BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Phân tích thành phần dinh dưỡng của vi tảo Chaetoceros phân lập
từ rừng ngập mặn Xuân Thủy-Nam ðịnh và thăm dò khả năng
kháng tế bào ung thư biểu mô
Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hoài Hà
KS. Phạm Thị Bích ðào
Sinh viên : Nguyễn Ngọc Tuyền
Lớp : CNSH 06.02
Hà Nội - 2010 LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Hoài Hà,
trưởng phòng Sinh học tảo, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học
Quốc Gia Hà Nội đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong quá trình học tập và
nghiên cứu để thực hiện khóa luận tốt nghiệp này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn KS. Phạm Thị Bích Đào, phòng Sinh học
tảo, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã góp
ý, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận.
DANH MỤC HÌNH VÀ BẢNG
Danh mục hình
Hình 1.1. Rừng ngập mặn Xuân Thủy – Nam Định 1
Hình 1.2. Bản đồ khu hệ Rừng ngập mặn Xuân Thủy 2
Hinh 1.3. Cơ cấu các ngành tảo trong mẫu thu được ở mùa khô năm 1996 tại
RNM Xuân Thủy-Nam Định 4
Hình 1.4. Cơ cấu các ngành tảo trong mẫu thu được ở mùa mưa năm 1996 tại
RNM Xuân Thủy-Nam Định 5
Hình 1.5. Cấu trúc tế bào ở tảo silic 8
Hình 1.6. Một số loài tảo silic thường gặp 9
Hình 1.7. Hình ảnh một số loài trong chi tảo Chaetoceros 12
Hình 2.1. Các điểm lấy mẫu được định vị trên bản đồ 19
Hình 3.1. Phân lập tảo trên các đĩa thạch 34
Hình 3.2. Nuôi tảo trong các lọ Penicillin 34
Hình 3.3. Nuôi giữ giống vi tảo trong các bình tam giác dung tích 250 ml 35
Hình 3.4. Khả năng sinh trưởng của vi tảo chủng TC1 trên các môi trường khác
nhau 37
Hình 3.5. Khả năng sinh trưởng của vi tảo chủng TC1 trên các thang độ mặn 40
Hình 3.6. Nuôi sinh khối vi tảo trong bình 5 lít có sục khí 24/24 và chiếu sáng.43
Hình 3.7. Hình ảnh vi tảo chủng TC1 trên kýnh hiển vi quang học Olympus
CX41 44
Hình 3.8. Sắc ký đồ thành phần acid béo của vi tảo Chaetoceros muelleri TC1.49
Hình 3.9. Mật độ tế bào ung thư biểu mô sau thử nghiệm 54
Hình 3.10. Kết quả chạy sắc ký bản mỏng 55 Danh mục bảng
Bảng 1.1. Thành phần loài thực vật nổi ven biển Xuân Thủy 6
Bảng 3.1. Số lượng tế bào chủng TC1 nuôi cấy trên sáu môi trường 36
Bảng 3.2. Mật độ tế bào chủng TC1 trên môi trường ASW với độ mặn khác nhau
2.1.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 20
2.1.3. Hóa chất 21
2.1.4. Máy móc và dụng cụ 21
2.1.5. Môi trường nuôi cấy 22
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.2.1. Phương pháp lấy mẫu 22
2.2.2. Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi tảo biển 23
2.2.2.1. Làm giàu mẫu 23
2.2.2.2. Phương pháp tách và thuần khiết trên ñĩa thạch 23
2.2.3. Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng của vi tảo biển 24
2.2.5. Phương pháp phân loại vi tảo biển 26
2.2.5.1. Phương pháp hình thái học 26
2.2.5.2. Phương pháp ñịnh loài bằng sinh học phân tử 26
2.2.6. Phương pháp nhân nuôi và thu sinh khối 30
2.2.7. Phương pháp xác định thành phần acid béo 32
2.2.8. Phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC) 32
2.2.9. Phương pháp thử khả năng kháng tế bào ung thư của acid béo 33
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35
3.1. PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI TẢO BIỂN 35
3.2. LỰA CHỌN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY THÍCH HỢP CHO VI TẢO
CHỦNG TC1 ĐÃ TUYỂN CHỌN ĐƯỢC 36
3.3. ẢNH HƯỞNG CỦA ĐỘ MẶN LÊN SINH TRƯỞNG CỦA VI TẢO
CHỦNG TC1 40
3.4. NHÂN NUÔI SINH KHỐI 42
3.5. PHÂN LOẠI VI TẢO CHỦNG TC1 ĐÃ TUYỂN CHỌN 44
3.5.1. Phân loại theo hình thái học 44
3.5.2. Phân loại dựa theo sinh học phân tử 46
3.6. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN ACID BÉO CỦA VI TẢO Chaetoceros
muelleri TC1 47
đem lại nguồn thức ăn cho các loài thủy hải sản, mà còn là nguồn cung cấp dược
liệu tự nhiên, cung cấp nguyên liệu để điều chế các chế phẩm sinh học có hoạt
tính cao, giá thành vừa phải, mà nổi bật là các acid béo được chiết xuất từ vi tảo.
