BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
VIỆN ðẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
-------------
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Nghiên cứu ñặc ñiểm sinh học của vi tảo Ankistrodesmus phân lập
từ rừng ngập mặn Xuân Thuỷ, Nam ðịnh và thăm dò khả năng
kháng tế bào ung thư biểu mô
Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hoài Hà
KS. Phạm Thị Bích ðào
Sinh viên
: Nguyễn Thị Thu Thủy
Lớp
: KSCNSH 06 – 02
Hà Nội - 2010
LỜI CẢM ƠN
ðiều ñầu tiên, tôi giử lời cảm ơn tới bố mẹ và người thân trong gia ñình
tôi ñã sinh thành, dưỡng dục, giúp ñỡ, ñộng viên ñể tôi có ñược kết quả như ngày
hôm nay. Khóa luận này, như một món quà nhỏ gửi tới bố mẹ, thay cho sự biết
ơn chân thành.
Kế ñó, tôi xin thành cảm ơn toàn thể các Thầy, Cô giáo và cán bộ Khoa
Công nghệ Sinh học – Viện ðại Học Mở Hà Nội ñã giảng dạy và giúp ñỡ tôi
AA
Arachidonic acid
LA
Linoleic acid
rDNA
Ribosomal Deoxyribonucleic acid
RNA
Ribonucleic acid
bp
Base pair (cặp bazo)
EDTA
Ethylen Diamin tetra axetic
dNTP
Deoxyonucleotit triphosphat
NCBI
Danh mục hình
Hình 1.1. Bản ñồ RNM Xuân Thuỷ nhìn từ vệ tinh ..............................................1
Hình 1.2. Một vài hình ảnh về ñộng, thực vật trong RNM Xuân Thuỷ.................3
Hình 1.3. Mô hình cấu trúc hóa học acid béo omega-3 (acid oleic)....................11
Hình 1.4. Mô hình cấu trúc hóa học acid béo omega-6 .......................................11
Hình 2.1. Bản ñồ lấy mẫu tại RNM Xuân Thủy ..................................................16
Hình 3.1. Nuôi cấy chủng A trong lọ Pennicillin ................................................29
Hình 3.2. Nuôi cấy trên môi trường thạch ...........................................................29
Hình 3.3. Khả năng sinh trưởng của chủng vi tảo A trên các môi trường khác
nhau ......................................................................................................................31
Hình 3.4. Ngày ñầu thử ñộ pH .............................................................................33
Hình 3.5. Ngày thu kết quả ..................................................................................33
Hình 3.6. Hình thái chủng A ................................................................................34
Hình 3.7. Sục khí nuôi sinh khối..........................................................................36
Hình 3.8. Thu sinh khối........................................................................................36
Hình 3.9. Sơ ñồ sắc ký khí thành phần acid béo chủng Ankistrodesmus gracilis A
..............................................................................................................................38
Hình 3.10. Mật ñộ tế bào ung thư biểu mô sau thử nghiệm ................................41
Hình 3.11. Kết quả chạy sắc ký bản mỏng...........................................................42
Danh mục bảng
Bảng 3.1. Khả năng sinh trưởng trên các môi trường khác nhau của chủng vi tảo
A………………………………………………………………………………...31
Bảng 3.2. Hàm lượng sinh khối vi tảo A khi thử ñộ pH………………………..33
Bảng 3.3. Thành phần acid béo và hàm lượng của chủng Ankistrodesmus gracilis
A………………………………………………………………………….....37, 38
Bảng 3.4. Kết quả thử hoạt tính sinh học diệt và ức chế tế bào ung thư biểu mô
miệng………….………………………………………………………………...40
2.3.3. Phương pháp xác ñịnh khả năng sinh trưởng.....................................19
2.3.4. Phương pháp xác ñịnh sự ảnh hưởng của pH tới tốc ñộ sinh trưởng.21
2.3.5. Phân loại vi tảo lục Ankistrodesmus ..................................................21
2.3.5.1. Phương pháp hình thái học.........................................................21
2.3.5.2. Phương pháp tách DNA ..............................................................21
