1
BỘ CÔNG THƯƠNG
VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
––––––––––––––––––––––––––––––– BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI R-D CẤP BỘ
Tên đề tài:
“NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PULLULAN TRONG
SẢN XUẤT BÁNH KẸO VÀ BẢO QUẢN THỊT”

Chủ nhiệm Đề tài: NGÔ THỊ VÂN

khụng khớ thm qua, có thể so sánh với polypropulen, polyeste, polyvinyl
[4,17,18]
Chớnh vỡ các đặc tính trên nên pullulan c ng dng rng rói trong cỏc
ngnh cụng nghip nh: cụng nghip thc phm, cụng nghip dc, mỹ phẩm
v cỏc ngnh cụng nghip khỏc( Desh et al., 1992). Trong cụng nghip thc
phm, pullulan c s dng để tăng độ bóng, giữ màu sắc, nâng cao chất
lợng của sản phẩm kẹo, lm tng nht, độ dính cho ung, kem, xỳc
xớch Mng pullulan cú kh nng ngn khụng cho khụng khớ thm qua nờn
c s dng bao gúi, phủ bên ngoài cho cỏc s
n phm thc phm chống
oxy hoá nhất là các sản phẩm có dầu và tăng cờng khả năng chống mất màu
của sản phẩm. Ngoi ra, pullulan c s dng l thc phm chc nng (thc
phm ớt calo). Trong cụng ngh dc phm, y hc, pullulan c s dng
lm v nang thuc tân dợc, lm cht gi cõn bng ỏp sut trong mỏu Trong
cụng ngh m phm, với khả năng kết dính cao pullulan đợc ứng dụng trong
sản xuất dầu gội đầu, làm chất tạo sợi, tạo bọt và độ nhớt thấp giúp cho dịch dễ
thấm sâu vào da, tóc. Trong cỏc ngnh cụng nghip khỏc nh cụng nghip dt
thỡ nú l tỏc nhõn h vi.
Với khả năng tạo màng mỏng trong suốt, ngăn oxy pullulan đang đựơc
chú ý nh một nguồn nguyên liệu mới thay thế một phần bao bì polyethylen
nhằm giải quyết vấn đề ô nhiễm môi tr
ờng bức bách hiện nay.

4
Hiện nay pullulan c nghiên cứu và sn xut trờn quy mụ cụng nghip
rt nhiu nc trờn th gii nh Nht Bn, Trung Quc, Th Nh K Các
Công ty lớn sản xuất pullulan là Công ty Hayashibare Biochemical Osaka
Nhật bản với sản phẩm pullulan PI20 ứng dụng nhiều trong ngành thực phẩm,
dợc phẩm. Các công ty Ayurvedic Remedie Holistic, công ty Feinkost
ingredient, công ty Dow Chemical, Sumitomo Chemical sản xuất ra pullulan

1961 pullulan đợc nghiên cứu và xem xét cấu trúc phân tử. Sau khi phát hiện
một enzim pullulanase có thể thuỷ phân liên kết alpha 1,6 glucozit để chuyển
pullulan thành maltotrioza thì cấu trúc pullulan càng đợc làm sáng tỏ [4,5,6,9]
Hiện nay theo hệ thống số quốc tế (INS), mã số pullulan là E 1204 .
Trong sản phẩm thơng mại PI 20 một sản phẩm pullulan đã deion tồn tại 1250
đơn vị glucoza. Trên thế giới, Cụng ty Hayshibara Co.ltd, Nhật bản sn xut
pullulan trờn quy mụ cụng nghip t nm 1972 vi sn lng 1000 tn/ nm và
Công ty Shanghai Puao BioTech Co.Ltd -Trung quốc đang sản xuất pullulan
trên quy mô công nghiệp [17]
1.4.2. Cấu tạo và cấu trúc của pullulan

Pullulan l mt polysaccharit c to b
i ch yu cỏc n v
maltotrioza v mt phn nh cỏc n v maltotetraoza theo liờn kt - 1,6
glucozit. Cỏc n v ny c cu to t cỏc glucoza theo liờn kt - 1,4
glucozit. Pullulan có công thức hoá học (C
6
H
10
O
5
)
n
. Pullulan c sn xut t
tinh bt thụng qua quỏ trỡnh lờn men từ chng Aureobasidium pullulans.

