BKHCN
VCNSH

BKHCN
VCHSH

VKHCNVN
VCNSH

Bé KHOA HäC
Vµ C¤NG NGHÖ

VIÖN KHOA HäC Vµ
C¤NG NGHÖ VIÖT NAM

VIÖN C¤NG NGHÖ SINH HäC
------------------------


Bộ khoa học và công nghệ

Viện kh và cn việt nam

39 Trần Hng Đạo Hà Nội

18 Hoàng Quốc Việt Hà Nội

------------------------------------

Viện công nghệ sinh học


Thông tin về đề tài

3

A1. Chủ nhiệm và cơ quan chủ trì đề tài

3

A.2. Danh sách những ngời thực hiện đề tài và phân công
công việc

4

A3. Các nội dung đang ký thực hiện theo hợp đồng

6

A4. Các sản phẩm đăng ký của đề tài

7

Tổng quan tài liệu

8

B1. tổng quan tình hình nghiên cứu ngoài nớc
B1.1 Giới thiệu bệnh Gumboro
B1.2 Chẩn đoán Gumboro
B1.3 Các serotype và phân nhóm độc lực của virus Gumboro
B1.4 Sinh học phân tử hệ gen của virus Gumboro


C.

Các phơng pháp nghiên cứu chính

29

D.

Báo cáo các kết quả đạt đợc

32

D1. Kết quả thu thập nguyên liệu và thiết kế giống gốc
D1.1 Kết quả thu thập mẫu và tiếp truyền bệnh phẩm
D1.1.1 Thu thập mẫu bệnh phẩm Gumboro
D1.1.2 Kết quả tiếp truyền virus Gumboro trên phôi và gà mẫn cảm
D1.2 Kết quả phân tích và chọn lọc chủng đại diện
D1.2.1 Bố trí nghiên cứu chọn lọc chủng cung cấp nguồn gen
D1.2.2 Các plasmid vector sử dụng trong nghiên cứu vacxin ADN
D1.2.3 Kết quả chọn lọc nguồn gen các chủng đại điện
D1.3 Kết quả thiết kế plasmid giống gốc pG-VP2

32
32
32
33
34
34
38

59

D2.3 Sản phẩm plasmid giống gốc và vacxin (đơn và đa chủng)

63

D3. Kết quả kiểm nghiệm biểu hiện gen và miễn dịch vacxin
D3.1 Kết quả kiểm nghiệm biểu hiện gen VP2 trong hệ thống E. Coli
D3.1.1 Yêu cầu kiểm nghiệm và nguyên vật liệu
D3.1.2 Phơng pháp biểu hiện
D3.1.3 Kết quả biểu hiện của gen VP2
D3.2 Kết quả kiểm nghiệm miễn dịch của vacxin bằng ELISA
D3.2.1 Yêu cầu và bố trí thí nghiệm
D3.2.2 Kết quả kiểm nghiệm miễn dịch của vacxin quy mô phòng thí
nghiệm
D3.2.3. Kết quả kiểm nghiệm miễn dịch của vacxin thử nghiệm mở rộng
ỏ miền Bắc đợt I
D3.2.4 Kết quả kiểm nghiệm miễn dịch của vacxin thử nghiệm mở rộng
ở miền Bắc đợt II
D3.3 Kết quả kiểm nghiệm miễn dịch của vacxin bằng phơng pháp công
cờng độc
D3.3.1 Yêu cầu thí nghiệm
D3.3.2 Bố trí thí nghiệm
D3.3.3 Kết quả chuẩn độ xác định liều gây nhiễm 50% trên gà của chủng
BDG
D3.3.4 Kết quả công cờng độc kiểm nghiệm miễn dịch của vacxin
D3.3.5 Kết luận thí nghiệm công cờng độc
D3.4 Kiểm định pháp lý của vacxin
D3.4.1 Xây dựng tiêu chuẩn vacxin
D3.4.2 Xây dựng phiếu kiểm định vacxin xuất xởng

D6. Kết quả đào tạo
D6.1 Khóa luận tốt nghiệp đại học
D6.2 Luận văn cao học
D6.3 Đề cơng nghiên cứu sinh
D7. Tổng kết sản phẩm của đề tài

85
85
86
86
86
88
88
88
89
89
90

E.