Hiện nay, các nhà khoa học đã tìm ra rất nhiều loại acid béo trong vi tảo có khả
năng ngăn ngừa và ức chế tế bào ung thư, trong đó có thể kể đến các acid béo
thuộc nhóm omega 3, omega 6… đều có hoạt tính diệt bào đối với các tế bào ung
thư như ung thư vú, phổi và tuyến nhiếp hộ, và không tác động trên các tế bào
bình thường. Trên thực tế, các acid béo chưa no loại có nhiều nối đôi có hoạt tính
diệt bào (in vitro) ít nhất là đối với 16 dòng tế bào ung thư nơi người lấy từ các
cơ quan khác nhau [41].
Vì những lý do trên, cùng với mong muốn phát triển ngành nuôi trồng
thủy sản và tìm ra một nguồn nguyên liệu có hiệu quả góp phần trong điều trị
ung thư, chúng tôi thực hiện khóa luận : “Phân tích thành phần dinh dưỡng
của vi tảo Chaetoceros phân lập từ rừng ngập mặn Xuân Thủy - Nam ðịnh
và thăm dò khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô”. Với mục tiêu như sau:
• Phân lập chủng vi tảo Chaetoceros từ các mẫu lấy từ rừng ngập mặn
Xuân Thủy-Nam Định.
• Phân tích thành phần dinh dưỡng của vi tảo Chaetoceros phân lập
từ rừng ngập mặn Xuân Thủy-Nam Định.
• Bước đầu xác định khả năng kháng tế bào ung thư của vi tảo
Chaetoceros.
Công việc này không chỉ có ý nghĩa về mặt kinh tế, xã hội, khoa học cơ
bản mà còn có ý nghĩa tiền đề cho các nghiên cứu ứng dụng khác sau này.
Nguyễn Ngọc Tuyền Khóa luận tốt nghiệp
1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ RỪNG NGẬP MẶN XUÂN THỦY – NAM ðỊNH
Rừng ngập mặn Xuân Thủy - Nam Định là một vùng đất có lịch sử phát
triển trên 150 năm, bao gồm các cồn bãi tự nhiên xen kẽ các sông lạch chằng
bồi tụ, có nhiều lớp xen kẽ, nền đáy gồm bùn lẫn sét và cát mịn. Phía trong rừng
Nguyễn Ngọc Tuyền Khóa luận tốt nghiệp
3
nền đáy còn được phủ một lớp xác thực vật tạo nên lớp mùn hữa cơ giàu dinh
dưỡng.
-Về sinh thái: Rừng ngập mặn Xuân Thủy là nơi có đa dạng sinh học cao, thể
hiện qua số lượng lớn các loài động vật, thực vật, vi sinh vật. Theo số liệu của
các cuộc điều tra, ở rừng ngập mặn Xuân Thủy hiện có [17]:
105 loài thực vật bậc cao có mạch trong đó có 20 loài thích nghi với điều
kiện sống ngập nước, hình thành hệ thống rừng ngập mặn rộng trên 3000
ha, đem lại những lợi ích quý giá và phong phú cho cho toàn khu vực.