6
Hỡnh 1.2. Cu trỳc n gin ca pullulan [5]
Bng phơng pháp thu phõn hon ton ca enzim pullulanaza enzim
c hiu tỏc ng lờn liờn kt - 1,6 glucozit cho thấy cu trỳc polymaltotrioza
trờn (hỡnh 1.2) có chút thay i sau khi tỡm thy maltotetraoza, nhng n v
tetrasaccharit ny xut hin ở cui phõn t pullulan. Sau ny ngi ta xỏc nh
c nhng n v ny l maltotetraoza v nú khụng ch xut hin cui chui
m nú c phõn b mt cỏch ngu nhiờn trờn phõn t polymaltotrioza. T
l
ny cú th lờn ti 7%.[10,9,15]
Cu trỳc pullulan ó c ch ra hỡnh 1.1 cho đến nay vẫn c chp
nhn mt cỏch rng rói. Tuy nhiên trong cu trỳc phân tử của pullulan vn cú
nhiu s thay i, đú l kh nng phõn nhỏnh (nhng khụng ỏng k).
Bouveng v cỏc cng s [10] cho rằng không loi kh nng cú liờn kt - 1,3
glucozit trong phõn t (1%- 2%). Bi vỡ, ụng ó tỡm thy glucoza khụng b
oxyhoỏ cũn li sau s ụxyhoỏ tun hon. Tác giả Elinov v Mateeva [15] c
ng
cho thy cú liờn kt - 1,3 glucozit nhng mc cao hn 7%. Do vy ó cú
nhiu ý kin khỏc nhau v cu trỳc mch thng trong ú cú liờn kt - 1,3
glucozit vi - 1,4 glucozit vi di khỏc nhau ó nh hng trc tip lờn
liờn kt - 1,6 glucozit.
Bng cỏch kt ta vi cetyl trimetylamoni hydroxit, Bouveng v cỏc
cng s [10,15] ó tỏch c c -glucan v cỏc axit polysaccharit d hỡnh cha

hơn.[17,12]
9
1.4.4. TNH chất của PULLULAN
Pullulan có những tính chất rất u việt nh : bột màu trắng, không mùi,
không vị , không hút ẩm, chứa 6% ẩm, không có tính khử. Pullulan bị phá huỷ ở
nhiệt độ cao 250 280
0
C. Pullulan hoà tan trong nớc lạnh và nớc nóng,
không hoà tan trong dung môi hữu cơ trừ dimethylformaldehide và
dimethylsulfoxide( Sugimoot, 1978; Tsujiaka và Misuhashi, 1993).Dung dịch
pullulan nhớt nhng không tạo gel và ổn định. Độ nhớt của pullulan phụ thuộc
vào khối lợng phân tử của pullulan. Độ nhớt dung dịch nồng độ 10% ở 30
0
C
là 132-179mm
2
/s, độ nhớt của pullulan tơng tự với dung dịch gum arabis.
Pullulan luôn có khả năng hình thành một màng film trong suốt.
Dung dch pullulan cú sc cng b mt cao và độ n nh tốt, chịu pH
rộng t 2-12, nht ca nú khụng thay i khi cú mt ca cỏc ion kim loi
khỏc nhau cú trong dung dch. Với khả năng dính kết cao nên có thể nén trực
tiếp dới nhiệt có ẩm.
Pullulan cú th to thnh nhng loi vt liu cú hỡnh dng khỏc nhau.
Pullulan c to thnh mng cú tớnh cht ngn nga, khụng cho khụng khớ
thm qua.
Sản phẩm thơng mại của hãng Hayshibara Co.ltd có thành phần nh
sau:

