Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
MÔN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM


TIỂU LUẬN

Định lượng E.coli bằng phương pháp
đếm khuẩn lạc
GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh
Nhóm thực hiện: Nhóm 5
Buổi: Thứ 3, tiết 11+12, phòng B106

TP. HCM, tháng 4 năm 2016

Trang 1

NHÓM 5

Tp.HCM, Tháng 05/2014


Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc

Mục lục
Chương III: ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP.......................................................................14


NHÓM 5

Trang 2


Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc
E.coli là trực khuẩn Gram (-). Kích thước trung bình từ 2 đến 3µm x 0,5µm;
trong những điều kiện không thích hợp (ví dụ như trong môi trường có kháng sinh) vi
khuẩn có thể rất dài như sợi chỉ. Rất ít chủng E.coli có vỏ, nhưng hầu hết có lông và
có khả năng di động.

NHÓM 5

Trang 3


Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc
1.2.2.

Tính chất nuôi cấy

E.coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Một số có
thể phát triển trên môi trường tổng hợp rất nghèo chất dinh dưỡng. Hiếu kỵ khí tùy ý.
Có thể phát triển ở nhiệt độ từ 5-400C. Nhiệt độ thích hợp xung quanh 370C.
Trong điều kiện thích hợp E.coli phát triển rất nhanh, thời gian thế hệ chỉ
khoảng 20 đến 30 phút. Cấy vào môi trường lỏng (như canh thang) sau 3 đến 4 giờ đã
làm đục nhẹ môi trường, sau 24 giờ làm đục đều; sau hai ngày trên mặt môi trường có

khuẩn lạc
Bảng 1.2: Tính chất hóa sinh của một số loài thuộc chi Escherichia
Các loài
E.coli

E.coli

(bình

(inactive

thường)
+
+
+

)
T
T
+

-

E.blatta

E.fergus

E.herma

e

-

-

-

-

-

T

T

-

-

-

T

T

+

+

-


+

+
+

+

+

+
+

+
+

+
+

+

+

-

+

+

+


+
+
+

+
+

vàng
ONPG: Ortho-nitrophenyl-beta-Dgalactopyranoside

+

T

-

Thử nghiệm
CNPG
Indole
Đỏ methyl
VogesProskauer
Citrate
(Simmons)
Lysine
decarboxylase
Arginine
dihydrolase
Ornithine
decarboxylase
Di động

thành 2 nhóm: thứ nhất là nhóm gây bệnh đường ruột (IPEC-intestinal pathogenic
E.coli) hay E.coli gây tiên chảy (DEC-Dierrheagenic E.coli), thứ hai là nhóm gây bệnh
ngoài đường ruột (ExPEC-extraintestinal pathogenic E.coli).
- Các loại E.coli gây bệnh đường ruột (IPEC) đã được biết gồm:
EPEC (Enteropathogenic E.coli): E.coli gây bệnh đường ruột
ETEC (Enterotoxigenic E.coli): E.coli sinh độc tố ruột
EIEC (Enteroinvasive E.coli): E.coli xâm nhập ruột
EAEC (Enteroaggregative E.coli): E.coli ngưng tập ruột
DAEC (Diffusely adherent E.coli): E.coli bám dính phân tán
EHEC (Enterohaemorrhagic E.coli): E.coli gây xuất huyết ruột
- Hai loại E.coli gây bệnh ngoài đường ruột quan trọng nhất là:
MAEC (Meningitidis-associated E.coli): E.coli gây viêm màng não
UPEC (Uropathogenic E.coli): E.coli gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu

1.4. Khả năng gây bệnh
E.coli là thành viên thuộc nhóm vi hệ bình thường của đường tiêu hóa, chiếm
tỷ lệ cao nhất trong số các vi khuẩn hiếu khí (khoảng 80%). Tuy nhiên, E.coli cũng là
1 vi khuẩn gây bệnh quan trọng, nó đứng đầu trong các vi khuẩn gây tiêu chảy, viêm
đường tiết niệu, viêm đường mật; đứng hàng đầu trong các căn nguyên gây nhiễm
khuẩn huyết. E.coli là căn nguyên thường gặp trong viêm màng não, viêm phổi ở trẻ
mới sinh. E.coli còn gặp trong nhiễm trùng ngoại khoa, nhiễm trùng trong bỏng. Theo
NHÓM 5

Trang 6


Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc
báo cáo của chương trình quốc gia giám sát tính kháng thuốc của các vi khuẩn gây
bệnh thường gặp (1988-1994) thì E.coli đứng thứ hai (sau S.aureus) về tỷ lệ phân lập

EPEC

nhiễm sắc thể (LEE)

Tiêu chảy

TTSS gồm: intimin (eaeA), các

cấp

protein tiết; Tir, EspA, EspB, EspD,
EspF, EspG và MAP (mitochondriaassociated protein)
EAST-1
CDT (Cytolethal distending toxin)
Các CFA mã hóa bởi plasmid: CFA-I Bám vào niêm mạc Tiêu chảy
(fimbriae cứng), CFA-III (tạo bó), ruột non (CFA I-IV) cấp, phân
CFA-II và CFA-IV (fimbriae mềm) và và sản xuất các độc tố thường
ETEC

pili dài liên quan với type IV

ruột LTI, LTII, STa, toàn nước
STb

Độc tố chịu nhiệt LT I và LT II (mã
hóa bởi plasmid)

không có
nhầy máu


IpaD
Điểm

viêm loét hoại tử niêm
bám

dính

kết

tập

mạc đại tràng
AAF AAF tạo nên kiểu bám Tiêu chảy

(aggregative adhesion fimbriae)

dính hình chồng gạch

kéo dài

aggR điều hòa sự biểu
Yếu tố điều hòa bám dính kết tập aggr

hiện của AAF

Protein pet

gây tích tụ dịch và gây
độc tố cho biểu mô


đại tràng)

- ức chế quá trình tổng
hợp protein của tế bào
biểu mô đại tràng, dẫn
đến làm chết tế bào,

Độc tố Shiga (Stx1, Stx2, Stx2v) mã - gây hội chứng HUS
hóa bởi các gen trên nhiễm sắc thể
NHÓM 5

Trang 8


Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc

DAEC

Các yếu tố bám dính Afa/Dr

Afa/Dr gây bám dính Tiêu chảy

(AIDA)

phân tán

EAST-1


1.5.2.

