PHƢƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT &
MỘT SỐ VẤN ĐỀ THƢỜNG GẶP TRONG QUÁ
TRÌNH PHÂN TÍCH VI SINH VẬT


Nội dung

PHẦN 1: Phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật
PHẦN 2: Các vấn đề thường gặp trong quá trình
phân tích VSV


PHẦN 1
PHƢƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT


Cấy mẫu

Đổ 12 – 15 ml PCA (Plate count agar) đã
đƣợc làm nguội 45 – 47oC. Trộn đều dịch mẫu với
môi trƣờng

Đếm tất cả các đĩa có số KL nằm
trong khoảng
15 – 300 CFU
(Đọc thủ công hoặc đọc bằng máy đếm khuẩn lạc)
4

Ngày thứ 3

Lật ngƣợc đĩa và Ủ ở 30±1oC/72±3h


5

Tính toán & báo cáo kết quả

N 

C


ĐỊNH LƢỢNG COLIFORMS
ISO 4832: 2006 / TCVN 6848:2007

Đổ 12 – 15 ml VRB (Violet red bile agar) đã
đƣợc làm nguội 45 – 470C. Trộn đều dịch mẫu với
môi trƣờng, để yên chờ đông đặc
Đổ thêm 5ml

VRB đã đƣợc làm nguội 45 – 470C.

Ngày thứ 1

Chuyển 1ml mẫu ở mỗi độ pha loãng vào 2 đĩa
petri vô trùng

Cấy mẫu

Chuẩn bị mẫu

10 gram mẫu + 90 gram SPW (Saline peptone water).

Khẳng định khuẩn lạc nghi
ngờ

Chọn 5KL cấy sang môi trƣờng BGBL
(Brilliant green bile lactose), ủ 300C/37±10C
trong 24±2h

Đọc & báo cáo

Chọn đĩa 10 -150 để đếm. Khuẩn lạc đặc
trƣng: màu đỏ tía, xung quanh khuẩn lạc có
vùng kết tủa đỏ và có đƣờng kính bằng 0,5
mm hoặc lớn hơn.

Ngày thứ 2

ĐỊNH LƢỢNG COLIFORMS
ISO 4832: 2006 / TCVN 6848:2007


Cấy mẫu

Đổ 12 – 15 ml TBX (Tryptone-bile-glucuronic
medium) đã đƣợc làm nguội 45 – 47oC. Trộn đều
dịch mẫu với môi trƣờng

Chọn đĩa có 15 -150 để đếm.
Khuẩn lạc đặc trƣng màu xanh dƣơng
8



∑C: tổng số khuẩn lạc đếm được ở
tất cả các đĩa PCA
V:
Số ml dịch mẫu được cấy
chuyển.(1ml)
d: nồng độ pha loãng đầu tiên cấy
vào đĩa.
n1 : số đĩa có 15 -150 khuẩn lạc ở
nồng độ pha loãng đầu
n2 : số đĩa có 15 -150 khuẩn lạc ở
nồng độ pha loãng sau

9

Tính toán kết quả & báo báo

N

C


Cấy chuyển 10ml mẫu ở độ pha loãng
10-1 vào 3 ống chứa10ml LSBII
và cấy 1ml ở 10-1 10-2 10-3
vào 3 ống chứa10ml LSBI

Ngày thứ 1

Cân 10 gram mẫu + 90 gram SPW. Đồng

Tryptone broth. Ủ 440C/24h

Ngày thứ 4- 6

Cấy chuyển các ống LSB (+) sang môi
trƣờng EC broth. Ủ 440C/24-48h

Ngày thứ 3- 4 Ngày thứ 2 - 3

ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG E.COLI GIẢ ĐỊNH
ISO 7251:2005 / TCVN 6846:2007


ĐỊNH LƢỢNG STAPHYLOCOCCI DƢƠNG TÍNH COAGULASE
ISO 6888-1:1999 / TCVN 4830-2:2005

Cấy mẫu
Đọc kết quả

Ủ mẫu

Ngày thứ 1
Ngày thứ 2-3

Chuyển 0.1ml mẫu ở mỗi độ pha loãng
vào 2 đĩa BP (BAIRD PARKER)

Chuẩn bị
mẫu





C
Ngày thứ 5

N

Khẳng định

Lấy 0,1ml dịch cấy từ BHI cho vào 0,3ml
huyết tƣơng thỏ, ủ ở 37oC± 1oC/6-24h .
Coaglulase (+) nếu sự kết dính chiếm 3/4
thể tích ban đầu.