Dung dịch pullulan không màu, không mùi có thể tạo lớp áo bóng, đẹp,
bền màu cho sản phẩm. Cấu trúc phân tử của pullulan là maltotrioza liên kết với
nhau nên pullulan rất khó bị phân huỷ bởi enzim vì thế nó cung cấp calo một
cách từ từ khi vào cơ thể ngời. Pullulan
c s dng l thc phm chc nng
(thc phm ít calo).
Năm 2003 tác giả Bryan W. Wolf , Keith A. Garlel, Young
S. Choe đã có bài báo trên tạp chí dinh dỡng của Mỹ về pullulan tiêu hoá chậm
trong cơ thể ngời. Thí nghiệm đợc đánh giá qua một đêm của ngời sử dụng
đồ uống chứa 50 g cacbonhyđrat là maltodextrin và 50 gam pullulan, tiêu chí
phân tích là nồng độ hyđrogen trong hơi thở và nồng độ glucoza trong máu. So
với mẫu đối chứng peak glucoza trong máu là giảm đi rõ rệt của ngời sử dụng
pullulan là 1,97+- 0,1mmol/lít, còn ngời sử dụng maltodextrin là 4.24mmol/lít.
Điều đó cho thấy pullulan tiêu hoá chậm không làm tăng glucoza trong máu khi
ăn, calo ít. [8,15,16]
Khả năng kết dính của pullulan cao nên nó đợc dùng nhiều để giữ hình
dạng khác nhau của các viên thịt, cá trong chế biến đồ hộp, thức ăn nhanh.

11
Pullulan còn đợc sử dụng trong sản xuất đồ uống, cream, nớc sốt để làm tăng
độ nhớt của sản phẩm. Pullulan còn ức chế sự phát triển của nấm. Vì vậy nó là
nguyên liệu tuyệt vời cho bảo quản thực phẩm. Nhật bản đã có lịch sử hơn 20
năm sử dụng pullulan nh một thành phần thực phẩm và tác nhân kết dính của
thuốc [17]

Một sn phm tht, xỳc xớch có ứng dụng pullulan[17]
1.4.5.2.Trong công nghiệp dợc phẩm:
Pullulan đợc sử dụng bao viên giảm sự va đập làm vỡ viên, bột pullulan
đợc sử dụng làm chất kết dính, làm sệt, bóng. Với tớnh cht chng oxy tuyt
vi nú lm tng thi hn s dng cho sn phm.
Pullulan đợc sử dụng để tạo capsule vỏ nang dùng để đóng viên các
loại thuốc tân dợc trong sản xuất thuốc, đặc biệt trong sản xuất các vitamin C,
E, D Vỏ nang từ pullulan có u điểm hơn so với loại truyền thống nh tăng
cờng tính năng chống ẩm, hoà tan dễ dàng, gia tăng tính độ ổn định chất
lợng trong thời gian lu hành, ngăn chăn oxy. Thuốc tân dợc truyền thống
thờng đợc đóng trong viên nang gelatin có nguồn gốc động vật, có thể gây
khó khăn tiên hoá đối với một số ngời ăn kiêng. Ngoài ra đối với những ngời
tu hành điều đó đồng nghĩa với việc vi phạm giáo lý nhà phật. Chính vì vậy
ngời ta sử dụng pullulan trong sản xuất vỏ nang có thể đáp ứng cho tất cả mọi
đối tợng. Gần đây khách hàng quan tâm đến sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên
không chỉ ở Mỹ, Nhật mà ở các vùng miền trên thế giới, đặc biệt những nơi có
văn hoá tín ngỡng sử dụng nguyên liệu từ thực vật. [12,15,17,18]

13
Pullulan c dựng duy trỡ cõn bng ỏp sut thm thu trong mỏu v
mụ t bo v cú th lm tng cung cp huyt tng. Pullulan c s dng nh
l huyt tng m rng (plasma extender), to ra nhng tác dụng mong mun.
Pullulan cú phõn t lng 3000 9000 hoà tan trong dung dch mui sinh lớ
to ra dung dch pullulan 4-10% wt/vol, sau ú em tit trựng, dung dch ny

ng dng pullulan trong cụng nghip dc phm [17]

