BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

HUỲNH NGHĨA

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG
QUY TRÌNH XỬ LÝ
TẾ BÀO GỐC MÁU CUỐNG RỐN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

TP. HỒ CHÍ MINH - Năm 2007


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

HUỲNH NGHĨA

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG
QUY TRÌNH XỬ LÝ
TẾ BÀO GỐC MÁU CUỐNG RỐN
CHUYÊN NGÀNH : BỆNH HỌC NỘI KHOA
Mã số: 3 01 31

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1.PGS. TRẦN VĂN BÉ
2.PGS. TS. TRẦN THỊ LIÊN MINH

1.4 Thu thập, xử lý và lưu trữ MCR ................................................................. 16
1.5 Kỹ thuật xử lý mẫu MCR ........................................................................... 22
1.6 Kỹ thuật tồn trữ lạnh mẫu MCR ................................................................ 27
1.7 Xét nghiệm đánh giá và kiểm tra chất lượng các sản phẩm MCR ............ 31
1.8 Ứng dụng lâm sàng ghép tế bào gốc từ MCR ............................................ 40
CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 48
2.1 Thiết kế nghiên cứu.................................................................................... 48
2.2 Đối tượng nghiên cứu ................................................................................. 48
2.3 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 50
2.4 Phân tích và xử lý số liệu thu thập ...................................................................... 70
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ......................................................................... 71
3.1 Kết quả tư vấn và sàng lọc trước thu thập MCR ........................................ 71
3.2 Kết quả thu thập MCR ............................................................................... 72
3.3 Kết quả xử lý MCR ................................................................................... 84
3.4 Kết quả nuôi cấy tế bào tạo khúm sau xử lý MCR .................................... 86
3.5 Kết quả sàng lọc tế bào MCR thu thập ...................................................... 98
3.6 Kết quả MCR dự trữ đông lạnh (- 1960c) sau xử lý .................................. 99
3.7 Kết quả thực nghiệm ghép tế bào MCR .................................................. 101
CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN .................................................................................. 104
4.1 Về sàng lọc người cho trước khi thu thập MCR ....................................... 104
4.2 Về quy trình thu thập mẫu MCR .............................................................. 106
4.3 Quy trình kỹ thuật xử lý MCR .................................................................. 121


4.4 Kết quả nuôi cấy tế bào sau xử lý mẫu MCR .......................................... 128
4.5 Quy trình dự trữ đông lạnh MCR sau xử lý ở -1960c ................................ 132
4.6 Về kết quả lây nhiễm do virus ................................................................. 136
4.7 Các xét nghiệm đánh giá chất lượng tế bào gốc từ MCR ........................ 137
4.8 Kết quả thực nghiệm ghép tế bào gốc MCR............................................ 140
KẾT LUẬN ....................................................................................................... 144

BCHTT

: Bạch cầu hạt trung tính

BFU-E

: Tế bào tạo khúm dòng hồng cầu

CFC = CFU

: Tế bào tạo khúm = Đơn vò tạo khúm

CFU – E

: Đơn vò tạo khúm dòng hồng cầu

CFU – G

: Đơn vò tạo khúm dòng hạt

CFU – GEMM

: Đơn vò tạo khúm đa tiềm năng

CFU – GM

: Đơn vò tạo khúm dòng bạch cầu hạt, đại thực bào

CFU – L


CMV

: Cytomegalo virus

CR1

: Lui bệnh hoàn toàn lần thứ nhất

DMSO

: Dimethylsulfoxide (chất bảo quản đông lạnh )

FLT3 – Ligand

: Một trong các yếu tố phát triển ( danh từ riêng)

