Bài 13 Giới thiệu một số kỹ thuật bảo quản vi sinh vật
1. Phiếu thông tin về chủng vi sinh vật bảo quản:
Đại học Quốc gia Hà Nội
Trung tâm Công nghệ Sinh học
Bảo tàng Giống chuẩn vi sinh vật (VTCC)
Thông tin chung về
chủng vi sinh vật bảo quản
1. Nấm sợi Nấm men Xạ khuẩn Vi khuẩn
2. Tên khoa học:
Giống (Genus) Loài (Species) Dưới loài (Subspecies)
Tên khác nếu có (synnonym):
3. Nguồn phân lập:
Nơi phân lập:
4. Thời gian bắt đầu bảo quản tại VTCC:
5. Người phân lập:
6. Người cung cấp: Nơi cung cấp:
7. Ký hiệu chủng VTCC:
8. Ký hiệu là lý lịch chủng từ các bảo tàng khác:
VTCC < < < < <
9. Chủng chuẩn (Type) Chủng tự nhiên (wild) Đột biến (cụ thể…)
10. Hình thức sinh sản:
11. Gây bệnh cho: Người Động vật Thực vật Không
12. Dấu chuẩn di truyền (nếu có):
13. Hình thái tế bào, khuẩn lạc:
14. Khả năng ứng dụng:
15. Tài liệu liên quan:
16. Các phương pháp bảo quản:
Đông khô Lạnh sâu Nitơ lỏng Cấy truyền
17. Môi trường nuôi cấy thích hợp:
thời gian bảo quản dài.
3.3. Duy trì đặc tính di truyền ổn định của chủng vi sinh vật
bảo quản:
Nói chung với các chủng vi sinh vật bảo quản, đặc biệt với các chủng vi sinh vật chuẩn, các
chủng vi sinh vật có ứng dụng trong công nghiệp thì yêu cầu duy trì đặc tính sinh học, tính trạng di
truyền là rất quan trọng. Các phương pháp bảo quản không thích hợp có thể dẫn đến đột biến hoặc
mất plasmid. Vì vậy cần phải chọn các phương pháp bảo quản thích hợp cho các chủng này.
3.4. Tính thuần chủng của vi sinh vật bảo quản:
Chủng vi sinh vật từ khi bảo quản đến khi sử dụng phải đảm bảo thuần chủng đúng theo tên và
các đặc điểm sinh học đặc trưng. Đây cũng là yêu cầu tiên quyết đối với công việc của một Bảo tàng
vi sinh vật, do vậy mà các thao tác và phương pháp tiến hành phải được thực hiện sao cho hạn chế tới
mức tối thiểu đối với các chủng bảo quản nhằm tránh tạp nhiễm.
3.5. Kinh phí cần cho Bộ sưu tập vi sinh vật:
Kinh phí bao gồm kinh phí về lương cho cán bộ, thiết bị, vật tư hoá chất, nhà xưởng và điện
nước tiêu hao. Các kinh phí này tuỳ thuộc vào quy mô của Bộ sưu tập giống vi sinh vật và phương
pháp bảo quản, phạm vi dịch vụ thực hiện đối với khách hàng.
Tên Bảo tàng vi
sinh vật (viết tắt)
Nước
Số lượng chủng vi sinh vật
ATCC Mỹ 73507
DSMZ Đức 14460
NBRC Nhật 18300
Bảng 1. Quy mô của một số bộ sưu tập giống vi sinh vật.
STT Tên Bảo tàng vi sinh vật, Nước Giá thành (USD)
1 ATCC, Mỹ 80
2 CBS, Hà Lan 60
3 VKM, Nga 45
4 Thái Lan 40
tra cứu, làm báo cáo khoa học theo các tiêu chí riêng. Nói chung với các bộ sưu tập có số lượng vi
sinh vật không lớn thì có thể sử dụng phần mềm: Microsoft Access, Access Visual Basic.
4. Giới thiệu chung về một số phương pháp bảo quản vi sinh
vật:
Trong phần này chúng tôi mô tả các phương pháp được dùng chung cho các đối tượng vi sinh
vật chính (vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, xạ khuẩn, vi tảo).