Trên 200 loài chim, trong đó có trên 100 loài chim di trú, 50 loài chim
nước. Có 9 loài ghi vào sách đỏ quốc tế. Số lượng cá thể chim di trú lúc
đông đúc lên tới 40 000 con. Ở Việt Nam hầu như chỉ có thể bắt gặp cò
thìa và Choi Choi mỏ thìa ở rừng ngập mặn Xuân Thuỷ (có lúc cò thìa tại
đây chiếm tới 20% số lượng cá thể hiện có của Thế giới). Những loại chim
quý hiếm nay đã thành biểu trưng sinh động của rừng ngập mặn Xuân
Thuỷ.
Trên 10 loài thú, trong đó có 3 loại thú quý hiếm ở nước (như cá heo, rái
cá ) cùng với hàng trăm loại bò sát, côn trùng và lưỡng cư khác đã tạo lên
bức tranh về đa dạng sinh học rất độc đáo và vô giá ở rừng ngập mặn
Xuân Thuỷ.
Trên 500 loài động vật thuỷ sinh.
104 loài thực vật nổi.
* Theo số liệu của Sở thủy sản Nam Định, mùa khô năm 1996 có kết quả
thu mẫu của 37 loài thuộc 4 ngành tảo:
Ngành tảo silic (Bacillariophyta) 15 chi, 27 loài, chiếm 73%
Ngành tảo giáp (Pyrrophyta) 2 chi, 4 loài, chiếm 10.8%
Nguyễn Ngọc Tuyền Khóa luận tốt nghiệp
4
Bảng 1.1. Thành phần loài thực vật nổi ven biển Xuân Thủy
Bộ Họ Chi Loài
TT
Các nhóm
phân loại
n % n % n % n %
1 Ngành tảo silic
2 33.32 15
75 34
79.1 95 84.82
2 Ngành tảo lục 1 16.67 2 10 3 6.97 4 3.57
3 Ngành tảo giáp
1 16.67 1 5 3 6.97 8 7.14
4 Ngành tảo lam 1 16.67 1 5 2 4.65 4 3.57
5 Ngành tảo mắt 1 16.67 1 5 1 2.32 1 0.89
Tổng cộng 6 100 20
100 43
100 112
100
Trong đó tảo silic bao giờ cũng là ngành chiếm ưu thế về cả số lượng họ,
chi và loài. Những họ Chaetoceraceae, Rhizosoleniaceae, Naviculaceae,
như: vân (stria) hay vạch đai thường song song, sườn (costa) là những vân dài
xếp thành hình song song hay xuyên tâm [1].
Chất tế bào trong suốt, thường chiếm lớp sát vỏ hay nắm cách xa vỏ thành
cục nhỏ và nối liền với vỏ bằng các sợi chất tế bào. Nhân tế bào có hình dạng
biến thiên tùy theo hình dạng tế bào: hình tròn, thoi hay bầu dục, tế bào chứa 1
nhân và ở đa số loài nhân nằm trên chất tế bào, nhưng ở một số loài nhân nằm ở
giữa tế bào trên các sợi chất tế bào.Thể màu nằm trong chất tế bào, áp sát vỏ
dưới dạng bản lớn hình chữ H như ở tảo silic lông chim, hoặc dưới dạng đĩa và
Nguyễn Ngọc Tuyền Khóa luận tốt nghiệp
8
hạt như ở tảo silic trung tâm. Chất dự trữ là dầu dưới dạng giọt da cam sáng,
ngoài ra còn có các hạt volutin màu xanh da trời [3].