2.3.6. Phương pháp nhân nuôi và thu sinh khối...........................................25
2.3.7. Phương pháp xác ñịnh thành phần acid béo ......................................26
2.3.8. Phương pháp thử ñộc tính tế bào – khả năng kháng tế bào ung thư..26
2.3.9. Phương pháp sắc kí bản mỏng (TLC) ................................................27
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................29
3.1. PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI TẢO .............................29
3.2. LỰA CHỌN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY THÍCH HỢP CHO CHỦNG
VI TẢO A.........................................................................................................30
3.3. ẢNH HƯỞNG CỦA ðỘ PH ðẾN TỐC ðỘ SINH TRƯỞNG CỦA
CHỦNG VI TẢO A .........................................................................................32
3.4. PHÂN LOẠI VI TẢO CHỦNG A............................................................33
3.4.1. Phân loại theo phương pháp hình thái học.........................................33
3.4.2. Phân loại theo phương pháp sinh học phân tử ...................................34
3.5. NHÂN NUÔI VÀ THU SINH KHỐI VI TẢO Ankistrodesmus gracilis A
..........................................................................................................................35
3.6. XÁC ðỊNH THÀNH PHẦN ACID BÉO CÓ TRONG VI TẢO
Ankistrodesmus gracilis A ...............................................................................37
3.7. XÁC ðỊNH KHẢ NĂNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA VI TẢO
Ankistrodesmus gracilis A ...............................................................................39
KẾT LUẬN ..........................................................................................................43
KIẾN NGHỊ .........................................................................................................44
TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................45
PHỤ LỤC 1..........................................................................................................49
ñiều trị chúng. Và vi tảo là một trong những phương thuốc hữu hiệu ñó. ðã có
rất nhiều nghiên cứu về khả năng kháng và chữa một số bệnh ung thư của vi tảo,
tạo nên một bước ñột phá trong công nghệ ngành y dược.
Vì những lý do trên, chúng tôi thực hiện ñề tài: “Nghiên cứu ñặc ñiểm
sinh học của vi tảo Ankistrodesmus phân lập từ rừng ngập mặn Xuân Thuỷ,
Nam ðịnh và thăm dò khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô” với mục ñích
sau:
1.
Nghiên cứu, phân tích thành phần dinh dưỡng của vi tảo
Ankistrodesmus trong khu rừng ngập mặn Xuân Thuỷ, Nam ðịnh.
2.
Bảo tồn nguồn gen chủng tảo Ankistrodesmus.
3.
Nghiên cứu, tách chiết và ứng dụng thành phần acid béo có trong vi
tảo Ankistrodesmus .
4.
Thăm dò khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô của chủng vi tảo
nghiên cứu
Công việc này không chỉ có ý nghĩa về mặt kinh tế, xã hội, khoa học cơ
bản mà còn có ý nghĩa tiền ñề cho các nghiên cứu ứng dụng khác sau này.
diện tích của bãi Trong và diện tích của 5 xã: Giao Thiện, Giao An, Giao Lạc,
Giao Xuân và Giao Hải [6].
Vùng ñệm là vùng rừng, ñất hoặc vùng ñất có mặt nước nằm sát ranh giới
với các vườn quốc gia và khu bảo tồn thiên nhiên; có tác dụng ngăn chặn hoặc
giảm nhẹ sự xâm phạm khu rừng ñặc dụng [8].
Hệ sinh thái rừng ngập mặn có vai trò hết sức to lớn trong ñời sống con
người và các hoạt ñộng kinh tế xã hội. Rừng ngập mặn có vai trò rất to lớn, nó
ñược coi là nguồn tài nguyên ven biển thật sự quý giá và hữu ích. Các khu rừng
ngập mặn ñóng vai trò như lá phổi không thể thiếu, ñảm bảo cho hệ sinh thái ven
biển phát triển.