4.1. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật:
Hình 1. Bảo quản bằng phương pháp cấy truyền trên môi trường thạch
Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thích
hợp (dịch thể hay trên thạch) trong ống nghiệm hay bình tam giác và để trong điều kiện thích hợp cho
vi sinh vật phát triển. Sau đó các chủng vi sinh vật này được chuyển đến nơi bảo quản có nhiệt độ
thích hợp. Quá trình này được lặp lại trong một thời hạn nhất định, đảm bảo chủng vi sinh vật luôn
được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Thực tế có nhiều chủng vi sinh vật thích hợp
với phương pháp bảo quản này như: Staphylococi, Coliform... có thể sống được vài năm theo cách
này. Cho dù phương pháp này là phương pháp khá phổ biến được dùng trong các cơ sở nghiên cứu và
sử dụng các chủng vi sinh vật đặc biệt là các chủng đang dùng cho nghiên cứu. Tuy nhiên, phương
pháp này cũng bộc lộ nhiều nhược điểm sau:
- Dễ bị tạp nhiễm và dễ dẫn đến mất chủng giống gốc.
- Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữu các chủng trong quá trình bảo quản.
- Phải nghiên cứu và theo dõi thời gian cấy truyền thích hợp đối với các chủng bảo quản.
- Tốn nhiều công sức để cấy truyền.
- Giống gốc có thể mất do sai sót khi dùng môi trường cấy truyền không thích hợp.
- Chủng vi sinh vật cấy truyền dễ bị thay đổi các đặc điểm sinh học do đột biến xuất hiện
sau mỗi lần cấy truyền.
* Phương pháp làm mất nước trong môi trường bảo quản:
Phương pháp này thường dùng cho các chủng nấm sợi và nấm men. Theo phương pháp này
các chủng vi sinh vật có thể được bảo quản với các chất mang phổ biến như sau:
a. Trên đất, cát và silicagel. Các nghiên cứu cho thấy là bào tử nấm có thể
sống 4-5 năm khi bị làm khô trong đất mà không bị thay đổi các đặc tính sinh học.
cần được quan tâm khi thực hiện phương pháp này là:
- Tuổi của vi sinh vật bảo quản.
- Thành phần dịch huyền phù tế bào vi sinh vật.
- Tốc độ đông khô.
- Nhiệt độ đông khô thấp nhất.
- Khoảng thời gian làm khô mẫu và độ ẩm cuối cùng của mẫu.
Phương pháp này nhanh và thuận lợi cho các đợt bảo quản số lượng lớn mẫu. Thông thường
theo phương pháp này vi sinh vật được bảo quản từ 10-20 năm. Nói chung cả hai phương pháp này có
nhiều ưu điểm so với các phương pháp trước như thời gian bảo quản lâu, tiết kiệm được công sức và
sai sót nhãn mác và tạp nhiễm. Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là giá thành
thiết bị. Độ ổn định của các chủng vi sinh vật bảo quản theo các đợt đông khô là khác nhau. Hơn thế
nữa các chủng trước khi đem ra sử dụng phải được hoạt hoá trên môi trường thích hợp một số lần để
phục hồi các đặc tính sinh học.
4.3. Phương pháp bảo quản lạnh sâu:
Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trong môi trường dịch thể
và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt độ lạnh sâu (-196
°
C -> -80
°
C).
Hình 3. Bảo quản lạnh sâu
Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên
nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích luỹ các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các
tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế
tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide). Việc bảo quản theo
phương pháp lạnh sâu này được thực hiện ở các thang nhiệt độ khác nhau như -20
°
C, -30
°
C, -40
Đây là phương pháp phổ biến được sử dụng tại mọi bảo tàng vi sinh vật trên thế giới. Phương
pháp đông khô hạn chế được sự thay đổi các đặc tính của vi sinh vật và bảo quản được trong một thời
gian dài.
Phương pháp đông khô được trình bày ở đây là phương pháp được dùng tại NCTC (National
Colleciton Type Culture, Anh).
1, Nuôi vi khuẩn cho đông khô:
Vi khuẩn được cấy trên môi trường ống thạch nghiêng thích hợp. Tuy nhiên, cũng có thể chuẩn
bị dịch vi khuẩn trên môi trường dịch thể nhưng phải làm đậm đặc tế bào bằng li tâm. Tuổi của tế bào
cũng rất quan trọng do đó thường chọn tế bào nằm trong pha sinh trưởng log.