GMP

: Tế bào tiền thân dòng đại thực bào-bạch cầu hạt


GVHD

: Bệnh mảnh ghép chống ký chủ

GVL

: phản ứng mảnh ghép chống ung thư

HbA


HSXLMCR

: Hồ sơ xử lý máu cuống rốn

ICBTR

: Tổ chức đăng ký ghép máu cuống rốn quốc tế

KN

: Kháng nguyên

LT – HSC

: Tế bào gốc tạo máu dài hạn

LT-CIC

: Tế bào đầu tiên nuôi cấy lâu dài

MCR

: Máu cuống rốn

MEP

: Tế bào tiền thân dòng hồng cầu-Mẫu tiểu cầu

MMP


SLTB CD34+

: Số lượng tế bào CD34 dương tính


SLTBNTB

: Số lượng tế bào nhân toàn bộ

SLTC

: Số lượng tiểu cầu

ST – HSC

: Tế bào gốc tạo máu ngắn hạn

TBGMNV

: Tế bào gốc máu ngoại vi

TBGTM

: Tế bào gốc tạo máu

TBN

: Tế bào nhân


Bảng 1.1: Thành phần TBG tạo máu trong MCR và tủy xương .......................... 12
Bảng 1.2: Các kháng nguyên bộc lộ trên tế bào CD34+ .................................... 14
Bảng 1.3: So sánh kết quả loại bỏ hồng cầu và sự thu hồi tế bào nhân, ............. 24
Bảng 1.4: Kết quả so sánh tỉ lệ % thu hồi giữa Sepax và HES .......................... 25
Bảng 1.5: Tỉ lệ nhiễm trùng của các sản phẩm tế bào gốc của MCR ................ 33
Bảng 1.6 : Thống kê các đơn vò MCR đã được lưu trữ , sử dụng ở Châu Á ....... 40
Bảng 1.7 : Thống kê các đơn vò MCR đã được lưu trữ, sử dụng trên thế giới .... 41
Bảng 1.8: Kết quả ghép MCR ở trẻ em ............................................................... 44
Bảng 1.9: Kết quả sau ghép MCR của bệnh nhân người lớn .............................. 46
Bảng 1.10: So sánh ghép MCR với ghép tế bào gốc khác .................................. 47
Bảng 2.11: Trang thiết bò, dụng cụ lưu trữ MCR ................................................. 68
Bảng 3.12: Các lý do loại bỏ trước khi thu thập MCR ........................................ 72
Bảng 3.13: Các lý do loại bỏ sau khi thu thập MCR ........................................... 73
Bảng 3.14: Đặc điểm sản khoa của người cho MCR .......................................... 74
Bảng 3.15: Đặc điểm mẫu MCR thu thập ........................................................... 74
Bảng 3.16: Tương quan giữa các YTSK và thể tích MCR thu thập .................... 75
Bảng 3.17: Tương quan giữa YTSK và với số lượng TBNTB ............................. 76
Bảng 3.18: nh hưởng của các YTSK với phân nhóm TBN ............................... 77
Bảng 3.19: Kết quả thể tích,TBN mẫu MCR thu thập với phân nhóm TBN ...... 79
Bảng 3.20: Tương quan YTSK, thành phần MCR với SLTB CD34 + ................. 80
Bảng 3.21: Kết quả SLTB CD34+ theo phân nhóm TBN .................................. 83
Bảng 3.22: Đặc điểm mẫu MCR sau xử lý ........................................................ 84
Bảng 3.23: Kết quả giảm thể tích và loại bỏ hồng cầu sau xử lý ........................ 84
Bảng 3.24: Khả năng tăng số lượng TBN và tế bào CD34 + sau xử lý ............... 85


Bảng 3.25: Kết quả SLTBN, TBĐN của MCR trước và sau xử lý ..................... 85
Bảng 3.26: Kết quả tế bào CD34+ toàn bộ trước và sau xử lý ........................... 85
Bảng 3.27: Kết quả đếm tế bào sống trước và sau xử lý MCR ........................... 86
Bảng 3.28: Nguyên nhân mẫu MCR nuôi cấy khúm tế bào không thu hoạch .... 87

