Mở ñầu
Vi tảo lục (Micro - green algae) phong phú về thành phần loài và ña dạng
về cấu trúc. Chúng là những vi sinh vật có khả năng quang tự dưỡng, màu lục,
ñơn bào, cộng ñơn bào và hiếm hơn là dạng tập ñoàn. Chúng có kích thước hiển
vi, sống trôi nổi trong nước, dưới ñáy các thuỷ vực, sống bám trên các ao, hồ và
các hồ chứa của thuỷ vực nước ngọt, hiếm gặp trong các thuỷ vực nước lợ và
nước biển.
Nhiều loài vi tảo lục có giá trị khoa học và thực tiễn. Ngày nay, nhiều loài
vi tảo lục ñược các nhà khoa học quan tâm, nghiên cứu ñể ứng dụng vào một số
lĩnh vực như: sản xuất thực phẩm chức năng, nhiên liệu sinh học, chiết suất các
hợp chất sinh học, xử lý ô nhiễm môi trường, làm sinh vật chỉ thị sinh học…
Rừng ngập mặn Xuân Thuỷ - (RNM Xuân Thuỷ) là khu bảo tồn dự trữ
sinh quyển ñất rừng ngập mặn. ðây là rừng ngập mặn ñầu tiên ở Việt Nam ñược
quốc tế công nhận theo công ước Ramsar, là rừng ngập mặn thứ 50 của thế giới.
RNM Xuân Thuỷ ñược nâng cấp từ khu bảo tồn ñất ngập nước Xuân Thuỷ theo
quyết ñịnh số 01/2003/Qð-TTg của Thủ tướng Chính phủ Cộng hoà xã hội chủ
nghĩa Việt Nam ngày 2 tháng 1 năm 2003 [6].
Nhưng hiện nay, RNM Xuân Thuỷ có hiện tượng bị ô nhiễm môi trường
do tác ñộng của mật ñộ dân cư trong vùng ñệm cao, nhiều người dân sống chủ
yếu bằng nghề khai thác và nuôi trồng thuỷ sản. ðiều này ảnh hưởng nghiêm
trọng ñến sự ña dạng của các loài thuỷ sinh vật nói chung và vi tảo lục nói riêng.
Ngày nay do mưu cầu mưu sinh mà nhiều người dân quanh khu vực rừng
ñã khai thác ñánh bắt một cách bừa bãi, làm tăng nguy cơ mất cân bằng sinh thái
nơi ñây.
Mặt khác, ung thư là căn bệnh chiếm tỉ lệ tử vong cao nhất hiện nay. Trên
thế giới ñã có rất nhiều nghiên cứu về bệnh ung thư, về những phương thuốc
ñiều trị chúng. Và vi tảo là một trong những phương thuốc hữu hiệu ñó. ðã có
rất nhiều nghiên cứu về khả năng kháng và chữa một số bệnh ung thư của vi tảo,
tạo nên một bước ñột phá trong công nghệ ngành y dược.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ RỪNG NGẬP MẶN (RNM) XUÂN THỦY, NAM
ðỊNH
Hình 1.1. Bản ñồ RNM Xuân Thuỷ nhìn từ vệ tinh [22]
RNM Xuân Thuỷ nằm ở phía ñông nam huyện Giao Thuỷ tỉnh Nam ðịnh,
có toạ ñộ 20o13’48’’Bắc và 106o31’00’’ ðông, ngay tại cửa Ba Lạt của sông Hồng.
Diện tích toàn bộ vườn khoảng 7100 ha, gồm 3100 ha diện tích ñất nổi có
rừng và 4000 ha ñất rừng ngập nước, bao gồm phần bãi trong của Cồn Ngạn,
Cồn Lu và Cồn Xanh. ðất ngập nước là: “Các vùng ñầm lầy, than bùn hoặc vùng
nước tự nhiên hay nhân tạo, có nước thường xuyên hay tạm thời, nước ñứng hay
nước chảy, nước ngọt, nước lợ hay nước mặn, kể cả các vùng nước ven biển có
ñộ sâu không quá 6 mét khi thuỷ triều thấp ñều là các vùng ñất ngập nước” [19].