Hàng năm vào tháng 11 tháng 12 âm lịch, từng ñàn chim từ Xibêri, Hàn
Quốc, Trung Quốc di cư tránh rét ñến dừng chân tại ñây, tích luỹ năng lượng, ñẻ
trứng rồi lại bay ñi. Vào những ngày chim về cư, nếu bơi thuyền hay len lỏi
trong rừng sú, vẹt có thể ngắm nhìn rất nhiều loài chim lạ ñi lại, kiếm ăn. Tại
vườn ước tính có 219 loài chim thuộc 41 họ, trong ñó có 9 loài có trong sách ñỏ
quốc tế: rẽ mỏ thìa, cò thìa, choắt mỏ thìa, mòng biển mỏ ngắn, bồ nông choắt
chân màng lớn, cò lao Ấn ðộ, choắt mỏ vàng, cò trắng Trung Quốc…
Trên vùng ñất ngập mặn này, dưới làn nước thuỷ triều có khoảng 165 loài
ñộng vật nổi và 154 loài ñộng vật ñáy, tổng cộng khoảng 500 loài ñộng vật. Về
thực vật, vườn hiện có 120 loài thực vật bậc cao, trong ñó có nhiều loài rong tảo
có giá trị kinh tế cao, trong ñó có gần 20 loài thích nghi với ñiều kiện sống ngập
nước nên ñã cấu thành khu rừng ngập mặn.
Ngoài giá trị bảo tồn cao, rừng ngập mặn còn là một vườn ươm cho sự
sống của biển. Nơi ñây cung cấp nguồn lợi thuỷ sản phong phú cùng với 500 loài
ñộng thực vật thuỷ sinh và cỏ biển cung cấp nhiều loài thuỷ hải sản có giá trị
kinh tế cao như tôm, cua, cá biển, vạng, trai, sò, cá tráp, rong câu chỉ vàng… Giá
trị về thuỷ sản ở khu vực hàng năm ước ñạt tới 50 tỷ ñồng phần lớn là nhờ vào
═════════════════════════════════════════════════════
KSCNSH 06.02
2
1.2. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ VI TẢO LỤC VÀ VI TẢO Ankistrodesmus
1.2.1. Vi tảo lục
Vi tảo lục gồm các tế bào sống ñơn ñộc, các tế bào sống thành tập ñoàn,
ña dạng. Cấu trúc tế bào vi tảo lục có tốc ñộ tiến hóa khác nhau. Tế bào ở dạng
amip ñến dạng phân hóa ra các mô. Vi tảo lục phân bố rộng khắp, từ nước ngọt
nghèo dinh dưỡng ñến nước lợ, nước biển, hay trên vật ẩm hoặc sống ngay dưới
mặt ñất.
Hình dạng cấu trúc chung của tế bào vi tảo lục rất ña dạng, có thể dạng
monas ñơn ñộc hay tập ñoàn: có dạng sợi (Fristchiella), dạng hạt, dạng màng,
dạng ống,… Phần lớn vi tảo lục có dạng hình cầu (Chlorella), hình bầu dục, hình
vuông, hình chữ nhật hay hình lưỡi liềm (Ankistrodesmus).
Cấu tạo vách tế bào vi tảo lục rất ñơn giản, chỉ có hai loại: vách trần và
vách xenluloza. Trên vách có mấu lồi hoặc gai phân bố với chức năng bảo vệ cơ
thể, giúp tế bào trôi nổi. ðôi khi một số loài vi tảo có gai phát triển thành sừng
gọi là tảo sừng (Golenkinia, Scenedesmus).
Ngoài ra còn một số loài khác có bao nhầy bao bọc ngoài vách tế bào. Có
chức năng bảo vệ cơ thể, tham gia quá trình dinh dưỡng của cơ thể nhờ lớp vi
khuẩn sống cộng sinh với lớp nhầy.
Phần lớn vi tảo lục có màu lục như cỏ. Sắc lạp cấu tạo như thực vật gồm
hai lớp màng bao bọc, bên trong có chất nền (stroma) cùng với các hệ thống các
túi dẹt gọi là thylakoid. Sắc lạp có thể hình phiến, hình lưới, hình dải, hình trụ,
hình cốc, hình sao… Thường có 2 – 6 thylakoid xếp chồng lên nhau. Trên màng
thylakoid có nhiều chất diệp lục chlorophyll a và b, xantophyl và các enzyme
tham gia và quá trình quang hợp. Có một hay nhiều pyranoid (nhân tinh bột hay
nhân protein). Nhiệm vụ chủ yếu của pyraniod là tổng hợp tinh bột. Sản phẩm dự
trữ tinh bột, ngoài ra còn có dầu (lipit). Trên sắc lạp của tảo lục ñơn bào hay tế
bào sinh sản di ñộng thường có ñiểm mắt màu ñỏ. Phần lớn tế bào di ñộng của vi
═════════════════════════════════════════════════════
KSCNSH 06.02
cho sinh vật phù du.
