1

BỘ CÔNG THƯƠNG
VIỆN NGHIÊN CỨU DẦU VÀ CÂY CÓ DẦU BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG POLYMER ĐỂ SẢN XUẤT
CHẾ PHẨM VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM CHO
CÂY ĐẬU TƯƠNG VÀ CÂY LẠC MÃ SỐ ĐỀ TÀI: 227.10. RD/ HĐ-KHCN

CHỦ TRÌ THỰC HIỆN: Ths. TRẦN YÊN THẢO



BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG POLYMER ĐỂ SẢN XUẤT
CHẾ PHẨM VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM CHO
CÂY ĐẬU TƯƠNG VÀ CÂY LẠC Thực hiện theo Hợp đồng đặt hàng sản xuất và cung cấp dịch vụ
sự nghiệp công nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ
Số 227.10.RD/HĐ-KHCN ngày 16/03/2009 giữa
Bộ Công Thương và Viện Nghiên cứu Dầu và Cây có dầu Chủ trì thực hiện: ThS. Trần Yên Thảo

Tham gia thực hiện: Lê Thị Xuân Mai
Tô Thị Bích Loan
Nguyễn Văn Việt
Phạm Thị Sim
Phan Phạm Như Liên
Huỳnh Thị Trang Thuỳ


Lời nói đầu i
Mục lục ii
Danh mục các bảng iv
Danh mục các biểu đồ và đồ thị vi
Danh mục các hình vii
Tóm tắt đề tài viii
Mở đầu 1

Chương 1. Tổng quan tài liệu 3
1.1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 3
1.1.1. Các phương pháp bảo vệ vi khuẩn để sản xuất các dạng chế phẩm vi
khuẩn cố định đạm phổ biến 3
1.1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sống của vi khuẩn cố định đạm trên hạt
giống 5
1.1.3. Các đáp ứng sinh lý của tế bào đối với sự làm khô 7
1.1.4. Các phươ
ng pháp cải thiện sự sống của vi khuẩn cố định đạm trên hạt
giống 8
1.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước 10
Chương 2. Phương pháp nghiên cứu 12
2.1. Nghiên cứu chọn lựa các polymer thích hợp để sản xuất chế phẩm vi khuẩn
cố định đạm phục vụ canh tác cây đậu tương và cây lạc 12
2.1.1. Ảnh hưởng của loại và hàm lượng các polymer đến sinh trưởng của các
chủng vi khuẩn c
ố định đạm cho cây đậu tương và cây lạc 12
2.1.2. Ảnh hưởng của loại và hàm lượng các polymer đến tồn tại của các chủng
vi khuẩn cố định đạm trên hạt đậu tương và hạt lạc 12
2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự tồn tại của các chủng vi
khuẩn cố định đạm cho cây đậu tương và lạc 13
2.3. Nghiên cứu xây dựng qui trình công ngh

lượng chế phẩm vi khuẩn cố định đạm có sử dụng polymer cho cây đậu tương
và lạc 24
a. Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến mức độ tạp nhiễm của môi trường nhân
sinh khối 25
b. Thời gian nhân sinh khối sản xuất chế phẩm 25
c. Qui trình công nghệ sản xuất chế phẩm 26
d. Sản xuất thử và đánh giá chất lượng chế phẩm dịch thể bổ sung polymer cho
cây đậu tương và cây lạc 28
e. Chi phí sản xuất 29
3.3. Thử nghiệm ch
ế phẩm vi khuẩn cố định đạm có sử dụng polymer ở điều
kiện đồng ruộng đối với cây đậu tương và cây lạc 30
3.4. Đánh giá hiệu quả kinh tế của sản phẩm 33
Kết luận và kiến nghị 36

iv
Tài liệu tham khảo 37
Phụ lục 44

v
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến mức độ tạp nhiễm vi sinh vật
trong môi trường nhân sinh khối 26
Bảng 3.2. Số lượng và chất lượng của các mẻ sản xuất chế phẩm vi khuẩn cố
định đạm cho cây đậu tương và cây lạc- năm 2010 29
Bảng 3.3. Số lượng và chất lượng của các mẻ sản xuất chế phẩm vi khuẩn cố
định đạ
m cho cây đậu tương và cây lạc- năm 2011 29
Bảng 3.4. Chi phí sản xuất 30