2, Chuẩn bị đệm mẫu:
Có thể dùng một trong hai loại đệm sau:
+ Đệm huyết thanh- inositol;
Meso-inositol: 5 gam
Huyết thanh ngựa (số 3): 100 ml
Thanh trùng bằng phương pháp lọc vi khuẩn, sau đó phân 5ml vào các bình vô trùng.
+ Đệm inositol:
Môi trường dinh dưỡng bột số 2: 2.5 gam
Meso-inositol: 5 gam
Nước cất: đủ 100 ml.
Phân 5 ml vào các bình và khử trùng tại nhiệt độ 121
O
C.
3, Chuẩn bị dịch tế bào:
Mật độ tế bào có ý nghĩa quan trọng đối với chất lượng bảo quản. Thông thường có thể thu sinh
khối từ mỗi ống thạch nghiêng chỉ dùng cho 1-2 ml đệm pha mẫu để tạo dịch huyền phù tế bào. Mật
độ vi khuẩn thông thường cần đạt 10
10
(đối với vi sinh vật không có bào tử). Mật độ trên có thể giảm
với các vi sinh vật có bào tử. Hai đệm pha mẫu trên có thể dùng với mọi vi khuẩn nhưng trong trường
hợp enterobacteria thì không dùng đệm huyết thanh vì sẽ gây ra thay đổi đặc tính miễn dịch của vi
thực hiện trước khi và ngay sau khi đông khô. Các bước kiểm tra tiếp theo có thể được thực hiện sau
1 hoặc 5 năm để đánh giá chất lượng của mẫu đông khô. Nói chung khả năng sống của vi sinh vật có
bào tử cao hơn vi sinh vật không có bào tử và loại gram dương cao hơn vi sinh vật gram âm. Tuy
nhiên, với vi sinh vật kỵ khí thì yêu cầu phải được tiến hành theo đúng qui trình, tránh vi sinh vật tiếp
xúc với oxy.
12, Bảo quản mẫu:
Mẫu thông thường được bảo quản tại 4
O
C hay nhiệt độ phòng.
b. Phương pháp giữ trong lạnh sâu:
1, Chuẩn bị tế bào cho lạnh sâu:
Tế bào được nuôi cấy trên môi trường và nhiệt độ thích hợp nhất tại giữa hoặc đầu pha log.
2, Pha dịch tế bào với glycerol hoặc DMSO đã thanh trùng trước để đạt nồng độ cuối cùng 10%
và mật độ tế bào 10
6
.
3, Dịch huyền phù tế bào được đưa vào ống lạnh sâu và đóng nắp (trong trường hợp hàn ống
thuỷ tinh, cần để trong dịch xanh metylene 0.05% để phát hiện các ống bị rò rỉ).
Toàn bộ mẫu để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để cho cân bằng áp suất thẩm thấu trong và
ngoài tế bào. Trong trường hợp có nitơ lỏng thì mẫu được chuyển sang bình nitơ lỏng.
Mẫu đưa vào lạnh sâu cũng cần theo tốc độ nhất định. Thông thường tốc độ lạnh dao động 1-3
O
C/phút để đạt tới nhiệt độ -30
O
C ban đầu. Sau đó mẫu được làm lạnh tiếp với tốc độ cao hơn 10-15
O
C/phút để đạt tới nhiệt độ lạnh cần thiết (-100
O
C đến -80
O
O
C, kiểm
tra sau 2-4 ngày.
2, Chuẩn bị dịch huyền phù xạ khuẩn. Nước cất vô trùng được dùng để tạo dịch huyền phù xạ
khuẩn (hay bào tử xạ khuẩn) từ ống thạch nghiêng. Lấy 1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi ống
nghiệm và để khô tại nhiệt độ phòng (24
O
C) trong thời gian 1 tháng. Đập nhẹ vào thành ống cho các
hạt tách đều ra và bảo quản mẫu tại 4
O
C.
3, Hoạt hoá mẫu đơn giản bằng cách lấy vòng que cấy mẫu đưa lên môi trường (thạch hoặc dịch
thể) và để ở nhiệt độ thích hợp.