Bảng 4.57: So sánh các thành phần MCR, HLA và tuổi bệnh nhân.................. 141
Bảng 4.58: Kết quả ghép tế bào gốc của MCR Tokyo cung cấp ..................... 141
Bảng 4.59: So sánh kết quả thời gian mọc mảnh ghép của 2 nguồn: ................ 142
Bảng 4.60: Thời gian sống toàn bộ sau ghép của MCR Tokyo ......................... 143


DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1: Kết quả khảo sát tư vấn và sàng lọc trước khi thu thập ................. 71
Biểu đồ 3.2: Kết quả số lượng mẫu MCR thu thập.............................................. 72
Biểu đồ 3.3: Các lý do loại bỏ sau khi thu thập MCR ........................................ 73
Biểu đồ 3.4: Sự tương quan giữa trọng lượng nhau và thể tích MCR ................. 75
Biểu đồ 3.5: Sự tương quan giữa TLN và SLTBNTB trước xử lý........................ 76
Biểu đồ 3.6: Sự tương quan giữa thể tích MCR và số lượng TBNTB trước xử lý 77
Biểu đồ 3.7: Biểu đồ hình hộp TLN và số lượng TBNTB theo phân nhóm ....... 78
Biểu đồ 3.8: Biểu đồ trọng lượng thai nhi và lượng TBNTB theo phân nhóm.... 78
Biểu đồ 3.9: Biểu đồ hình hộp phân chia TBNTB theo nhóm ............................. 79
Biểu đồ 3.10: Biểu đồ hình hộp thể tích trung bình MCR thu thập ..................... 80
Biểu đồ 3.11: Sự tương quan giữa tuổi sản phụ và số lượng TBCD34+ .............. 81
Biểu đồ 3.12: Sự tương quan giữa thể tích MCR và SLTB CD34+ ..................... 82
Biểu đồ 3.13: Sự tương quan giữa số lượng TBN trước xử lý ............................. 82
Biểu đồ 3.14: Biểu đồ hình hộp SLTB CD34+ trung bình của MCR thu thập .... 83
Biểu đồ 3.15: Biểu đồ kết quả nuôi cấy khúm tế bào sau xử lý ......................... 87
Biểu đồ 3.16: Sự tương quan của BFU-E với số lượng TBNTB sau xử lý ........... 90
Biểu đồ 3.17: Sự tương quan của BFU-E với trọng lượng em bé ........................ 90
Biểu đồ 3.18: Sự tương quan của CFU với trọng lượng thai nhi .......................... 92
Biểu đồ 3.19: Sự tương quan của CFU-GM với TBNTB sau xử lý...................... 92
Biểu đồ 3.20: Sự tương quan của CFU-GEMM với trọng lượng thai nhi............. 94
Biểu đồ 3.21: Sự tương quan của CFU-GEMM Mvới số lượng TBN sau xử lý .. 94
Biểu đồ 3.22: Sự tương quan của CFU-total với trọng lượng thai nhi.................. 96
Biểu đồ 3.23: Sự tương quan của CFU-total với số lượng TBNTB sau xử lý ...... 96

Hình 3.11: Mẫu MCR sau xử lý ........................................................................... 86
Hình 3.12: Lập hồ sơ MCR sau xử lý ................................................................... 86
Hình 3.13: Khúm BFU-E lớn................................................................................ 88
Hình 3.14: Bốn khúm CFU-GM ........................................................................... 81
Hình 3.15: (A) Tế bào CD34 + nhuộm giem sa, (B) GFU- GEMM khổng lồ..... 88
Hình 3.16: Mẫu MCR được lưu trữ sau khi xử lý ............................................... 101
Hình 3.17: Mẫu MCR được lấy từ túi vận chuyển ............................................. 103
Hình 3.18: Mẫu MCR được rã đông ở 370C ....................................................... 103
Hình 3.19: Mẫu MCR được rút ra bằng ống chích 20cc....................................... 96
Hình 3.20: TBG MCR được truyền qua ống thông TMTƯ ................................ 103
Hình 3.21: MCR : đếm SLTBN; CD34; nuôi cấy khúm TB; đếm TB sống....... 103
Hình 3.22: Mẫu MCR được hoàn tất sau ghép ................................................... 103