Vùng ñệm RNM Xuân Thuỷ có diện tích là 8000 ha, gồm phần diện tích
còn lại của Cồn Ngạn (ranh giới tính từ phía trong ñê biển ñến lạch sông Vọp),
═════════════════════════════════════════════════════
KSCNSH 06.02
1
Nguyễn Thị Thu Thủy
Khóa luận tốt nghiệp 2010
═════════════════════════════════════════════════════
diện tích của bãi Trong và diện tích của 5 xã: Giao Thiện, Giao An, Giao Lạc,
Giao Xuân và Giao Hải [6].
Vùng ñệm là vùng rừng, ñất hoặc vùng ñất có mặt nước nằm sát ranh giới
với các vườn quốc gia và khu bảo tồn thiên nhiên; có tác dụng ngăn chặn hoặc
═════════════════════════════════════════════════════
khu dự trữ thiên nhiên quan trọng này. Với những ưu ñãi mà thiên nhiên ñã ban
tặng, nơi ñây ñang chứa ñựng những tiềm năng vô cùng quý giá về sinh thái
biển, du lịch biển và là vùng ñất ñược ñánh giá có sự ña dạng sinh học cao. Tuy
nhiên vườn ñang gặp rất nhiều thách thức do mất cân bằng sinh thái, mà nguyên
nhân chủ yếu là sự tác ñộng của con người [1,5,22].
Chim giang sen quý
Cò mỏ thìa mặt ñen
Gà nước ñầu ñỏ
Cò trắng lớn
Rừng ngập mặn Xuân Thủy
Hình 1.2. Một vài hình ảnh về ñộng, thực vật trong RNM Xuân Thuỷ [22]
═════════════════════════════════════════════════════
KSCNSH 06.02
3
Nguyễn Thị Thu Thủy
Khóa luận tốt nghiệp 2010
═════════════════════════════════════════════════════
1.2. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ VI TẢO LỤC VÀ VI TẢO Ankistrodesmus
1.2.1. Vi tảo lục
Vi tảo lục gồm các tế bào sống ñơn ñộc, các tế bào sống thành tập ñoàn,
Khóa luận tốt nghiệp 2010
═════════════════════════════════════════════════════
tảo lục có sợi lông roi (tiên mao) dài bằng nhau và trơn nhẵn. Một số loài lông
roi ráp vì có lông nhỏ trên mặt. Có loài trên bề mặt lông roi có một hay vài tầng
vẩy nhỏ. Các tế bào di ñộng ở tảo lục thường có 2 lông roi, một số ít có 4 lông
roi, 8 lông roi hay nhiều hơn nằm ở trước tế bào. Cũng có khi chỉ có 1 sợi lông
roi. Phần lớn tế bào tảo lục có một nhân nằm ở chính giữa nhưng cũng có một số
tế bào ña nhân. Hệ thống không bào ở vi tảo lục chủ yếu làm nhiệm vụ bài tiết
[2,4,36].
• Vai trò của vi tảo lục
Vi tảo nói chung và vi tảo lục nói riêng có vai trò rất quan trọng trong tự
nhiên và ñời sống nhân loại.
ðại dương chiếm 71% diện tích bề mặt trái ñất. Hàng năm vi tảo có thể
tổng hợp ra trong ñại dương 70 – 280 tỷ tấn chất hữu cơ. Trong các thủy vực
nước ngọt chúng cung cấp oxy và hầu hết thức ăn sơ cấp cho cá và các ñộng vật
thủy sinh khác. Vi tảo lục góp phần bảo vệ môi trường nuôi trồng thủy sản bằng
cách tiêu thụ bớt lượng muối khoáng dư thừa. Như “phát triển nhóm vi tảo lục
Chlorella” một cách hợp lý có tác dụng khống chế sự phát triển của vi khuẩn
Vibrio harveyi (vi khuẩn phát sáng gây bệnh làm tôm chết ở ñáy ao), ngoài ra lợi
ích của phiêu sinh thực vật trong quá trình hấp thụ ánh sáng mặt trời quang hợp
sẽ tạo ra oxy cho tôm, cá hấp thụ CO2 làm môi trường nước ñược cải thiện tốt
hơn [35].