vi
Bảng 3.18. Ảnh hưởng của PVP đến sự tồn tại trên hạt đậu tương của chủng vi
khuẩn VD-RS 1 (số lượng tế bào/hạt) 44
Bảng 3.19. Ảnh hưởng của PVA đến sự tồn tại trên hạt đậu tương của chủng vi
khuẩn VD-RS 1 (số lượng tế bào/hạt) 44
Bảng 3.20. Ảnh hưởng của Gum Arabic đến sự tồn tại trên hạt đậu tương của
chủng vi khuẩn VD-RS 1 (số lượng tế bào/hạt) 44
Bảng 3.21. Ảnh hưởng của Xanthan Gum đến sự tồn tại trên hạt đậu tương của
chủng vi khuẩn VD-RS 1 (số lượng tế bào/hạt) 45
Bảng 3.22. Ảnh hưởng của PVP đến sự tồn tại trên hạt lạc của chủng vi khuẩn
VD-RG 1 (số lượng tế bào/hạt) 45
Bảng 3.23. Ảnh hưởng của PVA đến sự tồ
n tại trên hạt lạc của chủng vi khuẩn
VD-RG 1 (số lượng tế bào/hạt) 45
Bảng 3.24. Ảnh hưởng của Gum Arabic đến sự tồn tại trên hạt lạc của chủng vi
khuẩn VD-RG 1 (số lượng tế bào/hạt) 45
Bảng 3.25. Ảnh hưởng của Xanthan Gum đến sự tồn tại trên hạt lạc của chủng
vi khuẩn VD-RG 1 (số lượng tế bào/hạt) 46
Bảng 3.26. Ảnh hưởng c
ủa loại polymer đến sự tồn tại của tế bào vi khuẩn cố
định đạm VD-RS 1 theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ phòng (số lượng tế
bào/ml) 46
Bảng 3.27. Ảnh hưởng của loại polymer đến sự tồn tại của tế bào vi khuẩn cố
định đạm VD-RS 1 theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ 5
o
C (số lượng tế bào/ml).46
Bảng 3.28. Ảnh hưởng của loại polymer đến sự tồn tại của tế bào vi khuẩn cố
định đạm VD-RS 1 theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ phòng (số lượng tế
bào/ml) 47
Bảng 3.29. Ảnh hưởng của loại polymer đến sự tồn tại của tế bào vi khuẩn cố

cây lạ
c 25

viii
DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1. Làm đất chuẩn bị thí nghiệm tại Đồng Tháp 49
Hình 2. Lấy mẫu nốt sần 49
Hình 3. Rễ đậu tương khi áp dụng phân bón N và khi sử dụng chế phẩm 49
Hình 4. Điểm thí nghiệm đậu tương tại Đồng Tháp 49
Hình 5. Năng suất quả đậu tương khi nhiễm chế phẩm và bón phân N 50
Hình 6. Cây lạc có nhiễm chế phẩm 50
Hình 7. Cây lạc không nhiễm chế phẩm 50
Hình 8. Chế phẩm vi khuẩn cố định
đạm có polymer 50
Hình 9. Bao bì hướng dẫn sử dụng sản phẩm 50
Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm cố định đạm 27


10 ha lạc với 15 hộ nông dân và một số điểm trình diễn tại tỉnh Đắc Nông. Kết
quả cho thấy lợi ích mang lại từ chế phẩm cao. Đối với cây đậu tương, năng
suất tăng từ 150 kg/ha đến 400 kg/ha, giảm sử dụng phân bón N 20-50 kg/ha,
thu nhập tăng thêm từ sử dụng chế phẩm trung bình là 4.320.000đ/ha; đối với
cây lạ
c, năng suất tăng 200-500 kg/ha, phân bón N tiết kiệm là 27-50 kgN/ha,
thu nhập tăng thêm trung bình là 9.100.000đ/ha.

1
MỞ ĐẦU
1. Cở sở pháp lý/xuất xứ của đề tài
- Cơ sở pháp lý: Hợp đồng số 227.10.RD/HĐ-KHCN “Đặt hàng sản xuất và
cung cấp dịch vụ sự nghiệp công nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ”
giữa Bộ Công thương và Viện Nghiên cứu Dầu và Cây có dầu.
2. Tính cấp thiết và mục tiêu của đề tài
N là một trong các yếu tố cần thiết nhất cho tăng trưởng và phát triển củ
a
cây trồng. Trong không khí có tới 80% N nhưng ở dạng N
2
nên cây trồng không
thể sử dụng được. Cây trồng chủ yếu sử dụng N ở dạng ion amonium (NH
4
)
hoặc dạng ion nitrat (N0
3
). Trong khi công nghiệp sản xuất phân bón bằng con
đường hoá học đòi hỏi nhiệt độ và áp suất rất cao thì trong tự nhiên một số vi
khuẩn có khả năng cố định N
2
trong không khí, cung cấp N trực tiếp cho cây.