• Ứng dụng của vi tảo lục
═════════════════════════════════════════════════════
KSCNSH 06.02
5
Nguyễn Thị Thu Thủy
Khóa luận tốt nghiệp 2010
═════════════════════════════════════════════════════
Vi tảo lục có vai trò rất lớn trong hệ sinh thái, ngoài ra ñã có những nghiên
cứu trong nước và trên thế giới về ứng dụng của vi tảo và các sản phẩm vi tảo
trong cuộc sống.
Các chất thực phẩm và sản phẩm chức năng quan trọng trên thị trường từ
vi tảo bao gồm các hợp chất như β-caroten, acid béo không no (PUFA) như EPA
và DHA, polysaccarozo như β-glucan [16].
Chlorella, Ankistrodesmus hoặc Scenedesmus là loài vi tảo ñã ñược sử
dụng ñể xử lý nước thải ô nhiễm hữu cơ từ bột giấy và nghiền bột giấy và xay
dầu oliu [14]. Vi tảo ñã ñược sử dụng ñể loại bỏ kim loại nặng từ nước thải
[15,21]. Chlorella, Scenedesmus còn có khả năng hấp thụ một số kim loại nặng
như: Hg, Cr, Cu, Se, As... nhằm giảm bớt hàm lượng của chúng trong nước thải
[19].
Nhóm các nhà khoa học Nga và ðức do E. Safarova ñứng ñầu ñã nghiên
cứu khả năng sử dụng chủng tảo Scenedesmus obliquus ES-55 phân hủy sinh học
chất phenathrene (C14H10), ñây là một hợp chất thơm ña vòng ñược dùng ñể chế
tạo thuốc nhuộm và dược phẩm. Kết quả cho thấy, dưới ñiều kiện tế bào ñược
chiếu sáng và sinh sản trong pha log, chất phenathrene bị phân hủy ở nồng ñộ 10
mg/l. Khả năng phân hủy chất này trong môi trường BBM ñạt ñược tới 42%,
suốt, hoặc cong – dạng hình lưỡi
liềm. Chúng có thể ñứng riêng lẻ,
hoặc thành ñám xoắn lại với nhau,
ñôi khi nó tạo thành chùm xung
quanh những tảo khác [23]. Các tế
bào liên kết với nhau thành từng cụm
từ 4 – 32 tế bào, tế bào dài, vót nhọn ra hai ñầu. Tế bào này gắn với tế
bào khác ở trung tâm của cơ thể, nằm song song trên sự sắp xếp tỏa tròn.
Tế bào không có lớp màng nhày bao bọc; có một lục lạp; không có hạt
tinh bột. Vi tảo Ankistrodesmus sinh sản vô tính bằng bào tử gốc [24].
Vi tảo Ankistrodesmus rất phổ biến, chúng thường ñược tìm thấy
trong những ao và hồ nước ngọt, ñôi khi sống ở những vũng nước và
những thác nước [24].
═════════════════════════════════════════════════════
KSCNSH 06.02
7
Nguyễn Thị Thu Thủy
Khóa luận tốt nghiệp 2010
═════════════════════════════════════════════════════
1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng ñến sự sinh trưởng, phát triển của vi tảo
Ankistrodesmus
Sự phát triển của vi tảo Ankistrodesmus phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố
như ñộ pH, nhiệt ñộ, ánh sáng, ñộ ẩm, chất lượng nước, môi trường dinh
dưỡng...
+ Ánh sáng
Giống như bao loài thực vật khác, vi tảo cũng phải quang hợp, tức là
trưởng và phát triển của vi tảo. Môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng cả trên
phương diện số lượng và chất lượng. Trong nuôi sinh khối, mật ñộ tảo sẽ cao
hơn nhiều so với ngoài tự nhiên. Chính vì vậy, sau một thời gian chất dinh
dưỡng trong môi trường sẽ bị giảm sút và ta phải bổ sung dinh dưỡng cho sự
phát triển của vi tảo.