Tình hình sử dụng kinh phí và báo cáo quyết toán tài
chính

91

F.

Nhận xét và đánh giá kết quả đạt đợc của đề tài

92

đàn gà thử nghiệm.
Để thực hiện đợc mục tiêu trên, đề tài cần thiết kế đợc plasmid biểu hiện
tái tổ hợp chứa gen kháng nguyên VP2 từ nhiều chủng Gumboro chọn lọc khác
nhau của Việt Nam, sản xuất và thu nhận đợc ADN tinh khiết làm nguồn nguyên
liệu thử nghiệm vacxin ADN đa chủng, ổn định, chất lợng đạt điều kiện quy định
OIE/WHO và triển khai thử nghiệm vacxin ADN, kiểm tra an toàn, vô trùng và
hiệu lực đảm bảo tiêu chuẩn của OIE/WHO quy định. Đề tài đã sử dụng các
phơng pháp sinh học phân tử trong thiết kế plasmid tái tổ hợp (RT-PCR, dòng
hoá, giải trình trình tự, chọn lọc tách ADN tái tổ hợp), các phơng pháp kiểm tra
giống và vacxin (an toàn, vô trùng, hiệu lực), các phơng pháp huyết thanh học
(ELISA) xác định bảo hộ miễn dịch.
Trong 2 năm thực hiện, đề tài đã thu nhận đợc hơn 90 mẫu virus cờng độc
gây bệnh từ 3 miền (Bắc, Trung, Nam), 3 mẫu vacxin và đã thu nhận và phân tích
vùng siêu biến đổi (474 bp) của gen VP2, từ đó chọn lọc các chủng có kháng
nguyên đồng nhất theo nhóm của từng vùng địa lý. Trên cơ sở đó, đã phân lập và
lu giữ toàn bộ gen VP2 trong 15 plasmid trung gian (pCR2.1TOPO), từ nguồn gen
này đã thiết kế đợc 15 plasmid gốc (pG-VP2) chứa toàn bộ gen VP2 và một số
1


Báo cáo tổng kết

LTH/KC.04.29(2004-2006)/VCNSH

plasmid gốc (pG-A) chứa toàn bộ phân đoạn A, làm nguyên liệu chọn giống sản
xuất vacxin ADN và tiến hành nghiên cứu xây dung 2 bộ Quy trình: i) Quy trình
công nghệ sản xuất vacxin ADN đa chủng tại Việt Nam; ii) Quy trình kiểm định và
sử dụng vacxin ADN đa chủng tại Việt Nam.
Sử dụng giống gốc chứa gen VP2 (pG-VP2), đề tài đã sản xuất đợc
100.000 liều vacxin đơn chủng cho 5 chủng chọn lọc (20 àg ADN/liều đơn chủng),

kc.04.29


Bỏo cỏo tng kt

LTH/KC.04.29(2004-2006)/VCNSH

Tên đề tài:

Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sản xuất vacxin ADN đa chủng Gumboro
phòng bệnh cho gà

A. thông tin về đề tài
A1. chủ nhiệm đề tài và cơ quan chủ trì đề tài
Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Lê Thanh Hoà
Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên chính
Điện thoại: (4)7567297; (4)7564391 (CQ)/ (4)8525566 (NR); Mobil: 0912336855
Fax: (4)8363144
Email: [email protected], [email protected]

Cơ quan chủ trì: Viện Công nghệ Sinh học Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Địa chỉ cơ quan: 18 Đờng Hoàng Quốc Việt, Quận Cầu Giấy, Hà Nội Việt Nam.
Thời gian thực hiện: 24 tháng (01/01/2004 31/12/2005)
Kinh phí đợc cấp: 1.900 triệu (một nghìn chín trăm triệu).