Hiện cũng có rất nhiều nghiên cứu sử dụng pullulan trong sản xuất sản
phẩm vệ sinh răng miệng,thấu kính, màng plasma Nh Công ty Pfizer
NewYork Mỹ nổi tiếng với trong các sản phẩm vệ sinh răng miệng đang sử
dụng pullulan bột. Sản phẩm bảo vệ răng miệng của Pfizer ở Canada nh
Listerine, sản phẩm này phát triển rộng khắp thế giới. Trong thành phần nớc
xúc miệng Listerine có: Pullulan, Methol, Flavors, Sucralose, Potassium
acesulfate, Carragenan, Glyceryl Oleate, Eucalyptol, Xanthan Gum( Listerrine
professional)
1.4.5.3. Trong công nghiệp mỹ phẩm
Với khả năng kết dính cao pullulan đợc ứng dụng trong sản xuất dầu gội
đầu. Pullulan có tác dụng tạo sợi, tạo bọt và độ nhớt thấp giúp cho dịch dễ thấm
sâu vào da, tóc. Ngoài ra pullulan đợc ứng dụng vào các sn phm son mụi,
kem dng da, kem chống nhăn dng lng nhằm giỳp n nh, gi m, tng
gel .
Trong các sản phẩm dỡng da, phấn trang điểm, mỹ phẩm mắt, dầu gội
đầu, ngời ta sử dụng pullulan có khối lợng phân tử 5000- 500.000 daton và tỉ
lệ pullulan bổ sung từ 0,1- 99 %, tuỳ theo từng sản phẩm. Khi sử dụng pullulan
trong các sản phẩm mỹ phẩm có u điểm nh dễ tan trong nớc, ổn định trong
thời gian dài[12,17]

15
Pullulan có trong thành phần mỹ phẩm Keshin gaku: ethylalcoho 10

Màng pullulan đợc ví nh cái hàng rào ngăn oxy có thể kéo dài thời gian bảo
quản thịt chín hoặc túi đựng thực phẩm chín khô tránh oxy hoá tăng thời gian
bảo quản phần nào hạn chế sử dụng hoá chất bảo quản.
Tiến hành chuẩn bị thịt lợn chín trong các dụng cụ đựng thuỷ tinh hoặc
nhựa, sau đó dùng màng pullulan phủ kín , theo dõi bảo quản
Tiến hành chuẩn bị ruốc thịt đóng gói trong màng pullulan trên máy dán
kín , theo dõi bảo quản.
2.1.2. Phơng pháp phân tích
2.1.2.1.Xác định nồng độ chất khô bằng chiết quang kế
Chiết quang kế là một dụng cụ quang học dựa trên sự khúc xạ khác nhau
trong môi trờng có nồng độ chất tan khác nhau. Dịch đem đo cần trong suốt, ở
20
o
C để đảm bảo chính xác.

17
Tiến hành đo: dung dịch cần đo làm nguội tới 20
o
C rồi lấy một giọt cho
lên bề mặt của chiết quang kế. Đậy nắp kính lại, điều chỉnh sao cho đọc rõ kết
quả trên chiết quang kế, ta ghi lại kết quả đó chính là nồng độ phần trăm chất
khô.
2.1.2.2. Phơng pháp xác định độ nhớt của dịch pullulan
Chuẩn bị dung dịch pullulan làm nguội đến 30
o
C rồi đem đo độ nhớt bằng
dụng cụ đo độ nhớt.
Phơng pháp đo: hút 2ml dịch cho vào dụng cụ đo độ nhớt. Dùng quả bóp
đẩy dịch lên trên vạch đo thứ nhất đợi dịch chảy đến vạch đo ta bắt đầu bấm giờ
tính thời gian cho đến khi dịch chảy đến vạch đo thứ hai. Ghi lại thời gian này,

: thời gian chảy của 2ml dịch (giây)
t
o
: thời gian chảy của 2ml nớc (giây)
2.1.2.3. Xỏc nh pH bng mỏy o pH meter
2.1.2.4. Phơng pháp xác định đờng khử bằng Lane - Eynon
Cơ sơ phơng pháp.
Dùng hai dung dịch chính là Sunfat đồng (CuS0
4
) và Tatrat kép
(KNaC
4
H
4
O
6
) trong môi trờng kiềm, tác dụng với dung dịch đờng khử (có
gốc CHO) tạo ra Cu
2
O.