+ Nguyên tố vi lượng và vitamin
Ngoài những yếu tố trên, còn một yếu tố nữa ảnh hưởng ñến sự sinh
trưởng của chúng là những nguyên tố vi lượng. Các nguyên tố vi lượng gồm một
số các muối kim loại với nồng ñộ thấp như: CuSO4, CoCl2, ZnSO4… Vai trò của
các nguyên tố vi lượng này hầu như ñều có tác dụng ñến quá trình trao ñổi chất
của vi tảo.
Vitamin cũng ñược sử dụng khá phổ biến ñể bổ sung vào môi trường nuôi
cấy, dù chỉ với một lượng nhỏ nhưng có thể thúc ñẩy sự gia tăng sinh khối của vi
tảo.
1.3. ACID BÉO TRONG VI TẢO
1.3.1. Khái niệm về acid béo
Acid béo là các chuỗi nguyên tử carbon thẳng và dài, chứa khoảng 12-22
nguyên tử (C12-C22). Chúng có một ñầu hoà tan trong nước và ñầu metyl hoà
tan trong dầu. Dọc theo chuỗi carbon là các nguyên tử hydro. Những chuỗi này
là thành phần quan trọng trong màng của mọi sinh vật sống [3,27].
Về mặt cấu trúc hoá học, acid béo thông thường chứa 3 loại nguyên tố:
carbon, hydro và oxy. Mạch thẳng (RCOOH)- trong ñó gốc R có nhiều carbon
nối mạch có thể no (không có mạch nối ñôi) hay chưa no (có một hoặc nhiều nối
ñôi). Acid béo bậc thấp có ít carbon, bậc cao có nhiều carbon. ðầu là nhóm acid:
-COOH (vì vậy mới gọi là acid béo) và ñuôi là nhóm metyl: -CH3.
═════════════════════════════════════════════════════
KSCNSH 06.02
9
trọng có giá trị thực tiễn cao [12,25].
═════════════════════════════════════════════════════
KSCNSH 06.02
10
Nguyễn Thị Thu Thủy
Khóa luận tốt nghiệp 2010
═════════════════════════════════════════════════════
Hình 1.3. Mô hình cấu trúc hóa học Hình 1.4. Mô hình cấu trúc hóa học
acid béo omega-3 (acid oleic)
acid béo omega-6
[26,38]
[26]
Acid béo omega-3 là tiền chất của DHA (docosahexaenoic acid) và EPA
(eicosapentanoic acid). DHA là acid béo không no với chuỗi 22 carbon và chứa
6 nối ñôi, còn EPA là acid béo không no có 20 carbon và chứa 5 nối ñôi. Trong
cơ thể EPA ñược xem là acid béo thiết yếu vì sẽ chuyển hoá thành các chất sinh
học quan trọng như prostaglandin, leucotrien. Còn DHA là acid béo quan trọng
cho hoạt ñộng trí não [39].
Acid béo omega-3 có tác dụng ức chế sự sự phát triển, ngăn chặn khả
năng xâm nhập hay gây ra sự phân nhiễm của các tế bào ung thư [37]. Có khá
nhiều nghiên cứu in vitro và trên thú vật ñã ñược thực hiện và công bố. Cho ñến
ñầu thập niên 2000, có ít nhất là 57 nghiên cứu in vitro ñược công bố và trong số
này có 47 bản ghi nhận là các acid béo omega-3 có tác dụng ức chế sự phát triển,
khác như ức chế tiến trình sưng – viêm, ức chế angiogenesis, ức chế hoạt ñộng
ras-protein. Liều trung bình cũng có tác dụng ức chế Suy mòn do ung thư
(Tumor cachexia) [37].
Ngoài tác dụng ngăn chặn các bệnh về tim mạch, chứng trầm cảm hay một
vài căn bệnh ung thư ñã ñược nhắc tới nhiều, giờ ñây omega-3 còn có thêm công
dụng ngăn chặn sự tiến triển căn bệnh ung thư tuyến tiền liệt. Bác sĩ Mick Brown
và các cộng sự tại viện Paterson – thuộc bệnh viện Christie de Manchester ñã tìm
hiểu và phát hiện acid béo omega-3 ngăn chặn sự sinh trưởng của các tế bào
mầm bệnh ung thư tuyến tiền liệt [40].