Phòng bệnh

Hiện nay chưa có phương pháp nào phòng bệnh đặc hiệu. Để đề phòng nhiễm
khuẩn đường tiêu hóa do E.coli, thực hiện các biện pháp phòng bệnh chung không
đặc hiệu giống như đối với các vi khuẩn đường ruột khác.
Thực hiện các biện pháp ngăn ngừa nhiễm trùng bệnh viên vì E.coli là một
trong các vi khuẩn gây bệnh cơ hội quan trọng.
Để phòng nhiễm khuẩn đường tiết niệu do E.coli: thực hiện vệ sinh vùng hậu
môn và bộ phận sinh dục ngoài, thực hiện nghiêm túc nguyên tắc vô trùng khi phải
tiến hành thăm dò hoặc đặt thông đường tiết niệu. Điều trị loại trừ các yếu tố nguy cơ
khác.

NHÓM 5

Trang 10


Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc

Chương II: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN
VÀ ĐỊNH LƯỢNG E.COLI
2.1. Phương pháp truyền thống
2.1.1. Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
 Nguyên tắc
Cấy một lượng mẫu xác định trên môi trường rắn chọn lọc thích hợp (thạch
TBX) chứa lactose và một chất chỉ thị pH. Đếm số khuẩn lạc lên men lactose tiêu
biểu sau khi ủ môi trường ở 44oC trong 24 giờ. Đếm các khuẩn lạc E.coli điển hình



Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc


Ưu điểm và nhược điểm

Ưu điểm:
- Khắc phục được nhược điểm của phương pháp đếm trực tiếp.
- Cho biết được số lượng vi sinh vật có trong mẫu.
Nhược điểm
- Dễ nhằm lẫn
- Độ chính xác không cao
- Không thích hợp cho huyền phù vi sinh vật có mật độ thấp.
2.2. Phương pháp hiện đại
2.2.1. Phương pháp PCR (polymerase Chain Reaction)
 Nguyên tắc
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp invitro
để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu khuếch đại, nhân
số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme
polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này.


Ưu điểm và nhược điểm:

Ưu điểm:
-

Thời gian cho kết quả nhanh.

 Ưu điểm của phương pháp Elisa
Ưu điểm:
- Nhanh chóng và thuận tiện .
- Kháng nguyên của nồng độ rất thấp hoặc không biết có thể được phát hiện kể từ
khi bắt giữ kháng thể chỉ lấy kháng nguyên cụ thể .
Nhược điểm:
-

Thời gian xét nghiệm lâu.
Chỉ có các kháng thể đơn dòng có thể được sử dụng như cặp phù hợp.
Kháng thể đơn dòng có thể chi phí nhiều hơn so với các kháng thể đa dòng.
Enzyme / chất nền phản ứng trong microwells phải được đọc càng sớm càng tốt

NHÓM 5

Trang 13


Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc

Chương III: ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐẾM KHUẨN LẠC
3.1. Phạm vi áp dụng
Phương pháp này tham chiếu theo tiêu chuẩn ISO 16649 – 2:2001 được áp
dụng cho tất cả các loại thực phẩm.
3.2. Nguyên tắc
Cấy một lượng mẫu xác định trên môi trường rắn chọn lọc thích hợp (thạch
TBX) chứa lactose và một chất chỉ thị pH. Đếm số khuẩn lạc lên men lactose tiêu
biểu sau khi ủ môi trường ở 44oC trong 24 giờ. Đếm các khuẩn lạc E.coli điển hình

Muối mật No.3

1,5 g

Axit 5-bromo-4-clo-3-indolyl-β-D-glucuronid (BCIG)
Dimetyl sulfoxit (DMSO)(b)

144 μmol(a)
3 ml

Thạch

9 g đến 18 g(c)

Nước

1 000 ml

(a) Ví dụ: 0,075 g muối xyclohexylamoni.
(b) Dimetyl sulfoxit là rất độc khi hít hoặc tiếp xúc phải. Cần sử dụng trong tủ hút
khói. Vì độc tính đó nên nhà sản xuất khuyến cáo dùng dung dịch pha loãng.
(c) Phụ thuộc vào sức đông của thạch.

 Chuẩn bị
Hòa tan BCIG trong dimety sulfoxit hoặc trong dung dịch loãng theo khuyến
cáo của nhà sản xuất. Hòa tan tất cả các thành phần trên trong nước và đun đến sôi.
Chỉnh pH để sau khi khử trùng pH phải là 7,2 ± 0,2 ở 25 oC, nếu cần.
Khử trùng môi trường 15 phút ở nhiệt độ 121oC trong nồi hấp áp lực. Làm
nguội ngay môi trường trên nồi cách thủy đến khoảng từ 44 oC đến 47 oC.
 Mục đích

Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc
Lắc huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng bằng máy vortex để tránh
các phần tử có vi sinh vật lắng xuống.

Hình 3.4.2:