Nhiều tảo ñơn bào ñược nuôi công nghiệp ñể tạo ra những nguồn thức ăn
cho ngành nuôi tôm, trong ngành nuôi trồng thủy sản cho các loại nhuyễn thể hai
mảnh vỏ, ñối với giai ñoạn ấu trùng của bào ngư, loài giáp xác, một số loài cá và
cho sinh vật phù du.
• Ứng dụng của vi tảo lục
═════════════════════════════════════════════════════
ung thư như ung thư tuyến tiền liệt, ung thư ruột kết, ung thư vú... [34].
1.2.2. Vi tảo Ankistrodesmus
1.2.2.1. Vị trí phân loại (taxon) của vi tảo Ankistrodesmus
Theo tài liệu “Tảo nước ngọt Việt Nam - Phân loại bộ tảo lục
(Chlorococcales)” của Dương ðức Tiến, Võ Hành [2] và tài liệu “Vi tảo
═════════════════════════════════════════════════════
KSCNSH 06.02
6
Nguyễn Thị Thu Thủy
Khóa luận tốt nghiệp 2010
═════════════════════════════════════════════════════
(microaglae)” của Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thị Hoài Hà [4], vị trí của vi tảo
lục Ankistrodesmus trong hệ thống phân loại tảo ñược sắp xếp như sau:
Giới: Plantae
Ngành: Chlorophyta
Lớp: Chlorophyceae
Bộ: Sphaeropleales
Họ: Ankistrodesmaceae
Chi: Ankistrodesmus
1.2.2.2.ðặc ñiểm sinh học của vi tảo Ankistrodesmus
Tế bào vi tảo Ankistrodesmus
thường dài – có hình kim, hình con
suốt, hoặc cong – dạng hình lưỡi
liềm. Chúng có thể ñứng riêng lẻ,
hoặc thành ñám xoắn lại với nhau,
ñôi khi nó tạo thành chùm xung
cho sự quang hợp. Nhưng cường ñộ ánh sáng ban ngày lại phụ thuộc rất lớn vào
ñiều kiện thời tiết, khí hậu ñịa phương, những thay ñổi ñột ngột về cường ñộ ánh
sáng, thời gian chiếu sáng (do thời tiết thay ñổi) có thể làm ảnh hưởng ñến quá
trình sinh trưởng của vi tảo, thậm chí làm cho vi tảo tàn lụi hàng loạt. Vì thế mà
có nhiều nghiên cứu về ánh sáng nhân tạo ñể thích hợp cho việc nuôi cấy vi tảo.
+ Nhiệt ñộ
Vi tảo Ankistrodesmus có thể sống trong khoảng nhiệt ñộ từ 16 – 30oC.
Nếu nhiệt ñộ cao hơn 30oC thì tảo có thể bị chết và nếu thấp hơn 16oC thì vi tảo
chậm phát triển.
+ ðộ pH
Sự biến ñộng về pH của môi trường ñều có ảnh hưởng tới sự phát triển của
vi tảo Ankistrodesmus. Nếu pH quá cao hoặc quá thấp ñều làm chậm tốc ñộ tăng
trưởng của vi tảo. Mức pH tốt nhất cho sự phát triển của vi tảo là từ 7.2 – 8.2.
Trong quá trình quang hợp vi tảo hấp thụ rất mạnh CO2 làm cho pH tăng cao.
+ Môi trường dinh dưỡng
═════════════════════════════════════════════════════
KSCNSH 06.02
8
Nguyễn Thị Thu Thủy
Khóa luận tốt nghiệp 2010
═════════════════════════════════════════════════════
Dinh dưỡng là yếu tố vô cùng quan trọng ảnh hưởng mạnh tới sự sinh
trưởng và phát triển của vi tảo. Môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng cả trên
phương diện số lượng và chất lượng. Trong nuôi sinh khối, mật ñộ tảo sẽ cao
hơn nhiều so với ngoài tự nhiên. Chính vì vậy, sau một thời gian chất dinh
dưỡng trong môi trường sẽ bị giảm sút và ta phải bổ sung dinh dưỡng cho sự
Acid béo là nhóm hợp chất hữu cơ tự nhiên rất phổ biến trong tế bào ñộng
vật và thực vật, có thành phần hoá học và cấu tạo khác nhau, nhưng chúng có
tính chất chung là không hoà tan trong nước mà hoà tan trong các dung môi hữu
cơ (ete, benzen, tuluen,...). Chất béo là hợp chất cấu tạo quan trọng của các màng
sinh học, nguồn cung cấp năng lượng, các vitamin A, D, E, F và K cho cơ thể.