2
Nội dung 4: Thử nghiệm chế phẩm vi khuẩn cố định đạm có sử dụng polymer ở
điều kiện đồng ruộng đối với cây đậu tương và cây lạc

3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài
1.1.1 Các phương pháp bảo vệ vi khuẩn để sản xuất các dạng chế phẩm vi
khuẩn cố định đạm phổ biến
Bảo vệ bằng agar: đây là dạng chế phẩm thương mại đầu tiên, sản xuất bởi
công ty Nitragin Co., Milwaukee, USA, dựa vào phát minh về cố định đạm sinh
học của Hellriegel và Wilfarth vào năm 1886. Loại chế phẩm này đầu tiên
được sản xuất trên gelatin, sau
đó trên agar hoặc trên môi trường dinh dưỡng.
Sản phẩm là sinh khối trên bề mặt agar, dịch sinh khối sau đó được nhiễm trực
tiếp vào hạt và đem gieo. Phương pháp này rất thuận lợi. Tuy nhiên một trở
ngại quan trọng nhất của phương pháp này là tốc độ chết rất cao khi hạt bị khô
ngay lập tức sau khi vi khuẩn nhiễm lên hạt (Brockwell, 1982).
Bảo vệ bằng đông khô: Đông khô là phương pháp dùng phổ biế
n để bảo quản
giống vi sinh vật nhưng lần đầu tiên nó được ứng dụng thương mại sản xuất
chế phẩm đông khô bởi một công ty của Úc trong một thời gian ngắn trong năm
1958. (Brockwell, 1982). McLeod và Roughley (1961) nhận thấy chế phẩm này
tạo nốt sần tốt trong điều kiện đồng ruộng nhưng dường như chỉ giới hạn trong
các điều kiện thu
ận lợi mà thôi, bởi vì sự tồn tại trên hạt của dạng chế phẩm này
kém (Vincent, 1965). Kremer và Peterson (1982) báo cáo rằng khi sử dụng dầu
lạc và đậu tương thì sẽ cải thiện được sự tồn tại trên hạt của tế bào. Công bố
của nghiên cứu này là các tế bào rhizobium sẽ được bảo vệ, đặc biệt trong điều
kiện nhiệt độ cao, khi pha chế phẩm đông khô với dầu.

cũng được sử dụng thường xuyên hơn cả trong sản xuất chế phẩm. Nhiều
nghiên cứu cho thấy than bùn giúp bảo vệ tế bào tốt hơn trong sản phẩm và trên
hạt so với các chất mang rắn khác bởi vì chúng giàu chất hữu cơ và khoáng chất
(Somasegaran và Hoben, 1994). Chất mang than bùn cũng phù hợ
p cho sản
xuất bởi vì chế phẩm đạt thời gian bảo quản 6 tháng (Roughley và Vincent,
1967). Thành phần lý hoá học của than bùn chất lượng tốt dùng cho sản xuất
thương mại được trình bày trong bảng 1 và 2.
Bảng 1.1 Đặc trưng của than bùn dùng trong sản xuất thương mại tại Mỹ
Loại Lượng Phân tích tro (%)
N tổng (%) 1,62 K 1,12
Chất hữu cơ (%) 86,80 P 0,33
Tro (%) 13,20 Ca 5,21
K trao đổi K (ppm) 62,00 Mg 1,14
N dạng NH4 và NO3 (ppm) 94,00 Fe 2,10
P dễ tiêu (ppm) 12,00 Si 28,00
pH 4,5 -5,0 Al 6,32
Ẩm độ (%) 7 – 8 Na 0,52
Burton (1979)
Bảng 1.2 Đặc trưng than bùn dùng cho sản xuất thương mại tại Úc
Đặc trưng Khoảng Giá trị trung bình
Chất hữu cơ (%) 28,8 – 75,4 64,3
Chất hữu cơ C (%) 16,4 – 42,1 36,1
Khoáng chất (%) 10,0 – 16,0 12,1
Muối hoà tan (%) 0,09 – 1,50 0,87
Cl (%) 0,01 – 0,31 0,11
N (%) 0,89 – 2,30 1,83
K
2
O (%) 0,12 – 0,17 -