5.2. Bảo quản vi tảo:
Vi tảo thông thường được bảo quản theo 3 phương pháp: Cấy truyền, lạnh sâu và đông khô. Các
phương pháp đã được trình bày chi tiết trong phần vi khuẩn. Một số điểm cần chú ý khi bảo quản vi
tảo là ở chỗ: Nên dùng tế bào già ở pha cân bằng, phương pháp lạnh sâu cho kết quả tốt hơn phương
pháp đông khô.5.3. Các phương pháp dùng cho bảo quản nấm sợi:
a. Phương pháp cấy truyền:
Phương pháp này thường được ứng dụng với các sợi nấm có bào tử. Các chủng nấm sợi được
nuôi trên môi trường thạch thích hợp và để cho sợi nấm phát triển đến mức độ cực đại, sau đó là quá
trình hình thành bào tử, các ống giống này sẽ được bảo quản theo các cách khác nhau:
- Các ống thạch được để trong tủ lạnh (4-7
O
C).
- Bảo quản trong thạch dưới lớp dầu: Các ống thạch được bảo quản dưới lớp dầu parafin
có tỷ trọng tương đối là 0.83- 0.89 đã được khử trùng ở nhiệt độ 121
nhiệt do đó việc đưa dịch bào tử vào phải được thực hiện trong chậu nước đá. Lượng dịch bào tử đưa
vào không vượt quá 1/3 thể tích hạt silicagel trong lọ. Sau đó dùng tay lắc đều đảm bảo các hạt
silicagel đều dính dịch bào tử nấm sợi. Dán nhãn, ghi các thông tin cần thiết như số mã chủng, ngày
bảo quản, môi trường và nhiệt độ thích hợp...
3, Lọ silicagel được đậy nắp cẩn thận nhưng không vặn chặt (nới 1,5 vòng) sau đó giữ trong
bình hút ẩm (độ ẩm 35-40%), 25
O
C trong 1 tuần. Vặn chặt nút và quấn giấy parafil giữ trong 4
O
C.
Kiểm tra độ sống sót sau khi bảo quản:
Mẫu silicagel ở 4
°
C, dùng que cấy vô trùng lấy ra 3 hạt silicagel để trên mặt thạch môi trường
mầm thóc (Maltagar), lắc đều cho hạt silicagel tiếp xúc lên mặt môi trường. Để ở nhiệt độ thích hợp,
kiểm tra tra khuẩn lạc nấm theo thời gian thích hợp.
c. Bảo quản nấm sợi có bào tử theo phương pháp đông khô (freez-drying):
Chuẩn bị:
1, Ống đông khô rửa sạch (sonic cleaner) trong 15 phút sau đó khử trùng 170
O
C trong 3 giờ.
2, Môi trường sữa tách bơ (Skimmilk) 20% khử trùng ướt (115
O
C/20 phút).
3, Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo từng chủng môi trường
nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác nhau (10-15 ngày).
Cách tiến hành:
1, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml sữa thanh trùng cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm
sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử có mật độ cao nhất (đối với một số chủng có số lượng
bào tử thấp thì có thể tạo dịch bào tử từ một vài ống thạch bào tử khác nhau).
o
C, độ chân không 45 minitor, gắn ống mẫu với hệ thống manifold tiến hành
hàn ống khi độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55
o
C.
Kiểm tra độ sống sót sau khi đông khô:
1, Mở ống đông khô bằng cách đốt nóng đầu hàn trên đèn cồn và làm lạnh đột ngột bằng cồn
đốt.
2, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 1ml nước cất vô trùng từ ống nghiệm chứa 9,8 ml nước cất vô
trùng làm tan đều mẫu đông khô. Hút toàn bộ dịch huyền phù sang ống nghiệm chứa 9,8 ml nước cất.
Trộn đều và nhỏ vào 3 vị trí khác nhau (mỗi vị trí 3 giọt) trên môi trường thạch đĩa thích hợp và
nghiêng cho dịch chảy đều dọc theo một hướng như hình vẽ:
3, Sau đó đậy nắp đĩa, bao quanh bằng parafil và để ở nhiệt độ thích hợp.
4, Cách đánh giá:
Rất tốt: ≥ 100 khuẩn lạc.
Khá: 50 – 100 khuẩn lạc.
Trung bình: 10-50 khuẩn lạc.