Chính vì những tác dụng không thể thiếu của chúng ñối với cơ thể con người mà
ngày nay ñã có rất nhiều các nhà khoa học nghiên cứu về acid béo trên nhiều ñối
tượng khác nhau, với mục ñích sản xuất ra một số lượng lớn acid béo phục vụ
cho nhu cầu chăm sóc sức khoẻ của con người [3,25].
1.3.2. Vai trò của acid béo
• Ngăn ngừa xơ vữa ñộng mạch, ñiều hoà tính bền vững của thành mạch:
nâng cao tính ñàn hồi và hạ thấp tính thấm của thành mạch.
• Có liên quan ñến cơ chế chống ung thư.
• Cần thiết cho các chuyển hoá các vitamin nhóm B.
• Một số tổ chức như: gan, não, tim, các tuyến sinh dục có nhu cầu cao về các
acid béo chưa no, nên khi không ñược cung cấp ñủ từ thức ăn thì các rối
loạn sẽ xuất hiện ở các cơ quan này trước tiên.
• Chất béo tham gia vào cấu trúc tất cả các mô, là thành phần thiết yếu của tế
bào, của các màng cơ thể và có vai trò ñiều hoà sinh học cao.
• Trong cơ thể chất béo là nguồn dự trữ năng lượng lớn nhất.
• Chất béo kéo dài thời gian thức ăn ở dạ dày và ñi qua ñường tiêu hoá, tạo
cảm giác no sau khi ăn. Mặt khác chất béo tạo cảm quan ngon lành cho thực
phẩm.
1.4. KHẢ NĂNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA VI TẢO
Trong các loại acid béo thì acid omega-3 và omega-6 là hai acid quan
trọng có giá trị thực tiễn cao [12,25].
═════════════════════════════════════════════════════
KSCNSH 06.02
10
căn bằng giai ñoạn tràn lan của tế bào ung thư (metastasis), khi thử nơi chuột,
═════════════════════════════════════════════════════
KSCNSH 06.02
11
Nguyễn Thị Thu Thủy
Khóa luận tốt nghiệp 2010
═════════════════════════════════════════════════════
bọ; 7 nghiên cứu ghi nhận có sự liên quan trực tiếp giữa hoạt tính chống bội sinh
tế bào với sự gia tăng peroxyl hóa lipid; 11 nghiên cứu chú trọng ñến khả năng
của omega-3 ngăn cản ñược suy mòn (cachexia); 6 nghiên cứu ghi nhận acid béo
omega-3 có khả năng ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư bằng các cơ chế
tác ñộng loại ức chế sự tạo sinh các mạch máu nuôi tế bào ung thư
(angiogenesis), ức chế hoạt ñộng của ras-protein hay ức chế các men giúp tế bào
ung thư xâm lấn vào các tế bào lành mạnh khác; 5 nghiên cứu chứng minh là
acid béo làm tăng sự hiệu nghiệm của các thuốc dùng trong hóa chất trị liệu.
Khi nghiên cứu thử nghiệm trên người về hoạt tính chống ung thư của acid
béo omega-3, thì có 7 nghiên cứu ghi nhận EPA có thể ngăn chặn cachexia (sự
suy mòn) gây ra do bướu ung thư, và có 4 nghiên cứu về tác ñộng của acid béo
omega-3 trên hoạt ñộng miễn nhiễm của người bị bệnh ung thư.
Tóm lại, các thử nghiệm in vitro, trên thú vật và nơi người cho thấy acid
béo omega-3 có thể ức chế sự bội sinh của tế bào, ức chế sự tăng trưởng của tế
bào ung thư qua cơ chế hoạt ñộng ”trung gian ñiều hành các gốc tự do”. Khi
dùng liều trung bình, acid béo omega-3 có thể hữu hiệu qua các cơ chế hoạt ñộng
khác như ức chế tiến trình sưng – viêm, ức chế angiogenesis, ức chế hoạt ñộng
ras-protein. Liều trung bình cũng có tác dụng ức chế Suy mòn do ung thư
(Tumor cachexia) [37].