là pha loãng và tưới trực tiếp vào luống gieo hạt. Singgleton và cộng sự (2002)
nghiên cứu bổ sung vào chế phẩm một số hợp chất hoá học để tăng số lượng tế
bào sống trên hạt sau khi nhiễm và phát triển chế phẩm vi khuẩn cố định đạm
cho cây đậu tương. Nghiên c
ứu này đề cập đến polyvinylpyrrolidone (PVP),
FeEDTA và glycerol. Tuy nhiên sự tồn tại của tế bào trên hạt từ các công thức
dịch thể được bảo quản theo thời gian thì giảm so với than bùn (Alabraeda et al.
2008).
1.1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sống của vi khuẩn cố định đạm trên hạt
giống
Chế phẩm chứa vi khuẩn cố định đạm có thể được dùng bằng cách nhiễm lên
hạt hoặc bón vào
đất. Chế phẩm có thể được sử dụng bằng cách nhiễm lên hạt
ngay trước khi gieo hoặc được phủ bao bọc hạt trong vòng 1 tuần trước khi
gieo. Hạt đậu cũng có thể được nhiễm và bảo quản trước khi bán như một sản
phẩm thương mại. Sản phẩm này gọi là hạt giống nhiễm chế phẩm (pre-
inoculated seed). Chế phẩm cũng được sử dụng theo cách nhiễ
m vi khuẩn vào
trong đất sử dụng chế phẩm than bùn pha trong nước hoặc là sử dụng chế phẩm
dạng dịch thể hay là dạng hạt. Cả hai kỹ thuật nhiễm đều có ưu điểm và khuyết
điểm. Lựa chọn phương pháp nào thì phụ thuộc vào thiết bị, kích cỡ hạt, tính
mỏng manh của mầm hạt. Nghiên cứu hiện tại tập trung vào việc tối ưu hoá các
k
ỹ thuật này để cải thiện sự tồn tại của vi khuẩn và dẫn đến tăng hiệu quả cố
định đạm (Deaker, 2004).
Khi chế phẩm nhiễm lên hạt thì sự chết đi của tế bào rhizobium của tất cả
các giống xảy ra rất nhanh chóng, đặc biệt là khi các điều kiện môi trường

6
không thuận lợi. (Bowen và Kenedy, 1959; Marshall, 1964; Diatloff, 1967;

.
Tương tự như vậy, Hume và Blair (1992) báo cáo năng suất đậu tương tăng 15-
25% khi tăng liều lượng nhiễm trên hạt từ log
10
5,0 đến 6,0. Tăng số lượng tế
bào trên hạt sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến sự hình thành nốt sần và do đó tăng
năng suất cây. Tất cả các kết quả này chỉ ra rằng cần thiết tăng số lượng tế
bào/hạt.
Sự chết của tế bào trên hạt thông thường diễn ra ở tất cả quá trình nhiễm và
có 3 nguồn ảnh hưởng: sự làm khô (desiccation), bả
n chất độc tố của hạt và
nhiệt độ bảo quản không thuận lợi (Vincent el al. 1962; Date, 1968; Taylor and
Lloyd, 1968; Thompson et al., 1975).
Sự làm khô là yếu tố chính xác định sự tồn tại kém trên hạt của các tế bào
(Vincent et al,, 1962; Thompson, 1988). Nghiên cứu về sự tồn tại của R.
leguminosarum bv. Trifolii trên hạt thuỷ tinh ở điều kiện khô chỉ ra rằng quá
trình tế bào giảm đi trên hạt xảy ra ở 2 có hai giai đoạn (Vicent el al., 1962).
Giai đoạ
n đầu là số lượng tế bào trên hạt giảm đi một cách nhanh chóng trong
khoảng thời gian 0 và 24 h đồng thời với sự mất nước nhanh chóng thì giai
đoạn tiếp theo là sự mất nước và số lượng tế bào chết đi giảm. Tế bào tồn tại tốt
nhất trên hạt khi ẩm độ tương đối 100% và không phát hiện tế bào sống trên hạt
khi ẩm độ thấp hơn 60% sau khi nhiễm 27 giờ. Các nghiên cứ
u khác chỉ ra rằng
sự thích nghi với sự làm khô (desication) thay đổi tuỳ thuộc các chủng rhizobia
khác nhasu. Các chủng tăng trưởng chậm thì tồn tại tốt hơn trên hạt so với các
chủng tăng trưởng nhanh. Mary et al. (1994) quan sát sự tồn tại tốt hơn trên tế
bào của Sinorhizobium trong suốt quá trình bảo quản ở điều kiện ẩm độ tương
đối từ 22% đến 67% so với từ 3% đến 83,5%. Kiểu ảnh h
ưởng cũng tương tự