Kém: < 10 khuẩn lạc.
Không mọc.
Bảo quản được thực hiện với các mẫu từ khá trở lên. Tuy nhiên, có một số nấm sợi mà khuẩn
lạc mọc tràn lan thì có thể đánh giá như sau: Nếu các khuẩn lạc mọc đều khắp trên bề mặt đĩa là tốt.
Mẻ đông khô là thành công nếu như số khuẩn lạc mọc chiếm ít nhất là nửa bề mặt môi trường trong
đĩa petri. Các mẫu có số lượng khuẩn lạc mọc dưới mức trên phải làm tăng mật độ bào tử trước khi
đông khô như thay đổi môi trường sinh bào tử, hoặc chuẩn bị dịch huyền phù bào tử từ 3-4 ống
nghiệm bào tử nấm sợi.
d. Bảo quản nấm sợi bằng phương pháp đông khô trực tiếp:
hành quá trình làm khô trong 3 giờ.
4, Hàn kín ampoule mẫu:
Khi máy cô Dura-Dry đang chạy để đảm bảo độ chân không cần thiết, lần lượt khoá van cho
từng ampoule mẫu và tiến hành hàn với các mẫu này tại vị trí ống bị thắt. Dùng ngọn lửa gas để đốt
nóng phần ống thắt cho đều các phía và xoay đều cho thuỷ tinh chảy bịt kín ống. Sau đó dùng ngọn
lửa gas để cắt rời phần trên (nối với manifold) và phần dưới chứa mẫu. Hết đợt lại khoá các van của
các ampoule mẫu tiếp theo và hàn lần lượt như trên.
Kiểm tra chất lượng ngay sau khi bảo quản:
- Để kiểm tra độ sống sót của mẫu nấm sợi bảo quản, có thể thực hiện theo cách đã được
mô tả ở phần đông khô.
- Kiểm tra độ thuần chủng: các mẫu được cấy trên môi trường thích hợp và quan sát hình
thái và các đặc điểm sinh học đặc trưng cần thiết để đánh giá khả năng tạp nhiễm và đặc
tính sinh học.
- Thí nghiệm đánh giá nhanh thời gian bảo quản: các mẫu sau đông khô trực tiếp được
giữ ở 37
o
C trong 2 tuần. Độ sống sót của mẫu bảo quản giảm trong 2 tuần ở 37
o
C tương
đương với bảo quản 10 năm ở 4
o
C.
e. Bảo quản nấm sợi bằng phương pháp lạnh sâu -80
o
C và nitơ lỏng (-196
o
C):
Chuẩn bị:
1, Chuẩn bị dung dịch glycerol 10% (3 ml trong ống nghiệm) khử trùng ở 121
o
sinh khối và giữ trong glycerol 10% như trên.
Đánh giá khả năng sống của mẫu bảo quản:
1, Làm tan mẫu (mẫu lấy từ tủ lạnh sâu -80
o
C hoặc nitơ lỏng -196
o
C) trong bể ổn nhiệt 37
o
C
trong 2 phút.
2, Dùng que cấy lấy các miếng môi trường thạch đặt vào 3 vị trí khác nhau trên môi trường
thạch đĩa thích hợp. Để ở nhiệt độ thích hợp và xem khả năng mọc sau thời gian thích hợp (2-4 ngày).
Chú ý khi lấy mẫu cần lấy cả sợi nấm để đưa vào môi trường thạch đĩa.
Một số điều chú ý đối với bảo quản nấm sợi:
- Ảnh hưởng của ánh sáng với quá trình hình thành bào tử: Phần lớn trường hợp thì sự
thành công của phương pháp bảo quản phụ thuộc vào số lượng bào tử. Ánh sáng là một
tác nhân quan trọng đối với quá trình hình thành bào tử của nấm sợi, ánh sáng có bước
sóng ngắn có tác dụng kích thích quá trình hình thành bào tử, ánh sáng gần vùng cực tím
(3100 – 4000 nm) có tác dụng thay đổi màu sắc và kích thước khuẩn lạc.
- Thành phần môi trường: Nói chung các môi trường có thành phần dinh dưỡng nghèo thì
thường cho lượng bào tử lớn.