Ngày thứ 5

Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ sang
môi trƣờng BHI (Brain Heart Infusion
broth). ủ ở 37o C± 1oC /24h ± 2h

Ngày thứ 4

ĐỊNH LƢỢNG STAPHYLOCOCCI DƢƠNG TÍNH COAGULASE
ISO 6888-1:1999 / TCVN 4830-2:2005


ĐỊNH LƢỢNG CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
ISO 7937: 2004 / TCVN 4991:2005


10 gram mẫu + 90 gram SPW. Đồng
nhất mẫu trong máy dập mẫu trong 30s


1. Khi ống Durham chứa 1/4 khí và có
kết tủa đen tạo thành : dƣơng tính 
là C. perfringens
2. Khi ống LS sau ủ có kết tủa đen,
nhƣng gas có ít hơn ¼ ống dulham 
Khẳng định lại

Khẳng định bằng sinh hoá
Đọc kết quả

19

Ngày thứ 3

Chuyển nhanh 5 giọt từ môi trƣờng FTB
vào môi trƣờng Lactose suphite
bằng cách dùng pipet tiệt trùng. Ủ ở điều
kiện hiếu khí ở 46±0,500C/18-24h

Ngày thứ 4

Chọn đĩa ít hơn 150KL, đếm tất cả các
khuẩn lạc có màu đen. Chọn 5 khuẩn lạc
nghi ngờ
cấy sang ống Fluid
thioglycollate broth. Ủ dƣới điều kiện

là số khuẩn lạc khẳng định (thường là 5)
là số khuẩn lạc nghi ngờ trên đĩa
là hệ số pha loãng

Khẳng định lại
bằng sinh hoá

ở 460C±0,50C/18-24h

Đọc kết quả

Ủ ở điều kiện hiếu khí

Ngày thứ 6

Chuyển nhanh 5 giọt dịch vào môi
trƣờng Lactose suphite mới bằng
cách dùng pipet tiệt trùng.

Ngày thứ 5

ĐỊNH LƢỢNG CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
ISO 7937: 2004 / TCVN 4991:2005


Cấy mẫu
Đọc kết quả

Ủ mẫu


Đọc kết quả

glycerol agar)

Ngày thứ 1

Chuyển 0.1ml mẫu ở mỗi độ pha loãng
vào 2 đĩa DG18 (Dichloran 18 %

Ngày thứ 5

10 gram mẫu + 90 gram Peptone
water 0.1%. Đồng nhất mẫu trong
máy dập mẫu trong 30s

Chuẩn bị
mẫu

ĐỊNH LƢỢNG NẤM MEN & NẤM MỐC
ISO 21527-1:2008 / TCVN 8275-1:2010

Trải bằng que trải vô trùng & ủ ở nhiệt
độ 25± 10C/3-5 ngày
24

Đếm các đĩa có số khuẩn lạc ít hơn
150, đếm và tính riêng số khuẩn lạc
nấm men, nấm mốc trên tất cả các đĩa
cấy



RV (Rappaport

Nhiệt độ ủ rất quan trọng để tăng sinh tối ƣu.
Ủ ở 41,5oC ±1oC/24h±3h cho RV
Ủ ở 37oC±1oC/24h±3h cho MKTTn

Tăng sinh chọn lọc

Đồng thời cấy 1mL sang ống 10mL MKTTn
(Muller-Kauffmann Tetrathionate-Novobiocin)

Ngày thứ 2

Vassiliadis broth).


Sau khi tăng sinh, từ RV và MKTTn dùng
que cấy vòng, cấy ria dịch mẫu sang bề mặt môi

XLD (Xylose lysine deoxycholate agar)
BPLS (Brilliant green phenol red lactose

trƣờng
BPLS

và
sucrose agar)
Lật ngƣợc các đĩa và ủ ở 37±10C/24h±3h


Khẳng định sinh hoá & kháng
huyết thanh

XLD

Cấy các khuẩn lạc nghi ngờ từ mỗi đĩa môi
trƣờng XLD và BPLS sang môi trƣờng thạch
không chọn lọc TSA. Ủ ở 37 ± 10C/24h±3h

Ngày thứ 5

ĐỊNH TÍNH SALMONELLA SPP.
ISO 6579:2002 / TCVN 4829:2005

BPLS

Lấy khuẩn lạc thuần từ TSA thực hiện các phản
ứng sinh hoá sau: Indole, URE, VP, TSI,

ONPG, LDC
Lấy khuẩn lạc thuần từ TSA thực hiện các phản
ứng ngƣng kết huyết thanh: Tự ngƣng kết,
ngƣng kết kháng nguyên thân O, ngƣng kết
kháng nguyên màng nhầy Vi, ngƣng kết kháng
nguyên tiêm mao H


6
ứ
ht

ASPW. Ủ ở 41,50C ±10C/18h ± 1h.

Ngày thứ 2

Ủ 37oC/6h (sản phẩm đông lạnh) hoặc
41,5oC/6h (mẫu tƣơi, khô, ƣớp muối)

Ngày thứ 2& 3

ASPW (Alkaline
saline peptone water)
Cân 25g mẫu +225g

Ngày thứ 1

ĐỊNH TÍNH VIBRIO CHOLERAE VÀ V.PARAHAEMOLYTICUS
ISO 21872-1:2007 / TCVN 7905-1:2008


Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ sang môi
trƣờng không chọn lọc có chứa 1% NaCl

(Saline nutrient agar) hoặc TSA
1%NaCl). Lật ngƣợc đĩa, ủ ở 37o C± 1oC
SNA 1%

/24h ± 3h

Nhận diện khuẩn lạc
Làm thuần