinh vật sử dụng trong quá trình tổng
hợp protein của chúng, một phần khác được tiếp tục phân giải theo những
con đường khác để sinh ra NH
3
, CO
2
và những sản phẩm trung gian khác.
liệu giàu protein như thịt vụn, da… Người ta sử dụng dịch đạm thủy phân
làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và bổ sung vào thức ăn
gia súc. Dùng protease để thủy phân thường ít bị hao hụt axit amin như khi
dùng phương pháp hóa học.
Trong công nghiệp sữa, protease được dùng để sản xuất phomat nhờ
hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng. Để làm đông tụ sữa có thể dùng
rennin, pepxin hoặc một số protease vi sinh vật có hoạt tính làm đông tụ
sữa được tách từ nấm mốc và vi khuẩn. Trong số các enzyme này, rennin là
enzyme có giá trị đặc biệt, cho phép thu được sản phẩm có chất lượng cao
nhất còn các protease vi sinh vật thì ngoài khả năng làm đông tụ sữa còn có
khả năng thủy phân sâu sắc cazein, gây ảnh hưởng xấu đến mùi vị của
phomat. Vì vậy người ta cố gắng tìm ra những chủng vi sinh vật sinh
protease có đặc tính đông tụ sữa tương tự như rennin hoặc thay thế một
phần rennin ( 25 – 50 %) [7]
Trong công nghiệp nước giải khát, protease được sử dụng để làm trong
bia, trong nước hoa quả.
Trong sản xuất các chất tẩy rửa và xà phòng
Xà phòng có bổ sung protease đang chiếm lĩnh thị trường: “xà phòng
sinh học”. Tuy tỷ lệ bổ sung protease vào xà phòng rất thấp (1g/kg) nhưng
hàng năm trên thế giới đã sử dụng tới 50.000 – 60.000 tấn protease trong
14
công nghiệp xà phòng, chất tẩy [A6]. Hiện nay, ở Châu Âu sử dụng 80 – 85
% chất tẩy rửa có enzyme.
Trong nông nghiệp
Protease được sử dụng để xử lý thức ăn thô chuyển hóa thành dạng dễ
hấp thụ, bổ sung vào thức ăn gia súc.
Trong công nghiệp da
Protease được dùng trong công nghiệp làm mềm da, làm sạch, tách
lông,… nhờ sự thủy phân một phần protein của da. Chúng ta đã biết, chất
quan trọng của da là collagen. Phân tử của nó gồm những acid amin kết
protein có trong môi trường phải ở dạng dễ đồng hóa đối với vi sinh vật.
Do đó, phải thủy phân sơ bộ các protein bằng protease để cô đặc và tinh
khiết các huyết thanh kháng độc để chữa bệnh (huyết thanh kháng độc) [8].
1.2.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng protease trong sản xuất ở
Việt Nam
Ở Việt Nam protease chịu kiềm cũng đang được nghiên cứu ở Viện
công nghệ sinh học thuộc trung tâm Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ
Quốc Gia, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên (Đại Học Quốc Gia Hà Nội), Đại
Học Bách Khoa Hà Nội, viện Công nghệ Thực Phẩm, viện Sinh Học Nhiệt
Đới thành phố Hồ Chí Minh và một số trường Đại Học, Viên nghiên cứu
khác.
Nhiều ứng dụng của protease đã được ứng dụng trong các lĩnh vực
và ngành nghề sản xuất ở Việt Nam như: Trong các ngành nghề công
nghiệp rượu, bia, sữa Trong sản xuất chất tẩy rửa, trong công nghiệp
thuộc da và trong sản xuất nước tương, nước mắm
16
Phần II
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
Iốt Tinh bột tan
Fucshin HgCl
2
Cao thịt Tím gential
Pepton Cồn 96
0
Copyright: Tài liệu đại học ©