Ngoài tác dụng ngăn chặn các bệnh về tim mạch, chứng trầm cảm hay một
với 16 dòng tế bào ung thư nơi người lấy từ các cơ quan khác nhau [37].
Ngoài acid béo omega-3 và omega-6, trong tế bào vi tảo còn có
Chlorophyll (diệp lục) a và b cùng caroten và xanthophin, chứa chất dự trữ là
tinh bột, chất béo [33]. Chlorophyll có những ứng dụng khác nhau trong y học,
công nghiệp. Trong y học, chlorophyll ñược chú ý nhiều như một thành phần cơ
bản cho khẩu phần ăn kiêng chữa bệnh và như là chất chữa bệnh. Thí dụ
chlorophyllin dẫn xuất kim loại của chlorophyll, có tiềm năng phòng chống các
chất gây ung thư từ thức ăn bị thiu mốc như hydrocarbon mạch vòng, aflatoxin.
Chlorophyll và các dẫn xuất còn ñược sử dụng như chất thụ cảm ánh sáng ñể diệt
các tế bào ung thư và chống virut, chất kháng bổ thể, chất chữa vết thương và
khử mùi hôi [34].
═════════════════════════════════════════════════════
KSCNSH 06.02
13
Nguyễn Thị Thu Thủy
Khóa luận tốt nghiệp 2010
═════════════════════════════════════════════════════
Chlorophyll ức chế phát triển của vi khuẩn, kích thích việc phục hồi các
mô ñã bị hư hại và bảo vệ con người khỏi các chất gây ung thư. Chlorophyll còn
giúp tiêu hóa tốt và làm cho da thêm ñẹp.
ðã có những công trình nghiên cứu khả năng chữa bệnh của các hợp chất
với chlorophyll ñể chữa, tiêu diệt tế bào ung thư tủy, virut leukemia ước tính
(malignant melanoma). Chlorophyll còn có tác dụng giảm viêm khớp (arthritis)
xử lý các u xơ, giảm mùi hôi, giảm ñường máu của người bệnh già [34].
Ngoài những bệnh ung thư ñã nêu thì ung thư biểu mô là một bệnh rất hay
gặp như ung thư biểu mô nhú, ung thư biểu mô tủy, ung thư biểu mô gan, ung
cho cơ thể như acid béo omega-3 sẽ làm giảm các tế bào gây ung thư biểu mô
[31].
═════════════════════════════════════════════════════
KSCNSH 06.02
15
Nguyễn Thị Thu Thủy
Khóa luận tốt nghiệp 2010
═════════════════════════════════════════════════════
CHƯƠNG 2. ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. ðối tượng nghiên cứu
Vi tảo ñược nghiên cứu là vi tảo lục Ankistrodesmus phân lập từ các mẫu
thu ñược ở RNM Xuân Thủy, Nam ðịnh.
2.1.2. ðịa ñiểm và thời gian thu mẫu
ðịa ñiểm thu mẫu: Rừng ngập mặn Xuân Thủy, Nam ðịnh (các ñiểm
khoanh tròn trên hình 2.1).
Thời gian tiến hành nghiên cứu: Từ tháng 07/ 2009 ñến tháng 06/ 2010 tại
phòng Sinh học tảo, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, ðại học Quốc Gia
Hà Nội.
Hình 2.1. Bản ñồ lấy mẫu tại RNM Xuân Thủy
2.1.3. Hóa chất
Tên hóa chất
Xuất xứ
FeSO4. 7H2O
Merk, ðức
Ethanol
Merk, ðức
EDTA
Merk, ðức
Agarose
Merk, ðức
Tris (hydroxymethyl)
Sigma, ðức Tricine buffer
Merk, ðức
aminomethane
Na2SiO3
Merk, ðức
Fe_EDTA
Merk, ðức
Trung Quốc
2.1.4. Máy móc và dụng cụ thí nghiệm
Sử dụng các dụng cụ có sẵn tại phòng Sinh học tảo, Bảo tàng giống chuẩn
Vi sinh vật và các phòng thí nghiệm thuộc Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh
học, ðại học Quốc Gia Hà Nội.