18
CuSO
4
+ 2NaOH = Cu(OH)
2
+ Na
2
SO
4

Tiến hành.
- Kẹo đợc hoà tan trong nớc và pha loãng dịch đờng đến nồng độ xấp xỉ
1%.
- Chuẩn bị các bình tam giác 250ml. Hút vào mỗi bình 5ml dung dịch Fehling
A và 5ml dung dịch Fehling B.
- Dung dịch đã chuẩn bị ở trên cho vào buret 50ml. Cho trớc vào mỗi bình
tam giác khoảng 13-15ml dịch đờng.
- Cho bình tam giác lên bếp điện. Bắt đầu sôi để 2 phút, sau đó nhỏ 2-3 giọt
Xanhmethylen 1%.Tiếp tục chuẩn độ đến hết màu xanh của xanhmethylen
(chuyển sang màu đỏ gạch) thì dừng lại. Thời gian chuẩn không quá 1 phút.
Tổng số thời gian từ lúc bắt đầu sôi đến kết thúc quá trình chuẩn độ không
quá 3 phút. Ghi số ml dịch đờng đã chuẩn.
19
Tính toán.
( a ì b )
DE= ì 100%
C
a: Lợng đờng khử tra trong bảng Eynon-lane(g).
b: Tỉ lệ pha lãng.
C: Nồng độ phần trăm chất khô (
0
Bx).
2.1.2.5.Phơng pháp xác định độ ẩm bằng máy Precisa HA60 của Thuỵ Sỹ
2.1.2.6.Phơng pháp đánh giá bằng cảm quan TCVN 3215-79.
2.1.2.7. Phơng pháp xác định các chỉ tiêu vi sinh vật
Cân 10 gam thịt đã chế biến cho vào 10 ml dung dịch đệm phosphat pH
7, khuấy đều , ly tâm ở 2500 v/p trong 15 phút , sau đó lấy dịch tiến hành kiểm

20
Môi trờng nuôi cấy.
Thành phần môi trờng: Pepton: 10g;thạch : 20g; cao thịt bò:1,4g; NaCl :
5g; nớc cất :1000ml.
Sau khi pha môi trờng từ các thành phần chất khô, khuấy đều cho đến
khi thạch tan hoàn toàn trong nớc hoặc đun nóng trong nồi hơi nớc cho tan.
Phân phối môi trờng vào bình lợng từ 100ml- 150ml và thanh trùng bằng nồi
hấp ở nhiệt độ 121C trong 15 phút. Sau đó làm nguội đến 45C trong nồi cách
thủy rồi rót vào các đĩa peptri.
Cấy và nuôi ấm

Dịch phân tích đợc cho môi trờng làm giầu và nuôi cấy 2 ngày ở 30
0
C,
sau đó tiến hành xác định vi sinh vật tổng bằng cách pha loãng mẫu phân tích
tới nồng độ 10
-1
,10
-2
, 10
-3
. Lấy 1 giọt mẫu pha loãng cho vào đĩa peptri chứa
môi trờng thạch dinh dỡng, chan đều trên mặt thạch. Mỗi độ pha loãng nên
làm đồng thời 2-3 hộp.Lật ngợc đĩa, đặt vào tủ ấm để nhiệt độ 30C 1C
trong thời gian 48giờ .
Kết quả

Đếm số khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ có số lợng khuẩn lạc
nằm trong khoảng 30 đến 300. Số lợng vi sinh vật trung bình có trong 1ml mẫu
đợc tính theo công thức:

Cấy và nuôi ấm

Nhỏ 1 giọt mẫu cấy lên bề mặt hộp Petri chứa sẵn môi trờng thạch
Chapman và ria cấy đều trên mặt thạch. Nuôi trong tủ ấm ở 37C trong 24 giờ.
Quan sát khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch. Đếm các khuẩn lạc màu vàng nhỏ (1- 2
mm ).
Phép thử khẳng định