3


Bỏo cỏo tng kt



1 Nguyễn Hoàng Dơng
2 Phạm Đức Thuận
Lê Thị Hồng Minh
3
III

Nguyễn Thị Kim Cúc
1 Nguyễn Thị Tuyết Mai

Học hàm
Cơ quan công tác
học vị
PGS.TS,
Phòng Miễn dịch học,
NCVC
Viện Công nghệ Sinh học
ThS
ThS
ThS
ThS
ThS
CN
CN
CN
-

Phân công
phụ trách
Chủ nhiệm

và khảo sát tính đặc hiệu của chúng.
Phân tích biến đổi gen VP2 và tạo dòng ổn định.
Nghiên cứu lắp ráp plasmid tái tổ hợp phân đoạn
VP2, từ các chủng đại điện đợc chọn lọc, để làm
plasmid gốc.
Nghiên cứu chuyển nạp plasmid gốc vào các dòng tế
bào chuẩn, giữ giống gốc.
Nghiên cứu kỹ thuật tinh sạch ADN plasmid làm
vacxin.
Bố trí thử nghiệm vacxin ở các cơ sở thí nghiệm.
Tổng kết đề tài, hội nghị và xuất bản.
Nghiên cứu tách chiết ARN tổng số của một số
chủng virus.
Nghiên cứu thực hiện phản ứng RT-PCR phân đoạn
A, VP2.
Nghiên cứu các điều kiện lên men, nhân ADN
plasmid tái tổ hợp từ plasmid gốc.
Sản xuất vacxin quy mô nhỏ, đánh giá hiệu lực.
Sản xuất lô lớn, kiểm tra tiêu chuẩn an toàn vô trùng
hiệu lực của vacxin. Xây dựng quy trình an toàn.

4


Bỏo cỏo tng kt

LTH/KC.04.29(2004-2006)/VCNSH

danh sách những ngời thực hiện đề tài và phân công công việc (tiếp)
Học hàm

Phụ trách
nhánh

VI

1 Đào Thị Tuyết
2 Lê Thị Thu Giang
Lê Quang Huấn

CN
ThS
TS

1 Vũ Thị Bích Hờng
2 Trần Thị Thanh Huyền
VII
Phùng Đức Tiến

ThS
CN
TS

1
VIII

TS
TS

Phòng Công nghệ tế bào ĐV
Viện Công nghệ Sinh học

Nguyễn Thị Nga
Đinh Thị Bích Lân
1 Nguyễn Quang Vinh
2 Phùng Thăng Long
Nguyễn Bá Thành

BSTY
PGS.TS
TS

1 Trần Thị Cẩm Vân
2 Trần Đình Từ

ThS
PGS.TS

Phân công công việc chính
Su tập và tạo các loại tế bào chủ thích hợp,
cung cấp tế bào để sản xuất vacxin.
Thiết kế plasmid gốc chứa gen VP2 phân lập từ
các chủng Gumboro ở tỉnh Thừa Thiên Huế.
Thử nghiệm liệu pháp vacxin (chất mang, bổ trợ,
phơng pháp sử dụng)
Phân lập gen VP2 từ các chủng Gumboro ở các
tỉnh phụ cận Hà Nội và thiết kế plasmid gốc cho
sản xuất vacxin ADN.
Khảo nghiệm vacxin ở miền Bắc