- Kính hiển vi quang học (Olympus, Zeiss)
- Kính lúp quan sát khuẩn lạc (Olympus, Nhật Bản)
- Máy sắc ký lỏng cao áp (High Performance Liquid Chromatography,
HPLC 1100, ðức)
- Máy ly tâm Sigma, Mỹ
- Máy ño pH (Osi, Pháp)
- Máy nhân gen Amp PCR System 9700 (ABI, Mỹ)
- Máy Sequencer ABM Prism 3100-Avant (ABI, Mĩ)
- Chlorolab2, Hansatech Intruments Ltd., Anh
- Bộ ñiện di nằm (Bio-Rad, Mĩ)
═════════════════════════════════════════════════════
KSCNSH 06.02
17
Nguyễn Thị Thu Thủy
Khóa luận tốt nghiệp 2010
═════════════════════════════════════════════════════
2.2. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
Trong nghiên cứu lựa chọn môi trường nuôi vi tảo, các môi trường nuôi
tảo ñược sử dụng bao gồm: môi trường BBM, Bold 3N, C, BG 11 (Phụ lục 1).
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
cho vào nuôi cấy trong lọ Penicillin dung tích 20 ml chứa môi trường BBM.
Nuôi giữ ở nhiệt ñộ phòng dưới ánh sáng ñèn neon với cường ñộ sáng là 10000 –
20000 Lux theo quang chu kì là 10 giờ chiếu sáng và 14 giờ tối. Sau thời gian 5
– 7 ngày nuôi cấy, quan sát khả năng sinh trưởng của mẫu vi tảo ñã ñược làm
giàu bằng kính hiển vi quang học ở ñộ phóng ñại 400 – 1000 lần.
2.3.2.2. Phương pháp tách và thuần khiết trên ñĩa thạch
Quá trình phân lập ñược tiến hành theo phương pháp của Shirai [11] có cải
tiến. Các vi tảo sau khi làm giàu ñược xác ñịnh dưới kính hiển vi là các chủng vi
tảo cần phân lập. Nhỏ 100 µl dịch mẫu vi tảo trên ñĩa thạch chứa môi trường
thích hợp có bổ sung khoáng và vitamin. Sau 7 – 10 ngày nuôi cấy ở nhiệt ñộ
phòng với cường ñộ ánh sáng từ 10000 – 20000 Lux theo quang chu kì 10 giờ
chiếu sáng và 14 giờ tối, khuẩn lạc phát triển trên ñĩa thạch. Khuẩn lạc sẽ ñược
quan sát dưới kính hiển vi với ñộ phóng ñại 100, ñể xác ñịnh sơ bộ hình dạng
của chủng vi tảo. Sau ñó, chuyển sang ñộ phóng ñại 40, ñể tách khuẩn lạc của
chủng vi tảo cần phân lập bằng tăm vô trùng. Chuyển ñầu tăm có chứa khuẩn lạc
chủng vi tảo vào trong lọ Penicillin có chứa dịch thể của môi trường nuôi cấy.
Nuôi trong thời gian 5 – 10 ngày, khi sinh khối vi tảo phát triển, tiến hành quan
sát kiểm tra ñộ tinh sạch của mẫu vi tảo phân lập.
2.3.3. Phương pháp xác ñịnh khả năng sinh trưởng
ðể xác ñịnh khả năng sinh trưởng của loài vi tảo nghiên cứu chúng tôi tiến
hành nuôi trực tiếp tảo trên các môi trường ñược trình bày trong phụ lục 1, sau
ñó tiến hành ñếm tế bào ñịnh kì 2 ngày/lần trên các môi trường nuôi cấy ñể tìm
ra thời gian sinh trưởng tối ña và môi trường nuôi cấy tối ưu nhất.
*Phương pháp ñếm tế bào bằng buồng ñếm Neubauer
Cấu tạo buồng ñếm Neubauer:
Buồng ñếm Neubauer là một tấm thủy tinh dày khoảng 3 mm, ñược chia
làm ba phần. Các phần bên ngăn cách với phần giữa bởi hai rãnh dọc. Phần giữa
═════════════════════════════════════════════════════
KSCNSH 06.02
số thời gian (ngày) nuôi tảo.