Tảo silic sinh sản chủ yếu bằng hình thức phân cắt tế bào. Ngoài ra, chúng
còn có hình thức sinh sản bằng bào tử tự thân và khi gặp điều kiện bất lợi chúng
có thể hình thành bào tử nghỉ [3]. Hình 1.5. Cấu trúc tế bào ở tảo silic [29]
1.2.1.2. Phân bố và vai trò tảo silic
Tảo silic có số loài nhiều thứ hai sau tảo lục. Chúng phân bố hết sức rộng rãi
trên trái đất: trên thân cây ở đỉnh núi cao, trên đất, đá ẩm, mọi thủy vực nước ngọt,
nước lợ, nước mặn. Có thể gặp tảo silic ở đáy biển sâu hàng nghìn mét. Trong nước
hàm lượng tảo silic phong phú nhất ở độ sâu 5-30m nhưng sinh khối lại thường đạt
mức cao nhất ở độ sâu 20-50m. Trong thực vật phù du, tảo silic chiếm 60-70%, có
khi lên tới 84% về số loài cũng như sinh vật lượng. Tuy tảo silic không phải là
những đối tượng có giá trị kinh tế có thể khai thác phục vụ ngay cho đời sống con
Nguyễn Ngọc Tuyền Khóa luận tốt nghiệp
9
người nhưng nếu thiếu chúng sẽ không có nguồn thức ăn hữu cơ ban đầu, mọi
nguồn lợi hải sản đều không có cơ sở để tồn tại. Như vậy có thể nói tảo silic là
thuộc loại gần bờ nhiệt đới như: Chaetoceros pseudocurvisetus, C.lorenzianus,
C.distans, C.brevis…, một số thuộc loài biển khơi nhiệt đới như: Chaetoceros
messanensis, C.coarctatus…, một số thuộc loài á nhiệt đới hoặc ôn đới như:
Chaetoceros constrictus, C.compressus… Từ tính chất sinh thái nói trên nên bức
tranh chung về phân bố của chi tảo này thường thấy chúng tập trung nhiều ở
vùng ven bờ [2].
Chaetoceros có hình dạng rất đặc trưng. Tế bào hình hộp bầu dục, vỏ
mỏng, nối với nhau bằng gốc lông gai hoặc mặt vỏ thành chuỗi dài, một số ít loài
sống riêng lẻ từng tế bào. Mặt vỏ tế bào hình bầu dục, có một số ít loài là gần
tròn. Mặt vỏ thường bằng phẳng, cũng có khi lõm xuống hoặc chính giữa lại lồi
lên. Do đó cắt ngang tế bào hình bầu dục nên mặt vòng vỏ ở phía trước và phía
sau rộng là mặt vòng vỏ rộng (broad girdle), ở bên trái và bên phải hẹp là mặt
vòng vỏ hẹp (narrow girdle). Mặt vòng vỏ rộng có dạng chữ nhật, mặt vòng vỏ
Nguyễn Ngọc Tuyền Khóa luận tốt nghiệp
11
hẹp có dạng lục lăng dài. Trên mặt vòng vỏ có đai nối, chỗ vòng vỏ tiếp giáp với
đai nối có khi hình thành rãnh lớn, tùy loại có thể thấy rõ hoặc không.
Ở hai cực của mặt vỏ tế bào có hai lông gai dài vươn ra, phần gốc các lông
gai của hai tế bào cạnh nhau giao chéo với nhau nối thành chuỗi dài thẳng hoặc
cong, xoắn. Lông gai ở mặt vỏ của tế bào đầu hoặc cuối chuỗi có khi khác nhau
và khác với lông gai trong chuỗi. Lông gai trong chuỗi cũng có khi có những
dạng đặc biệt. Trên mặt vỏ tế bào và trên lông gai có khi có gai nhỏ hoặc u lồi
nhỏ.
Khe tế bào của các loài cũng có hình dạng rộng hẹp khác nhau, ở một số
loài không có khe tế bào.
Thể sắc tố dạng hạt nhỏ, dạng đĩa hoặc dạng tấm, nhiều hoặc ít, phân bố
trong thân tế bào hoặc có khi ở cả trong lông gai tùy theo loài. Hình thái tế bào
của một số loài thuộc chi này rất giống nhau, để định loại chính xác đối với
những loài ấy cần quan sát bào tử nghỉ của chúng, hình dạng của vỏ trên, vỏ
dưới, có gai hoặc không, cấu tạo hoặc phân bố của chúng ở hai mặt vỏ.