Tiến sĩ Rashida A Karmali của viện ðại học Rutgers và trung tâm nghiên
cứu ung thư Memorial Sloan-Kettering ñã nghiên cứu thấy rằng acid béo omega═════════════════════════════════════════════════════
KSCNSH 06.02
12
Nguyễn Thị Thu Thủy
Khóa luận tốt nghiệp 2010
═════════════════════════════════════════════════════
3 ñã có những ñặc tính ñáng ñược nghiên cứu và phát huy ñể nó có thể trở thành
loại thuốc ngừa chống vài loại ung thư như ung thư vú và ung thư ruột già [28].
Khi bổ sung acid béo omega-3, có thể giúp giảm nguy cơ bị khối u nguy
hiểm ở những người dễ có nguy cơ mắc bệnh ung thư ruột.
Theo hãng tin AFP, ñể có kết luận trên, các nhà khoa học Mỹ ñã khảo sát
ở 55 người có nguy cơ mắc bệnh ung thư ruột cao. Cụ thể, 28 người ñược chọn
vào nhóm bổ sung 2 gam chất acid béo omega-3 mỗi ngày, trong khi 27 người
còn lại dùng giả dược. Sau 6 tháng, số khối u ñã tăng lên khoảng 10% ở những
người dùng giả dược và giảm 12% ở những người dùng viên bổ sung acid béo
omega-3. Ngoài ra kích cỡ khối u cũng tăng lên 17% ở nhóm dùng giả dược,
trong khi ñó kích cỡ khối u lại giảm 12.5% ở nhóm người còn lại [29].
(malignant melanoma). Chlorophyll còn có tác dụng giảm viêm khớp (arthritis)
xử lý các u xơ, giảm mùi hôi, giảm ñường máu của người bệnh già [34].
Ngoài những bệnh ung thư ñã nêu thì ung thư biểu mô là một bệnh rất hay
gặp như ung thư biểu mô nhú, ung thư biểu mô tủy, ung thư biểu mô gan, ung
thư biểu mô da, ung thư biểu mô vòm họng...[43].
Ung thư biểu mô (carcinoma) có nguồn gốc từ tế bào biểu mô (ví dụ như ở
ống tiêu hóa hay các tuyến tiêu hóa), thông thường là ñột biến ñiểm, nó tạo ra bất
ổn về di truyền trong tế bào [30].
Ung thư biểu mô bắt nguồn từ bên trong da hay, trong các mô nằm trên
hoặc bao phủ các cơ quan bên trong [32]. Nguyên nhân gây ung thư biểu mô là
sự sai hỏng của DNA, tạo nên các ñột biến ở các gen thiết yếu ñiều khiển quá
trình phân bào cũng như các cơ chế quan trọng khác. Một hoặc nhiều ñột biến
ñược tích lũy lại sẽ gây ra sự tăng sinh không kiểm soát và tạo thành khối u [30].
Vị trí này có liên quan ñến ung thư khoang miệng (mồm) và hầu họng (phần của
họng) [31]. Ung thư khoang miệng là một trong 10 bệnh ung thư thường gặp
nhất ở Việt Nam. Hàng năm, số lượng bệnh nhân mới ung thư khoang miệng tới
20000 người, chiếm từ 6 – 15% tổng số các loại ung thư. Tuy là loại ung thư dễ
dàng quan sát ñược nhưng phần lớn bệnh nhân ung thư khoang miệng lại ñến
khám ở giai ñoạn muộn, khi tổn thương ung thư ñã lan rộng. Bệnh dễ bị bỏ qua
bởi những tổn thương khiến người bệnh lầm tưởng họ chỉ bị những viêm nhiễm
trùng ñơn giản [41]. Phương pháp phòng bệnh ñược khuyến cáo ñối với ung thư
khoang miệng là sử dụng các biện pháp vệ sinh răng miệng thật tốt, không nên
═════════════════════════════════════════════════════
KSCNSH 06.02
14
Nguyễn Thị Thu Thủy
Khóa luận tốt nghiệp 2010
═════════════════════════════════════════════════════
2.1.3. Hóa chất
Tên hóa chất
Xuất xứ
Tên hóa chất
Xuất xứ
═════════════════════════════════════════════════════
KSCNSH 06.02
16
Copyright: Tài liệu đại học ©