glutamate, glutamine, proline, quaternary amines (glycine bataine) và các loại
đường trehalose, sucrose và glucosylglycerol. Các chất hoà tan giúp duy trì
tính ổn định protein trong suốt quá trình chịu áp lực thẩm thấu (Potts, 1994).
Trehalose: Trehalose tích luỹ trong các vi khuẩn bị áp lực thẩm thấu (Lesli et
al., 1995; Potts, 1994) và đặc biệt là đối với rhizobia (Breedveld et al., 1993;
Streeter, 2003). Trehalose bảo vệ tế bào chống lại sự làm khô bằng cách duy trì
sự nguyên vẹn củ
a màng tế bào trong quá trình làm khô và sau đó làm ướt
(Leslie et al., 1994, 1995) và sự hiện diện của trehalose có thể giải thích cho sự
tăng tính tồn tại của tế bào đối với sự làm khô trong suốt phase ổn định và khi
tế bào đối mặt với muối NaCl. Gouffi et al. (1998, 1999, 2000) tìm thấy rằng
trehalose và succrose không không tích luỹ trong môi trường nhưng nó tổng
hợp mới trong trong phase tăng trưởng sớm của vi khuẩn. Nghiên cứu của
Streeter J.G (2003) về ảnh hưởng của trehalose đối với s
ự tồn tại của
Bradyrhizobium japonicum trong suốt quá trình làm khô cho thấy trehaolose khi
được bổ sung vào môi trường tại thời điểm làm khô thì sự sống sót của tế bào
được cải thiện nhưng thấp trong lúc khi nó được bổ sung vào quá trình sinh

8
trưởng thì khả năng chống chịu với sự làm khô tăng lên rất nhiều. Nghiên cứu
của Gaber Zayed (2003) đối với Lactobacillus salivarus cho thấy trehalose
cũng làm tăng khả năng sống sót của vi khuẩn này khi đối mặt với quá trình
đông khô và tác giả này cho rằng khả năng chuyển hoá trehalose bởi vi khuẩn
này thì không liên quan đến khả năng kháng lại với quá trình làm khô mà có thể
liên quan đến một cơ chế khác. Có sự tương quan chặt chẽ gi
ữa lượng trehalose
của tế bào Bradyrhizobium với sự sống sót của chúng trên hạt đậu tương
(Streeter J.G, 2007). Nghiên cứu này cho thấy một số yếu tố ảnh hưởng đến sự
tồn tại của Bradyrhizobium trên hạt cần quan tâm là các chủng khác nhau, nồng

Đường, amino acid và hợp chấ
t rượu đường
Trong các nghiên cứu ban đầu về các vi khuẩn đông khô, bản chất của môi
trường huyền phù đã được xác nhận nó như là một sự trợ giúp quan trọng cho tế
bào tồn tại (Heller, 1941; Annear, 1956, 1962; Vincent, 1958). Các nghiên cứu
mở rộng hơn nữa sử dụng các chất dinh dưỡng của vi khuẩn như là tác nhân gây
huyền phù cho quá trình đông khô và bảo quản tế bào (Heller, 1941; Appleman