là một hướng đi tiềm năng cho ngành năng lượng. Các loại thực phẩm dinh
Nguyễn Ngọc Tuyền Khóa luận tốt nghiệp
13
dưỡng đa chức năng sản xuất từ vi tảo ngày càng được ưa chuộng ở nhiều nước
trên thế giới: Nhật Bản, Mỹ …
Hiện nay, một số loài vi tảo silic như: Chaetoceros, Nitzschia,
Skeletonema, Navicula… được sử dụng rộng rãi trong nuôi trồng thủy sản có giá
trị kinh tế cao như: nhum sọ, hầu, tu hài, ngao, vẹm sanh, bào ngư, cá măng …
Các loài vi tảo trên có thể được nuôi trên môi trường nhân tạo tinh khiết hoặc
môi trường tự nhiên có bổ sung thêm các thành phần khoáng [22,35].
Ở nước ta quá trình nghiên cứu về vi tảo diễn ra khá muộn so với thế giới
(cách đây 20 năm trên thế giới đã có những nghiên cứu về tảo silic ở biển).
Maurice Rose là người đầu tiên nghiên cứu về sinh vật phù du ở các vùng biển
Việt Nam. Năm 1926, ông công bố danh mục 13 chi, 20 loài tảo ở vịnh Nha
Trang. Sau đó Dawindoff C, Serene R, Yamashita M, Hàn Quốc Trương cũng đã
xác định trên 200 loài tảo silic ở vịnh Nha Trang, ven bờ biển Trung và Nam Bộ
[2]. Nhìn chung, các nghiên cứu ở giai đoạn này mới chỉ dừng ở việc xác định sự
đa dạng về thành phần loài. Những nghiên cứu sau này ngày càng tập trung sâu
vào việc nghiên cứu đặc điểm sinh học, cơ sở sinh lí, hóa sinh của các loài vi tảo
có khả năng ứng dụng cao trong thực tiễn sản xuất.
Nguyễn Thị Hương và các cộng sự đã thu thập, phân lập và lưu giữ được
17 loài vi tảo biển thuộc ngành: tảo khuê, tảo lục, tảo vàng ánh trong đó có trên
10 loài tảo là của Trung Quốc, Đan Mạch, Úc, Philippines như: Isochrysis
galbana, Tetraselmis suecica, Nannochloropsis oculata,… và những loài tảo
silic ở Việt Nam như: Chaetoceros muelleri, Nitzchia closterium, Navicula sp.,
Amphora sp., Skeletonema costatum [36].
Viện Công nghệ Sinh học Việt Nam đã có đề tài nghiên cứu về vi tảo
trong đó có các dự án đang triển khai như: nhiên liệu sinh học từ tảo biển của
Nguyễn Ngọc Tuyền Khóa luận tốt nghiệp
14
Trong cơ thể người, biểu mô được phân loại là một trong những mô căn
bản, cùng với các mô khác như mô liên kết, mô cơ, mô thần kinh.
Chức năng của các tế bào biểu mô bao gồm chế tiết, thẩm thấu chọn lọc,
bảo vệ, vận chuyển giữa các tế bào và cảm thụ xúc giác.
Trong biểu mô không có mạch máu và mạch bạch huyết nên biểu mô được
nuôi dưỡng nhờ những chất dinh dưỡng khuếch tán từ mô liên kết qua màng đáy.
Biểu mô có nguồn gốc từ cả ba lá phôi:
+ Ngoại bì (lá phôi ngoài): là nguồn gốc của biểu mô da, biểu mô của các
khoang mũi, miệng, hậu môn…
+ Trung bì (lá phôi giữa): là nguồn gốc của biểu mô hệ hô hấp, ống và các tuyến
tiêu hóa…
+ Nội bì (lá phôi trong): là nguồn gốc của biểu mô lót trong mạch máu và mạch
bạch huyết, biểu mô của các thành mạch…[46].
Biểu mô được chia làm hai loại là:
+ Biểu mô phủ: là loại biểu mô lót mặt trong của một khoang cơ thể hoặc mặt
ngoài của một cơ quan.
+ Biểu mô tuyến: là tập hợp các tế bào có chức phận chế tiết và bài xuất các chất.
1.3.2. Ung thư biểu mô tế bào
Copyright: Tài liệu đại học ©