1

MỞ ĐẦU
Hơn 30 năm qua, phương pháp ghép tuỷ xương khác gien đã được sử dụng
điều trò hàng ngàn bệnh nhân mắc bệnh ác tính và di truyền bẩm sinh của hệ tạo
máu. Hai yếu tố chính góp phần thành công trong ghép tuỷ xương khác gien là
sự lựa chọn người cho phù hợp kháng nguyên hoà hợp tổ chức (Human
Leucocyte Antigen : HLA ) và sự kiểm soát được bệnh mảnh ghép chống ký chủ
(Graft vesus host disease: GVHD) [41]. Người cho tủy là anh em ruột phù hợp
HLA thường không đủ, do đó phải tìm nguồn cho tuỷ từ trong cộng đồng có HLA
phù hợp. Tuy nhiên vẫn có một số bất lợi [41], [42]:
- Mất thời gian dài để tìm người cho phù hợp HLA: 1- 6 tháng (trung bình
3.5 tháng);
- Số người cho bò giới hạn ở những cộng đồng dân thiểu số và các chủng
tộc khác nhau;
- Người cho không có sẵn ở thời điểm cần ghép;

các khu vực nhằm trao đổi thông tin và các sản phẩm MCR .
Tại Việt Nam, việc tìm hiểu các yếu tố trong MCR ở các sản phụ người
Việt Nam đã được Trung tâm Truyền máu Huyết học TP. Hồ Chí Minh thực hiện
và kết quả cho thấy MCR của các sản phụ người Việt Nam đủ tiêu chuẩn của
một sản phẩm sử dụng trong ghép để thay thế cho các nguồn tế bào gốc từ tủy
xương hoặc máu ngoại biên.
Mặc khác tổng kết 10 năm điều trò bệnh về máu tại Bệnh viện Truyền
máu Huyết học TP. Hồ Chí Minh cho kết quả [2],[6], [10]:


3

- Các bệnh lý ác tính chiếm: 50,24% trong tổng số bệnh nhân. Trong số
này có chỉ đònh điều trò bằng ghép: khoảng 20% (700 bệnh nhân). Nhưng vì
không tìm được người cho phù hợp, do đó chỉ có dò ghép tuỷ xương cho 3 bệnh
nhân và 18 bệnh nhân tự ghép tế bào gốc máu ngoại vi , kết quả này mới chỉ
bằng 3% số bệnh nhân có chỉ đònh điều trò bằng ghép.
- Các bệnh Hemoglobin và bệnh Thalassemia chiếm 12% tổng số bệnh
nhân [2],[6]. Trong loại bệnh này chỉ có dò ghép mà không có tự ghép và tất cả
các bệnh nhân thể nặng của bệnh Thalassemia đều có chỉ đònh ghép, nhưng chỉ
mới dò ghép được 2 bệnh nhân. Các loại bệnh này là gánh nặng cho xã hội vì
phải thường xuyên truyền máu và “sống nhờ máu người khác”.
Với khuynh hướng phát triển chung trên thế giới, đặc biệt trong lónh vực
công nghệ sinh học áp dụng cho việc điều chế vật liệu sinh học mới để áp dụng
cho điều trò, bên cạnh đó nhu cầu thiết thực của xã hội trong điều trò bệnh lý ác
tính và bệnh lý di truyền bẩm sinh , cần thiết phải có một sản phẩm tế bào gốc
đạt tiêu chuẩn để ghép, việc chọn lựa MCR để xử lý thành sản phẩm TBG được
xem là giải pháp tối ưu hiện nay. Do vậy, để tiến tới xây dựng một ngân hàng
MCR tại TP. Hồ Chí Minh đáp ứng các tiêu chuẩn quốc tế và thật sự mang lại
lợi ích cho cộng đồng, điều cần thiết phải có những nghiên cứu thử, các nghiên