- Tránh nhiễm tạp các con mạt (mite), các chủng nấm sợi lưu giữ thường bị mạt phá
hoại. Đầu tiên chúng ăn chủng giống và làm hỏng, sau đó gây tạp nhiễm do mang bào tử
và vi khuẩn trên cơ thể từ ống này sang ống khác. Vì lý do trên mà cần có biện pháp hạn
chế mạt, thông thường các chủng giống phải được bảo quản ở nơi sạch, nhiệt độ 4-8
o
C.
5.4. Phương pháp bảo quản nấm men:
Tương tự như nấm sợi, có nhiều phương pháp bảo quản nấm men. Chúng tôi chỉ đề cập đến các
bảo quản vi khuẩn và xạ khuẩn).
Bài 14 Dinh dưỡng của vi sinh vật
13.1. YÊU CẦU DINH DƯỠNG CỦA VI SINH VẬT
13.1.1. Thành phần hoá học của tế bào vi sinh vật
Cơ sở vật chất cấu tạo nên tế bào vi sinh vật là các nguyên tố hoá học. Căn cứ vào mức độ yêu
cầu của vi sinh vật đối với các nguyên tố này mà người ta chia ra thành các nguyên tố đa lượng và
các nguyên tố vi lượng. Các nguyên tố chủ yếu bao gồm: C, H, O, N, P, S, K, Mg, Ca và Fe. Trong số
này có 6 loại chủ yếu (chiếm đến 97% trọng lượng khô của tế bào vi sinh vật), đó là C, H, O, N, P và
S. Các nguyên tố vi lượng thường là Zn, Mn, Na, Cl, Mo, Se, Co, Cu, W, Br và B. Tỷ lệ các nguyên
tố hoá học tham gia cấu tạo tế bào vi sinh vật là không giống nhau ở các nhóm vi sinh vật khác nhau.
Ví dụ nấm men, nấm sợi và vi khuẩn có lượng chứa trung bình của 6 nguyên tố chủ yếu là không
giống nhau (bảng 13.1):
Bảng 13.1: Lượng chứa trung bình các loại nguyên tố chủ yếu trong tế bào một số nhóm vi sinh vật
(% trọng lượng khô)
Nguyên tố Vi khuẩn Nấm men Nấm sợi
C
H
O
N
P
S
~50
~8
~20
~15
~3
~1
~50
~7
Cl
Fe
Na
Những
nguyên tố
khác,Mo, Ni,
Co, Mn, Zn, ..
50
21
12
8
3
1
1
0.5
1
0.5
0.5
1
0.5
45-58
18-31
5-17
6-8
1.2-10
0.3-1.3
0.2-5
0.1-1.1
0.02-2.0
0.01-5.0
Fe
3+
, Fe
2+
và phức chất của Fe
Na
+
Lấy từ các ion vô cơ khác
*Các tế bào bao gồm 70% trọng lượng là nước và 30% là các nguyên liệu khô khác. Mức trung bình
này được tính theo sinh trưởng của vi khuẩn Gr(-) trong điều kiện dư thừa chất dinh dưỡng ở nuôi
cấy theo mẻ.
Vi khuẩn lưu huỳnh (sulfur bacteria), vi khuẩn sắt (iron bacteria) và vi khuẩn đại dương (marine
bacteria) có lượng chứa các nguyên tố S, Fe, Na, Cl nhiều hơn so với các nhóm vi khuẩn khác. Tảo
Silic (diatom) có chứa lượng SiO
2
khá cao trong thành tế bào. Thành phần các nguyên tố hoá học còn
thay đổi trong một phạm vi nhất định tuỳ thuộc vào tuổi nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy. Khi nuôi cấy
trên các môi trường có nguồn N phong phú thì lượng chứa N trong tế bào sẽ cao hơn so với khi nuôi
cấy trên các môi trường nghèo nguồn N.