Chọn khuẩn lạc nghi ngờ, dùng que cấy vòng cấy chuyển sang các ống
nghiệm có chứa 0,5ml dịch huyết tơng thỏ. Lắc nhẹ để trộn đều môi trờng.
Để các ống đã cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 37C 1C trong 2 giờ. Theo dõi
phản ứng huyết tơng sau mỗi 2 giờ. Tiếp tục nuôi cấy đến 24 giờ thì ngừng nếu
không thấy xuất hiện khối kết tụ.
Kết quả
Dựa vào số khuẩn lạc đếm đợc trên các đĩa Petri và dựa vào tỷ lệ số ống
thử phản ứng coagulase dơng tính trên tổng số ống thử phản ứng, áp dụng công
thức dới đây để tính lợng St.aureus trung bình trong 1g mẫu:
C
N(khuẩn lạc/ml) = x R
n . f
1
. v
Trong đó :
C : Tổng số khuẩn lạc đếm đợc trên tất cả các đĩa
n : Số đĩa Petri đã nuôi cấy
f

: Hệ số pha loãng của đĩa đếm thứ nhất

v : Thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa Petri

4
0,3g; Amoni xitrat bismut: 1,85g; Na
2
SO
3
) 6,15g;
thạch:15g; xanh brilliant : 0,025g; nớc cất :1000ml. Hòa tan các thành phần
trong nớc sôi, không hấp áp lực. Chỉnh pH =7,7. Phân phối vào các đĩa petri
Cấy và nuôi ấm
Pha loãng mẫu 10
-1
,10
-2
, 10
-3
Hút lấy 1ml cho vào ống nghiệm có chứa
môi trờng tăng sinh chọn lọc, nuôi ở 37C trong thời gian từ 18-24 giờ.
Dùng que cấy vòng lấy từ mỗi ống nghiệm đã nuôi ấm cấy ria lên bề mặt
môi trờng chọn lọc nuôi ở 37C trong thời gian từ 24 giờ.
Sau khi nuôi ấm, kiểm tra sự có mặt của các khuẩn lạc Salmonella. Nếu
khuẩn lạc mọc yếu và không điển hình thì nuôi tiếp 24 giờ nữa.
Những khuẩn lạc điển hình trên môi trờng đặc chọn lọc là những khuẩn
lạc có màu nâu hoặc màu đen có ánh kim, một số chủng cho ra các khuẩn lạc có
màu xanh lá cây.
Khẳng định trên môi trờng TSI : lấy những khuẩn lạc điển hình đã chọn
trên môi trờng đặc, cấy lên bề mặt thạch TSI, nuôi ấm ở nhiệt độ 37C trong
24 giờ.
Sau thời gian nuôi ấm nếu khuẩn lạc có

Màu sắc Kết quả

G: Trọng lợng mẫu,g

24
2.1.2.9. Phơng pháp xác định độ dày của màng pullulan: Theo TCVN
3652: 2000
2.1.2.10. Phơng pháp xác định độ chịu nén: bằng máy Hoursfield Siber
Hegner
2.2. Thiết bị, dụng cụ, nguyên vật liệu và hóa chất
2.2.1. Nguyên liệu
- Pullulan của hãng Hayashibara- Nhật bản : Dạng bột màu trắng, không mùi,
vị, có độ ẩm 6%, pH dung dịch 10%: 7, độ nhớt dung dịch 10% ở 30
0
C:
1700cp, kích thớc hạt 1,7mm, khối lợng phân tử 200 kD
- Siro glucoza: chất khô 80%, đờng khử: 38- 40, tro : 0,6%, Nhiệt độ cháy
140- 150
0
C
- Đờng kính: hàm lợng sacaroza 99,7%, tro : 0,15%, nhiệt độ nóng chảy:
186- 188
0
C
- Mật ong tự nhiên
- Thịt lợn mua ngoài thị trờng
- Các hóa chất cần thiết
2.2.2. Thiết bị sử dụng
- Bể ổn nhiệt: GELmbH.D3006 - Đức sản xuất
- Chiết quang kế - Trung quốc sản xuất
- Máy so màu: UV 1601 Nhật Bản.
- Máy đo độ ẩm: Precisa HA60- Switzerland.