Thu thập một số mẫu virus Gumboro
Khảo nghiệm vacxin ở miền Trung

A (3,1 kb).
8. Nghiên cứu lắp ráp plasmid tái tổ hợp phân đoạn VP2, từ các chủng đại diện đợc
chọn lọc, để làm plasmid gốc (pG-VP2).
9. Nghiên cứu lắp ráp plasmid tái tổ hợp phân đoạn A, từ các chủng đại diện đợc
chọn lọc, để làm plasmid gốc (pG-A).
10. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp đánh giá biểu hiện phân đoạn VP2, phân đoạn A đạt
tiêu chuẩn để làm plasmid gốc.
11. Su tập và tạo các loại tế bào chủ thích hợp (dòng tế bào chủ ổn định).
12. Nghiên cứu chuyển nạp plasmid gốc vào các dòng tế bào chuẩn, giữ giống gốc
(dòng tế bào tái tổ hợp chứa plasmid gốc).
NHóM II: (Sản xuất, kiểm nghiệm và thử nghiêm vacxin)
Mục 4: Nghiên cứu sản xuất vacxin
13. Nghiên cứu các điều kiện lên men, nhân ADN plasmid tái tổ hợp từ plasmid gốc
(ADN plasmid chứa gen VP2 hoặc phân đoạn A để làm vacxin).
14. Nghiên cứu kỹ thuật tinh sạch ADN plasmid chứa gen VP2 hoặc phân đoạn A để
làm vacxin, kiểm tra an toàn, vô trùng.

6


Bỏo cỏo tng kt

LTH/KC.04.29(2004-2006)/VCNSH

15. Sản xuất lô vacxin quy mô nhỏ và lớn (yêu cầu cần đạt: 100.000 liều vacxin), thử
nghiệm liệu pháp vacxin (chất mang, bổ trợ, phơng pháp sử dụng), bố trí thử
nghiệm vacxin ở trại thí nghiệm, đánh giá hiệu lực.
Mục 5: Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất, kiểm nghiệm vacxin
16. Xây dựng quy trình sản xuất, kiểm nghiệm, sử dụng vacxin.
17. Bố trí khảo nghiệm ở địa phơng tại miền Bắc và miền Trung.

Bursal Disease - viết tắt là IBD) là một bệnh cấp tính, có khả năng lây lan rất cao ở gà
con 2-6 tuần tuổi, gây chết với tỷ lệ khá cao, từ 10-30%. Số còn lại còi cọc, chậm lớn,
dễ phát bệnh, do vậy, khi bị bệnh, thông thờng cần phải tiêu diệt cả đàn gà. Mỗi năm,
ớc tính 35 tỷ USD thiệt hại do IBDV gây ra đối với chăn nuôi gà thế giới (Lukert và
Saif, 1997). Do có sức đề kháng rất mạnh với điều kiện thiên nhiên cũng nh các yếu
tố vật lý và hoá học, nên virus lu hành rộng rãi. Đích tấn công của IBDV là các cơ
quan tổ chức Lympho - đặc biệt là túi Fabricius (có kích thớc bằng hạt lạc, cấu tạo
múi, nằm ở dới hậu môn) cũng nh các loại tế bào có thẩm quyền miễn dịch, trớc
hết là Lympho B và đại thực bào. Các bệnh tích đặc trng chủ yếu là túi Fabricius sng
to (2-3 lần), thủy thũng, xung huyết, xung quanh túi có thẩm dịch, sau 3-4 ngày bị teo
dần và sau 1 tuần chỉ còn 1/3 kích thớc ban đầu. Bệnh tích cũng biểu hiện ở sự xuất
huyết cơ lờn và đùi do các sản phẩm và độc tố trong quá trình sinh bệnh gây tắc mạch
máu, mao quản, gây hoại tử tế bào và xuất huyết thẩm dịch. Khi bị huỷ hoại, các cơ
quan và tế bào có thẫm quyền miễn dịch không thực hiện đầy đủ chức năng đáp ứng
miễn dịch, do vậy, gia cầm trở nên bị suy giảm nghiêm trọng về miễn dịch
(immunosuppression). Mọi chơng trình vacxin khác, không hoặc kém phát huy hiệu
lực do hệ miễn dịch của gà bị thiểu năng bởi tác hại của IBDV (Lukert và Saif, 1997).
Mức độ suy giảm miễn dịch phụ thuộc vào độc lực của virus, thời gian và nơi xâm
nhập của IBDV vào cơ thể gà, nếu bị nhiễm dới 3 tuần tuổi hoặc càng sớm, thì gà
càng bị hậu quả suy giảm miễn dịch nặng nề (Lukert và Saif, 1997).
B1.2 Chẩn đoán Gumboro
Ngoài các phơng pháp chẩn đoán IBDV cổ điển nh nuôi cấy trong phôi gà, gà
con mẫn cảm, môi trờng tế bào xơ phôi gà, mổ khám toàn thân và xem bệnh lý túi
Fabricius, nhiều phơng pháp mới ngày càng hoàn thiện dần đợc áp dụng nh kính
hiển vi điện tử; miễn dịch huỳnh quang; khuếch tán trên thạch AGP, miễn dịch hấp phụ
enzym ELSA, trung hoà virus VN (virus neutralization); dò ADN bổ sung (cDNA
probe); hợp lai ADN không phóng xạ và nhiều phơng pháp khác (OIE:
http://www.oie.int/; Lukert và Saif, 1997). Gần đây, do nhu cầu cần chẩn đoán nhanh
để giảm thiệt hại, hơn nữa, do lợi thế là hệ gen IBDV đã đợc giải trình toàn bộ, nên
8