Các nguyên tố hoá học chủ yếu tồn tại trong tế bào vi sinh vật dưới dạng chất hữu cơ, chất vô cơ
và nước. Chất hữu cơ thường bao gồm protein, carbon hydrat, lipid, acid nucleic, vitamin và các sản
phẩm phân giải của chúng cũng như các chất trao đổi chất. Để phân tích các thành phần hữu cơ trong
tế bào thường sử dụng hai phương pháp: một là, dùng phương pháp hoá học để trực tiếp chiết rút
từng thành phần hữu cơ trong tế bào, sau đó tiến hành phân tích định tính và định lượng. Hai là, phá
thành tế bào, thu nhận các thành phần kết cấu hiển vi rồi phân tích thành phần hoá học của từng kết
cấu đó. Chất vô cơ thường đứng riêng rẽ dưới dạng muối vô cơ hoặc kết hợp với chất hữu cơ. Khi
phân tích thành phần vô cơ trong tế bào người ta thường phân tích tro sau khi đã nung tế bào ở nhiệt
độ 550
0
24 609 802
2 350 000
4 300
22 000 000
2,1
255 500
1
khoảng 2500
khoảng 1850
2 (2)
4 (3)
1
khoảng 660
khoảng 350
khoảng 100
khoảng 50
khoảng 200
khoảng 18Chú thích:
(1) -Khối lượng khô của tế bào vi khuần Escherichia coli đang sinh trưởng là khoảng 2.8 x 10
-13
g.
(2) - Giả thiết Peptidoglycan và Glycogen là 2 thành phần chủ yếu.
(3) - Tế bào chứa vài loại phospholipid, do tính đa dạng của thành phần acid béo giữa các chi vi
khuẩn khác nhau và do ảnh hưởng của điều kiện sinh trưởng mà có nhiều hình thức tồn tại của mỗi
đường (phụ phẩm của nhà máy đường) tinh bột (bột ngô, bột khoai sắn...), cám gạo, các nguồn
cellulose tự nhiên hay dịch thuỷ phân cellulose.
Năng lực đồng hoá các nguồn C ở các vi sinh vật khác nhau là không giống nhau. Có loài có khả
năng sử dụng rộng rãi nhiều nguồn C khác nhau, nhưng có loài khả năng này rất chọn lọc. Chẳng hạn
vi khuẩn Pseudomonas có thể đồng hoá được tới trên 90 loại hợp chất C, nhưng các vi khuẩn thuộc
nhóm dinh dưỡng methyl (methylotrophs) thì chỉ đồng hoá được các hợp chất 1C như methanol,
methane...
Nguồn C chủ yếu được vi sinh vật sử dụng gồm có đường, acid hữu cơ, rượu, lipid, hydrocarbon,
CO
2
, carbonat... (Bảng 13.4)
Bảng 13.4: Nguồn C được vi sinh vật sử dụng
Nguồn C Các dạng hợp chất
Đường glucose, fructose, maltose, saccharose, tinh bột, galactose, lactose, mannite,
cellobiose, cellulose, hemicellulose, chitin...
Acid hữu cơ acid lactic, acid citric, acid fumaric, acid béo bậc cao, acid béo bậc thấp,
aminoacid...
Rượu ethanol
Lipid lipid, phospholipid
Hydrocarbon khí thiên nhiên, dầu thô, dầu paraffin
Carbonate NaHCO
3
, CaCO
3
, đá phấn
Các nguồn C
khác
Hợp chất nhóm thơm, cyanide, protein, pepton, acid nucleic...
Hình 13.1: Sản lượng sinh trưởng tối ưu khi vi sinh vật dị dưỡng
sử dụng các nguồn C khác nhau
–30
e
36 4 34 17 - 10
DNA
d
3 1
c
–5
f
36 4 34 17 - 10
peptidoglycan 3 0
g
–20
h
47 6 40 7 - -
Phospholipit 9 0
i
-15 67 7 19 2 - 5
Lipopolysaccharide 3 0
h
-4
j
55 10 30 2 - 3
Lipit trung tính - 0-45
k
77 12 11 - - -
Acid Teichoic - 0
l
-5
d
i. Các chủng thay thế nguồn phospholipid bằng các chất tương tự chứa P tự do, trong điều kiện
hạn chế nguồn P
j. Vi khuẩn Gram(-)
k. Các tế bào trong điều kiện hạn chế nguồn N.
l. Hạn chế nguồn P.
m. PHA (polyhydroxyaldehyde) chứa 3-hydroxyoctanoic acid.
n. Một số nấm men và vi khuẩn.
o. Một số vi khuẩn lam có nguồn dự trữ N cyanophycin [(asp-arg)].
n
*PHB= Poly- β- hydroxy butyrate
2) Nguồn N (source of nitrogen)
Nguồn N là nguồn cung cấp N cho vi sinh vật để tổng hợp nên các hợp chất chứa N trong tế bào.