1.1 LƯC SỬ PHÁT TRIỂN NGÂN HÀNG VÀ GHÉP TẾ BÀO GỐC MCR
[ 59],[60]
- Năm 1974, có sự hiện diện tế bào gốc đa tiềm năng trong MCR ở người
đã được xác đònh bởi Knudtzon. Gần 10 năm sau, Ogawa và cs đã có bằng chứng
về sự hiện diện của tế bào gốc tiền thân trong MCR. Khả năng sử dụng tế bào
MCR của người như là nguồn tế bào gốc để ghép được đề nghò lần đầu tiên vào
cuối năm 1982 bởi tác giả Edward A Boyse trong một cuộc thảo luận riêng với
Hal Broxmeyer và Judith Bard.
- Từ năm 1984 – 1985, những giả thuyết cho rằng MCR có chứa nhiều tế
bào có khả năng hồi phục sự tạo máu lần đầu tiên đã được chứng minh bởi
Bosey và cs trong một mô hình trên chuột. Tuy nhiên, vấn đề này không có tiến
triển hơn cho mãi đến năm 1989, những thực nghiệm và nghiên cứu lâm sàng đã
được chỉ đònh rộng rãi cho MCR có thể sử dụng trong trò liệu lâm sàng.
Broxmeyer và cs đã cho thấy những bằng chứng thực nghiệm chứng minh MCR
là nguồn tế bào gốc tạo máu giàu có [42]ù. Vài năm sau đó, năm 1989 Gluckman
và cs đã báo cáo trường hợp ghép tế bào gốc tạo máu đầu tiên bằng MCR thay
vì dùng bằng tủy xương. Chúng có khả năng phục hồi hệ thống tạo máu của trẻ
em bò bệnh thiếu máu Fanconie bằng MCR phù hợp HLA của người anh em
[58].
- Năm 1991, ghép MCR thành công đầu tiên trên trẻ em bệnh máu ác
tính: bệnh bạch cầu mãn dòng tủy (CML).
- Năm 1992, mẫu MCR của gia đình được thu thập đầu tiên tại ngân hàng
MCR của trường Đại học Arizona.


6

- Năm 1993, ghép MCR không liên hệ huyết thống được thực hiện tại Đại
học Duke.
- Năm 1994 - 1995, chương trình đăng ký MCR được thành lập trên thế

24 đến ngày 34 của sự hình thành và phát triển phôi. Màng nội mạc có khả
năng tạo máu thì nằm ở mặt lưng của động mạch chủ và có nguồn gốc từ vùng
AGM. Có mối liên quan chặt chẽ giữa hệ thống tạo máu và hệ thống tạo mạch,
vì chúng đều xuất phát từ tế bào mầm có khả năng tạo máu và tạo mạch
(haemangioblast). Những tế bào gốc di chuyển khắp cơ thể bằng cách chảy xuôi
dòng theo dòng máu và nhờ thế những tế bào tạo máu từ túi noãn hoàng hay từ
vùng AGM đến gan. Vào tuần thứ 7 của thời kỳ thai nghén, gan là cơ quan chính
của sự tạo máu. Nhiệm kỳ của hệ thống tạo máu sơ khai kéo dài trong bao lâu
thì chưa rõ, có lẽ nó tùy thuộc vào từng loại động vật. Số lượng tế bào non bình
thường tạo dòng hồng cầu chiếm hơn 90% so với quần thể hồng cầu trưởng
thành trong tuần hoàn vào tuần thứ 10 của thời kỳ thai nghén. Từ tháng thứ 3
của thời kỳ thai nghén đã có sự tạo máu ở lách, tuyến ức và hạch lymphô. Sự tạo
máu bắt nguồn từ tủy xương vào tháng thứ 4 hay tháng thứ 5 của thời kỳ thai
nghén. Kể từ tháng thứ 6 của thai kỳ, tủy xương sẽ nắm vai trò chủ lực trong sự
tạo máu, mặc dù sự tạo máu vẫn còn hiện hữu ở các vò trí khác như gan lách cho
đến hết tuần đầu sau sanh. Về hình thái học, những tế bào gốc tạo máu là
những tế bào đơn nhân, kích thước trung bình, nhân chiếm nhiều hơn tế bào chất,
tế bào chất ưa kiềm và không hạt, còn hạt nhân thì rất nổi bật. Tuy nhiên, chúng
ta không thể phân loại hình thái học của chúng bằng kính hiển vi quang học.
 ĐẶC TÍNH TẠO HÌNH CÁC DÒNG CỦA CÁC TBGTM [63], [88]
Trong các mô hình cổ điển của tế bào gốc tạo máu (TBGTM) , các tế bào
đa năng dần dần tự thay thế để chuyển sang giai đoạn biệt hóa cao hơn và đồng