lập năm 1987 tại Việt Nam, thuộc nhóm 4/Serotype I (Lê Thanh Hoà, 1992; 2003a; Lê
Thanh Hoà và cs, 2002). Do phức tạp về kháng nguyên và gây bệnh của Gumboro,
trong chơng trình vacxin, chúng ta bắt buộc cần phải xem xét tính thích hợp của loại
hình vacxin nhập ngoại với các chủng cờng độc gây bệnh trong một quốc gia, sao cho
sử dụng có hiệu quả (INCO Report, 1999)
B1.4 Sinh học phân tử hệ gen virus Gumboro
Hệ gen của virus Gumboro chứa axit ribonucleic (ARN) gồm 2 phân đoạn A và
B móc vào nhau (Hình B-1). Phân đoạn A bao gồm một tổ hợp (một khung đọc mở)
9


Bỏo cỏo tng kt

LTH/KC.04.29(2004-2006)/VCNSH

gồm các phân đoạn gen kế tiếp nhau có trách nhiệm tổng hợp các loại protein VP2,
VP3, VP4 và VP5; phân đoạn B tổng hợp protein VP1.
1kb

2kb

3kb

5

3

B

A

độc lực)

VP4 (28 kDa )

VP3 (30-32 kDa )

PROTEASE

CAPSID
(protein
cấu trúc)

(protein enzyme)

Hình B-1. Sơ đồ minh hoạ hệ gen của virus Gumboro và quá trình tổng hợp protein cấu
trúc. Ghi chú: Hệ gen virus Gumboro bao gồm 2 phân đoạn (A và B), trong đó phân đoạn B mã hoá
cho 1 loại protein (VP1); phân đoạn A mã hoá cho protein VP5và một protein chung, sau khi đợc
phân cắt sẽ cho 3 loại protein sản phẩm độc lập bao gồm VP2, VP3 và VP4 (xem Lê Thanh Hoà,
2003a).

Phân đoạn A có độ dài khoảng 3200 nucleotid, mã hoá cho một protein chung
(VP2-4-3) sau đó đợc phân cắt thành các protein VP2; VP4 và VP3 riêng biệt và
protein VP5 có phân tử lợng 17 kDa. VP1 là protein có hoạt tính enzyme protein
ARN-polymerase. VP2 là protein vỏ, đợc mã hoá bởi đoạn gen có độ dài khoảng 1350
10


Bỏo cỏo tng kt

LTH/KC.04.29(2004-2006)/VCNSH

Vacxin có độ độc thấp sử dụng cho gà bố mẹ, loại trung bình và cao sử dụng cho gà
thịt (OIE: http://www.oie.int/). Thế mạnh của vacxin nhợc độc là gây miễn dịch tốt,
11