9
và Sears, 1944; Annear, 1956, 1962; Redway and Lapage, 1974; Dye,1982).
Heller (1941) khảo sát các ảnh hưởng bảo vệ của các hợp chất kết tinh và các
chất keo trong quá trình khô của Streptococcus pyogenes C203 and Escherichia
coli. Sucrose là một tác nhân huyền phù tốt hơn so với glucose, xylose,
tryptophane, salicin, saline và nước đối với cả hai giống. Heller kết luận rằng sự
tồn tại thì liên quan đấn tính đồng hoá và hoà tan của hợp chất này. Hơn nữa,
Vincent (1958) báo cáo rằng 24–44% tế bào tồn tại khi tạo huyền phù tế bào
trong dung dịch sucrose 10% trong khi đó chỉ có 1% t
ế bào tồn tại khi tạo
huyền phù với nước. Sucrose là tác nhân tạo huyền phù tốt hơn sorbitol,
mannitol, lysine, amino acid mixtures, sữa và, dịch cao nấm men và manitol. Sự
tồn tại kém của tế bào rhizobia trên hạt và hạt thuỷ tinh đã được cải thiện bằng
cách bổ sung sucrose. McLeod và Roughley (1961) tìm ra rằng kết hợp 10%
sucrose và dịch cao nấm men và manitol tăng tồn tại của tế bào trên hạt thuỷ
tinh so với đối chứng không có dịch này. Vincent et al. (1962) chỉ ra rằng tồn
tại của dịch thể lỏng R. leguminosarum bv. trifolii trên hạt thuỷ tinh thì cao hơn
nhiều sau khi tạo huyền phù với maltose so với các đường khác, sorbitol và
sodium chloride.
Các polymer
Các polymer tự nhiên như là gum arabic đã được sử dụng như là các chất
bám dính trong áp dụng các chế phẩm nhiễm cho cây họ đậu trong nông nghiệp.

với các chủng Rhizobium xác định cần được chọn lọc.
1.2. Tình hình nghiên c
ứu trong nước
Nhà nước ta rất quan tâm đẩy mạnh các nghiên cứu, ứng dụng và phát triển
công nghiệp hóa, hiện đại hóa nông nghiệp và nông thôn, đặc biệt chú trọng đến
phát triển công nghệ sinh học phục vụ sản xuất nông nghiệp. Bộ Khoa học và
Công nghệ đã ban hành quyết định số 2025/QĐ-BKHCN vào ngày 13 tháng 9
năm 2006 về việc phê chuẩn về mục tiêu, nội dung và các dự kiến sản phẩm của
Chương trình Khoa họ
c và Công nghệ trọng điểm cấp nhà nước giai đoạn 2006-
2010: “Nghiên cứu, ứng dụng và phát triểnc
c
ô
ô
n
n
g
gn
n
g
g
h
h
ệ

n
g
g
h
h
i
i
ệ
ệ
p
ph
h
ó
ó
a
a
,
,h
h
i
i
ệ
ệ
n

n
g
g
h
h
i
i
ệ
ệ
p
pv
v
à
àn
n
ô
ô
n
n
g
gt

học, tăng năng suất cho cây.
Tuy nhiên, tất cả diện tích gieo trồng hiện tại không áp dụng lợi ích của cố
định đạm sinh học thông qua áp dụng chế phẩm Rhizobium mà bón phân N hoá
học, với liều lượng trung bình từ 25-80 kgN/ha (Trần Yên Thảo, 2010). Thay
thế phân bón N bằng chế phẩm vi sinh sẽ tiết kiệm cho nông dân Việt nam 100-

11
200 triệu đô la hàng năm, và cùng lúc sẽ thúc đẩy mở rộng sản xuất cây họ đậu
và tác động có lợi đối với môi trường.
Các thí nghiệm về sử dụng chế phẩm vi khuẩn cố định đạm cho đậu tương
thực hiện từ năm 1976 đến 2001 tại Miền Nam cho thấy đậu tương phản ứng tốt
với việc nhiễm chế phẩm thông qua tăng năng su
ất. Trung bình năng suất tăng
38% (59% tại Đồng bằng sông Cửu long, 16% tại Đông Nam bộ). Trong hầu
hết các điểm, phân bón N tiết kiệm được là 40-60kgN/ha (Trần Yên Thảo,
2004). Tương tự đối với lạc, năng suất quả tăng 13.8-17.5% ở Miền Bắc (Ngô
Thế Dân và cs, 2000). Hiệu quả kinh tế đã được tổng kết chi tiết trong báo cáo
dự án LWR2/98/27. Trong 23 thí nghiệm ở Miền nam, lợi ích kinh tế mang lại
là tăng lợi nhuận lên đến 760 đô la Úc/ha (trung bình tăng hơn 100 đô la Úc/ha)
do tăng năng suất và giảm sử dụng phân bón N hóa học. Chế phẩm vi sinh này
đã tăng năng suất hạt lạc trồng trên đất chua Đồng bằng Sông Cửu Long trung
bình là 42% so với không bón phân N và 28% so với bón phân N. Đối với 13
thí nghiệm của đậu tương năng suất tăng trung bình là 19% so với không bón
phân N, và năng suất tăng 40-50% trong một số thí nghiệm. Mức độ l
ợi ích kinh
tế thì thay đổi phụ thuộc vào loại cây, vùng đất và lịch sử trồng trọt. Không có
trường hợp nào giảm năng suất khi thay phân đạm khoáng N bằng chế phẩm vi
sinh cố định đạm.
Kết quả các mô hình trình diễn đồng ruộng sử dụng các chế
phẩm vi khuẩn cố định đạm cho cây đậu tương và lạc từ năm 2007 đến 2010 tại