Thường không là nguồn năng lượng, chỉ một số ít vi sinh vật tự dưỡng (thuộc nhóm ammon hoá-
ammonification, nhóm nitrate hoá- nitrification) dùng muối ammone, muối nitrate làm nguồn năng
lượng. Trong điều kiện thiếu nguồn C một số vi sinh vật kỵ khí trong điều kiện không có oxy có thể
sử dụng một số aminoacid làm nguồn năng lượng. Nguồn N thường được vi sinh vật sử dụng là
protein và các sản phẩm phân huỷ của protein ( peptone, peptide, aminoacid...), muối ammone,
nitrate, N phân tử (N
2
), purine, pyrimidine, urea, amine, amide, cyanide...(bảng 13.7)
Bảng 13.7: Nguồn N được vi sinh vật sử dụng
Nguồn N
Các dạng hợp chất
Protein và các sản phẩm
phân giải của protein
peptone, peptide, aminoacid... (một số vi sinh vật tiết men proteinase
phân giải protein thành các hợp chất phân tử nhỏ hơn rồi mới hấp thu
được vào tế bào)
Ammone và muối
sau khi được tế
bào hấp thu có thể được trực tiếp sử dụng, do đó các nguồn muối ammone được coi là nguồn N tốc
hiệu. Còn nitrate sau khi được hấp thụ cần khử thành NH
4
+
rồi mới được vi sinh vật sử dụng. Đa số
các vi khuẩn hoại sinh (saprophyte), vi khuẩn đường ruột, vi sinh vật gây bệnh ở người, động vật,
thực vật...đều có thể dùng muối ammone, muối nitrate làm nguồn N. Chẳng hạn các vi khuẩn
Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa...đều có thể sử
dụng nguồn (NH
4
)
2
SO
4
và NH
4
NO
3
làm nguồn N; xạ khuẩn có thể sử dụng KNO
3
làm nguồn N; nấm
sợi có thể sử dụng KNO
3
làm nguồn N. Lúc dùng các muối như (NH
4
)
2
SO
4
4
,
K
2
HPO
4
Là thành phần của acid nucleic, nucleoprotein, phospholipid,
coenzyme, ATP... Làm nên hệ thống đệm giúp điều chỉnh pH
môi trường.
S
(NH
4
)
2
SO
4
,
MgSO
4
Là thành phần của các aminoacid chứa S, một số vitamin;
glutathione có tác dụng điều chỉnh điện thế oxy hoá khử
trong tế bào.MgMgSO
,
KH
2
PO
4
Là cofactor của một số enzyme, duy trì áp suất thẩm thấu của
tế bào, là nhân tố ổn định của ribosome ở một số vi khuẩn ưa
mặn.FeFeS0
4
Thành phần của sắc tố vi khuẩn và một số enzyme, là vật
chất nguồn năng lượng của một số vi khuẩn sắt, cần thiết để
tổng hợp chlorophyll và độc tố vi khuẩn bạch hầu.
Trong quá trình sinh trưởng vi sinh vật còn cần tới một số nguyên tố vi lượng. Những nguyên tố
này cũng có vai trò quan trọng mặc dầu chỉ cần với số lượng rất nhỏ, khoảng 10
-8
-10
-6
mol/ L môi
trường nuôi cấy. Nguyên tố vi lượng tham gia vào thành phần enzyme và làm hoạt hoá enzyme.
(Bảng 13.9)
Bảng 13.9: Tác dụng sinh lý của nguyên tố vi lượng
Nguyên tố Tác dụng sinh lý
Zn Có mặt trong alcohol dehydrogenase, lactodehydrogenase, phosphatase
kiềm, ARNpolymerase, ADNpolymerase...
Streptococcus faecalis
APAB, Acid nicotinic
APAB
choline
pyridoxal
thiamin
b-alanin
uracil
acid nicotinic
acid pantothenic
methionine
0-10 ng
3 mg
0,15 ng
6 mg
0,025 mg
0,5ng
1,5 mg
0~4 mg
0,1 mg
0,02 mg
Copyright: Tài liệu đại học ©