Bỏo cỏo tng kt

LTH/KC.04.29(2004-2006)/VCNSH

thế yếu là dễ tăng độc lực trở thành cờng độc (lại độc) và trở thành nguy cơ tàng
nhiễm (Lukert và Saif, 1997, Lê Thanh Hoà, 2003a). Vacxin vô hoạt (inactivated)
dạng nhũ dầu đợc tạo ra để gây miễn dịch cho gà mẹ nhằm cung cấp kháng thể thụ
động cho gà con đảm bảo bảo hộ miễn dịch trong 2 tuần đầu sau khi nở (OIE:
http://www.oie.int).
Các loại vacxin thế hệ mới đã đợc thử nghiệm thành công và ứng dụng trong
thực tế bao gồm: vacxin dới nhóm (subunit vaccine), vacxin tái tổ hợp có vectơ truyền
(vectoral vaccine), vacxin virus Gumboro không có lõi (VLP; virus-like particle
vaccine), và vacxin ADN (DNA vaccine). Tóm lợc: 1) Vacxin dới nhóm là tái tổ
hợp gen kháng nguyên của virus Gumboro vào palssmid biểu hiện, sản xuất trong hệ
thống nấm men (Fahey và cs, 1991), hệ thống baculovirus và tế bào côn trùng (Dybing
và Jackwood, 1998), tách chiết polypeptit kháng nguyên bằng công nghệ (in vitro) bổ
sung chất bổ trợ rồi làm vacxin; 2) Vacxin tái tổ hợp có vectơ truyền là phân lập và
tái tổ hợp gen kháng nguyên vào một loại virus làm nhiệm vụ dẫn truyền nh virus
Herpes gà tây (Darteil và cs, 1995), virus Adeno (Sheppard và cs, 1998), virus đậu gà
(Shaw và Davison, 2000), Semliki Forest virus (Phenix và cs, 2001), virus vacxin
Marek (Tsukamoto và cs, 2002); và đa vào cơ thể làm vacxin; 3) Vacxin virus
Gumboro không có lõi là tạo nên hệ thống vectơ tái tổ hợp toàn bộ gen kháng nguyên,
gen cấu trúc và sản xuất chúng trong hệ thống tế bào thích hợp để chúng lắp ghép tạo
nên vỏ virus Gumboro, nhng không chứa ARN hệ gen (VLP; virus-like particle)
(Fernandez và cs, 1998; Lee và cs, 2003); 4) Vacxin ADN là tái tổ hợp gen kháng

thiết kế, đơn giản trong sản xuất, tiện lợi trong sử dụng, và cho miễn dịch đáp ứng yêu
cầu, trong 5 năm gần đây, với mục đích bảo vệ con ngời và động vật, đã có hàng chục
loại vacxin ADN đợc thiết kế, thử nghiệm, một số đã sử dụng tiền lâm sàng
(preclinical trial) đối với hầu hết các đối tợng, bao gồm virus, vi khuẩn, ký sinh trùng
và thậm chí cả prion (Chattergoon và cs, 1998; Robinson và Pertmer, 2000). Đã có ít
nhất 50 loại vacxin ADN virus; 9 loại vacxin ADN vi khuẩn; 9 vacxin ADN ký sinh
trùng và prion, đã đợc thống kê và phân tích trong bài tổng quan về vacxin ADN của
Robinson và Pertmer (2000).
Vacxin ADN là sản phẩm của quá trình chọn lọc, phân lập gen kháng nguyên,
thiết kế vectơ và kết nối chúng thành một tổ hợp gọi là plasmid vectơ tái tổ hợp,
chuyển nạp vào tế bào vi khuẩn thích ứng, tách chiết ADN và tinh sạch, rồi sử dụng
ADN plasmid tái tổ hợp nh là một loại chế phẩm làm vacxin trên đối tợng là ngời
và động vật (Babiuk và cs, 2002). Plasmid làm khung cho vectơ tái tổ hợp trong thiết
kế vacxin ADN phải là một plasmid biểu hiện (expression vector), mà về nguyên tắc,
ngoài các thành phần cần có của một plasmid hoạt động, phải bố trí một promotor rất
mạnh, đủ để thực hiện chức năng biểu hiện gen protein kháng nguyên gài vào sau nó,
đợc sử dụng nhiều nhất là chuỗi nucleotide promotor lấy từ cytomegalovirus
(Robinson và Pertmer, 2000). Trong vectơ biểu hiện protein, cần có thêm các tiểu phần
trợ giúp khác, trớc hết là tiểu phần tín hiệu poly-A gắn vào sau chuỗi gen kháng
nguyên tái tổ hợp, sử dụng nhiều nhất là chuỗi nucleotide có chức năng gắn tín hiệu
13