8

thời mất dần tính đa năng của chúng. Gần đây, những mô hình tạo máu tân tiến
được giới thiệu, như mô hình thống nhất về sự phát triển tế bào gốc và mô hình
khoảng cách các giai đoạn phát triển tế bào gốc. Những mô hình này cho thấy sự
biệt hóa tế bào gốc tạo máu theo thứ bậc nhất đònh trong những tình huống cụ

không có hoạt động của men này. Trong thực nghiệm tiền lâm sàng các tế bào
này có thể khôi phục lại hoàn toàn chức năng tạo máu của chuột bò chiếu xạ ở
liều chết sau vài tháng. Tế bào gốc tạo máu dài hạn là các tế bào gốc tạo máu
mang CD34 Thy Lin, các tế bào này có thể biệt hoá thành tất cả các loại tế
bào máu khác nhau. Trong điều kiện bình thường, các tế bào gốc dài hạn có khả
năng tự tái tạo trong suốt đời cá thể.
Các tế bào gốc tạo máu ngắn hạn (Short term – Hematopoietic: ST-HSC)
so với tế bào gốc dài hạn thì chúng tương đối trưởng thành hơn, được sinh ra từ


10

tế bào gốc dài hạn mà vẫn duy trì được bản chất tự tái tạo khoảng 8 tuần và chỉ
tăng sinh­biệt hóa một thời gian thường là vài tháng. Các tế bào gốc ngắn hạn
sinh ra các tiền thân đònh hướng chung dòng tủy (CFU–GEMM) và các tiền thân
đònh hướng chung dòng lymphô (CFU–L). Các tiền thân đònh hướng dòng
lymphô tạo ra các tế bào đầu dòng và biệt hoá thành tế bào lymphô B hoặc tế
bào lymphô T, tế bào giết tự nhiên. Các tiền thân dòng tủy sinh ra các tế bào
đònh hướng dòng hồng cầu (BFU–E), tế bào đònh hướng dòng hạt và đại thực bào
(CFU–GM)â, tế bào đònh hướng dòng mẫu tiểu cầu (CFU–Meg)… và biệt hóa
thành các tế bào bạch cầu đơn nhân, đại thực bào, bạch cầu hạt đa nhân trung
tính, bạch cầu ưa axít, ưa kiềm, tiểu cầu và hồng cầu. Các tế bào gốc tạo máu
ngắn hạn cũng có khả năng tăng sinh–biệt hóa thành các tế bào máu nhưng so
với các tế bào gốc tạo máu dài hạn, tính đa năng của chúng bò giới hạn. Thí dụ
tế bào tiền thân hồng cầu chỉ có thể tạo thành tế bào hồng cầu (sơ đồ 1.1).
1.3 MÁU CUỐNG RỐN
MCR ( máu cuống rốn) [5],[97]hay còn gọi là máu dây rốn hay máu bánh
nhau chảy trong tuần hoàn máu thai nhi và cung cấp chất dinh dưỡng cho bào
thai đang phát triển trong tử cung người mẹ. Phần máu còn lại trong dây rốn và
bánh nhau khi sản phụ sinh em bé và dây rốn là chất thải sinh học trong các