*Xác ñịnh môi trường thích hợp ñể nuôi vi tảo:
Trong ñiều kiện tiến hành nghiên cứu chúng tôi tiến hành thử nghiệm
nuôi tảo thuộc chi Ankistrodesmus trong bốn môi trường nuôi cấy là: BBM, C,
═════════════════════════════════════════════════════
KSCNSH 06.02
20
Nguyễn Thị Thu Thủy
Khóa luận tốt nghiệp 2010
═════════════════════════════════════════════════════
BG 11, Bold 3N. Dịch mẫu tảo và dịch môi trường ở các môi trường nuôi cấy là
ñồng nhất, dựa vào kết quả ñếm tế bào ñể tìm ra môi trường nuôi cấy thích hợp:
mật ñộ tế bào ở môi trường nào là nhiều nhất thì ñó là môi trường tối ưu cho sự
sinh trưởng và phát triển của vi tảo nghiên cứu.
2.3.4. Phương pháp xác ñịnh sự ảnh hưởng của pH tới tốc ñộ sinh trưởng
ðể xác ñịnh mức ñộ ảnh hưởng và tối ưu của pH tới tốc ñộ sinh trưởng
của vi tảo Ankistrodesmus ta tiến hành nuôi cấy vi tảo Ankistrodesmus lần lượt
trong môi trường có pH lần lượt như sau:
ðộ pH
4
5
6
7
═════════════════════════════════════════════════════
Nguyên tắc:
Màng của tế bào vi tảo ñược phá vỡ bởi lyzozyme và các chất tẩy mạnh
như: SDS – Tris – HCl giúp DNA ñược giải phóng. Protein và RNA ñược tách
khỏi DNA nhờ các enzyme xúc tác RNazaA, proteaza K và các dung môi
chloroform : isoamyl alcohol (24: 1).
Cuối cùng DNA ñược tủa bằng etanol lạnh 100% và xác ñịnh nồng ñộ
DNA trong dung dịch mẫu.
Hóa chất:
• Phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1)
• Chloform: isoamyl alcohol (24: 1)
• Ethanol lạnh 100% và 70%
• ðệm phá tế bào: 40 mM EDTA, 50 mM Tris, 750 mM sucrose, pH = 8.0.
(Bảo quản ở 4oC trong 1 năm)
Tiến hành:
DNA ñược tách chiết từ sinh khối ướt theo phương pháp của Giovannoni
et al (1990) và có sự thay ñổi của Van Mooy et al (2004b).
Lấy vào khoảng 5 – 10 mg sinh khối tế bào sau 5 ngày nuôi cấy, ly tâm
lạnh ở 4oC với tốc ñộ 8000 – 9000 vòng/ phút trong 15 phút và rửa hai lần bằng
300 µl dung dịch muối EDTA pH 8.0 (0.5 M Na2EDTA, 0.15 M NaCl). Sau ñó
tạo dịch huyền phù trở lại trong 200 µl ñệm 10 x TE (10 mM Tris – HCl, 1 mM
EDTA, pH 8.0, tỷ lệ mẫu : ñệm = 1: 2). Sau ñó bổ sung tiếp 500 µl dịch phá tế
bào (Triston - X100 2% (v/v), 1% SDS, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA 8.0, 10
mM Tris 8.0), và hạt thủy tinh ( tỉ lệ 1: 2 mg/v), trộn ñều cho tan. Tiếp tục bổ
sung choloroform : isoamyl alcohol ( tỷ lệ 24: 1, v/v) với thể tích bằng 1/3 thể
tích mẫu, trộn ñều trong 5 – 10 phút bằng tay. Cuối cùng bổ sung protein K
(Sigma, 20 mg/ml protease K trong 1/10 x TE), ủ mẫu ở 56oC trong 10 – 15
phút. Sự tan tế bào ñược xác ñịnh bằng sự trong suốt của dung dịch cùng với sự
═════════════════════════════════════════════════════
Mồi xuôi 2F: (2-21)
5’-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3’
Hoặc 1315 F
5’-CGATAAGGAACGAGACCTT-3’
Mồi ngược 1794R: (1794-1775)
5’-GATCCTTCCGCAGGTTCACC-3’
Chương trình chạy PCR
+ Biến tính DNA ở 94oC trong 3 phút.
═════════════════════════════════════════════════════
KSCNSH 06.02
23
Copyright: Tài liệu đại học ©