Bỏo cỏo tng kt

LTH/KC.04.29(2004-2006)/VCNSH

polyA của gen -globin của thỏ (rabbit -globin polyadenylation signals) hoặc của
gen hocmôn sinh trởng bò (bovine growth hormone polyadenylation sequence, ký
hiệu là BGH).



Bỏo cỏo tng kt

LTH/KC.04.29(2004-2006)/VCNSH

một promotor rất mạnh và thích hợp với tế bào chủ, đủ để thực hiện chức năng protein
kháng nguyên gài vào sau nó (Robinson và Permer, 2000).

Atg

Toàn bộ gen kháng nguyên

tga;taa

ADN gen kháng nguyên (cần tái tổ hợp vào vector)

pDNAvac
(5,5kbp)

Hình B-2. Cấu trúc khung của plasmid vector và mô tả mô hình tái tổ hợp gen kháng
nguyên để làm plasmid gốc sản xuất vacxin ADN (khung pcDNA3.1 của Invitrogen,
Mỹ).

Promotor đợc sử dụng nhiều nhất là chuỗi nucleotid lấy từ cytomegalovirus
(CMV). Thực chất đó là promotor điều hòa gen sớm (immediate early promotor) của
virus CMV. Trong vector biểu hiện protein ngoài promotor, cần có các tiểu phần trợ
giúp khác, trớc hết là tiểu phần tín hiệu poly-A gắn vào sau chuỗi gen kháng nguyên
tái tổ hợp. Sử dụng nhiều nhất là chuỗi nucleotide có chức năng gắn tín hiệu polyA
của gen -globin của thỏ (rabbit -globin polyadenylation signals) hoặc của gen

luật này. Ngời ta gọi đây là quy luật Kozak. Cụ thể, có một số quy luật Kozak trong
thiết kế biểu hiện gen nh sau:
i) Cần có chuỗi GCC hoặc GCG trớc bộ mã ATG của gen;
i) Cần có chuỗi GCCAUGG trớc và ngay phần đầu của gen;
i) Cần có chuỗi 2x/3x(GCC) trớc bộ mã ATG của gen;
i) Tại vị trí -3 cần có nucleotid gốc purin, nếu không, thì cần có Guanine (G)
ở vị trí thứ +4 (Lee và cs, 1997).
Vai trò của chuỗi Kozak càng đặc biệt quan trọng, nếu đợc thiết kế vào một
gen có nguồn gốc vi sinh vật bậc thấp (prokaryotic gen) để biểu hiện trong hệ thống tế
bào nhân chuẩn (eukaryotic cell). Do vậy, trong thiết kế cần kèm theo chuỗi Kozak để
tăng cờng khả năng biểu hiện gen mới cho sản phẩm với hàm lợng cao.

16


Bỏo cỏo tng kt

LTH/KC.04.29(2004-2006)/VCNSH

B1.8.2 Chuỗi CpG kích ứng miễn dịch
Hiệu lực của một vacxin ADN, ngoài yếu tố kích thích miễn dịch mạnh của
protein kháng nguyên (thành phần chính của vacxin ADN), còn có vai trò của một số
thành phần khác có vai trò kích thích trong quá trình đáp ứng miễn dịch, hay còn gọi là
các thành phần kích ứng miễn dịch.
Một trong các thành phần đó phải kể đến chuỗi CpG. CpG là cấu trúc thành
phần của hệ gen vi khuẩn, một loại hình cấu trúc ngắn thờng gặp (microsatellite), kể
cả bắt gặp chúng trong hệ gen động vật bậc cao, trớc hết là ở ngời (Krieg và cs,
1998). Nét đặc trng nhất phân biệt motif CpG của ngời, thuộc tế bào nhân chuẩn
(eukaryote) và CpG của vi khuẩn thuộc tế bào nhân sơ (prokaryote), là CpG của ngời
và động vật bị metyl hóa (methylation), còn ở vi khuẩn CpG không bị metyl hóa và