thái trồng
đậu tương và lạc trong nước, và được đề xuất như là các chủng quốc
gia, áp dụng cho sản xuất chế phẩm ở phạm vi cả nước (Dự án AusAID CARD,
2007-2010).
Polymer:
Các plymer sử dụng bao gồm các polymer tự nhiên (Gum Arabic,
Xanthan Gum) và các polymer tổng hợp (polyvinyl pyrrolydine-PVP,
polyvinylalcohol-PVA). Các polymer này được cung cấp bởi Trường Đại học
Sydney, Úc. Gum Arabic va Xanthan Gum là sản phẩm của Merck; PVA và
PVP của Nippon Gohsei.
Phương pháp nghiên cứu dưới đây được trình bày theo thứ tự nôi dung
của đề
tài.
2.1. Phương pháp nghiên cứu lựa chọn các polymer thích hợp để sản xuất
chế phẩm vi khuẩn cố định đạm
2.1.1. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của loại và hàm lượng các
polymer đến sinh trưởng của các chủng vi khuẩn cố định đạm cho cây đậu
tương và cây lạc
- Nghiệm thức thí nghiệm:
* Loại polymer: 4 loại polymer khác nhau polyvinyl pyrrolydine-PVP,
polyvinylalcohol-PVA, Xanthan Gum và Gum Arabic
* Nồng độ polymer:
+ PVP: 1%, 2%, 3%, 4%
+ PVA: 0,1%, 0,5%, 1% , 2%
+ Gum Arabic: 0,1%, 0,5%, 1%, 1,5%
+ Xanthan Gum: 0,1%, 0,2%, 0,5%, 1%
* Giống vi sinh vật:
+ Rhizobium cho cây
đậu tương: VD-RS 1
+ Rhizobium cho cây lạc: VD-RG 1

(5
o
C). Theo dõi số lượng tế bào vi khuẩn của 2 chủng này theo thời gian tại 1,
7, 14, 21, 28 ngày và 2, 3 tháng. Đối chứng là chế phẩm trên nền chất mang
than bùn. Phương pháp xác định số lượng Rhizobium là phương pháp xác định
khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường YEM có bổ sung chỉ thị màu Congo Red.
2.3. Phương pháp xây dựng qui trình công nghệ, sản xuất và đánh giá chất
lượng chế phẩm vi khuẩn cố định đạm có sử dụng polymer cho cây đậu
tươ
ng và lạc.
Dựa trên cơ sở đã có qui trình công nghệ sản xuất chế phẩm vi khuẩn cố
định đạm trên nền chất mang rắn là than bùn, trong nôi dung nghiên cứu này
các thí nghiệm được thực hiện theo qui trình đó và qui mô thực hiện nghiên cứu
là 5 lít chế phẩm/mẻ. Qui trình chung bao gồm:
- Sản xuất giống: bao gồm hoạt hoá giống, nhân giống
- Chuẩn bị môi trường nhân sinh khối
- Tạo sản phẩm
- Kiểm tra chất l
ượng sản phẩm

14
2.3.1. Phương pháp xác định ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến mức độ
tạp nhiễm của môi trường nhân sinh khối
- Nghiệm thức thí nghiệm:
+ Khử trùng 1 lần:
• Thời gian khử trùng 30 phút
• Thời gian khử trùng 60 phút
• Thời gian khử trùng 90 phút
+ Khử trùng 2 lần:
• Thời gian khử trùng 30 phút

Phương pháp xác định hiệu quả cố định đạm của chế phẩm dựa vào
nguyên tắc là nhiễm chế ph
ẩm vào hạt, thực hiện trồng cây trong điều kiện
đồng ruộng. Xác định và so sánh nốt sần, sinh khối và năng suất giữa các
nghiệm thức không nhiễm và nhiễm chế phẩm. Phương pháp thực hiện trong