trúc lặp CpG cho mỗi loại hình, sao cho ảnh hởng của cơ chế feed-back không theo
chiều tác dụng kìm hãm miễn dịch (Klinman và cs, 1997).
Những dẫn chứng sau đây cho thấy cần thiết phải thiết kế đúng số lợng và loại
hình CpG, để chúng ta có thể có đợc loại vacxin ADN có vai trò kích thích cả hai loại
đáp ứng miễn dịch: miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào. Ví dụ, một
plasmid vector đợc bố trí 245 cấu trúc lặp CpG, trong đó 134 là CpG-N. Nếu có 56
CpG-N đột biết trong số 134 CpG-N này thì vacxin ADN này kích thích miễn dịch dịch
thể, tức là kích thích sinh kháng thể dịch thể gấp 2 lần, và có đến 30 40% tế bào
Lympho-T đợc biệt hóa thành tế bào Tc (Tc: cytotoxic T). Nếu cho thêm 16 cặp CpGS vào vector nói trên, hàm lợng kháng thể dịch thể đợc kích thích sinh ra tăng gấp 6
lần, nhng mức độ kháng thể tế bào Tc không thay đổi. Nếu cho cặp CpG-S lên đến
con số 50 cặp, thì hàm lợng kháng thể dịch thể vẫn không tăng hơn, nhng lợng Tc
sinh ra nhiều hơn, đến 55% tổng số tế bào Lympho-T đợc sinh ra, qua xét nghiệm
miễn dịch.
Nh vậy CpG-S có một giới hạn trong hiệu ứng kích thích miễn dịch dịch thể.
Giả thuyết cho việc tăng số lợng CpG-S kìm hãm hàm lợng kháng thể dịch thể sinh
ra là do các chuỗi này cùng kích thích sinh ra interferon (IFN) thông qua TH1 và
interferon tác dụng làm giảm biểu hiện gen kháng nguyên của vacxin ADN. Nh vậy
CpG là cần thiết bố trí vào vacxin ADN nh là một thành phần bổ trợ thuộc thế hệ mới
(bổ trợ bằng công nghệ gen), nhng không nhất thiết chính xác và kỹ lỡng về số
lợng và cấu trúc, mà chỉ cần sự có mặt của chúng trong cấu trúc plasmid làm vacxin
ADN là đủ (Wang và cs, 2003).
B1.9 Miễn dịch học của vacxin ADN
B1.9.1 Vai trò của tế bào tua (DC) xử lý ADN kháng nguyên
Vacxin ADN có u thế tạo nguồn kháng nguyên lâu bền, hàm lợng đủ để các
tế bào trình diện kháng nguyên (APC: antigen presenting cells) tiếp nhận và giới thiệu
cho các loại tế bào có thẩm quyền miễn dịch tơng ứng đó là Lympho-B hay/hoặc
Lympho-T. APC luôn luôn ở trong trạng thái hoạt động và tập thể Lympho-B/Lympho18


Bỏo cỏo tng kt

DC non tiếp
nhận kháng
nguyên (ẩm
bào và thực
bào)
tham
gia đáp ứng
miễn dịch

iDC2

DC trởng
thành trỡnh
diện kháng
nguyên
DC1

DC2

DC trởng thành (chín)
tham gia đáp ứng miễn dịch

DC1

DC2

DC trởng thành (chín)
tham gia đáp ứng miễn dịch

Hình B-3. Biệt hóa tế bào tua trong tham gia miễn dịch của vacxin ADN.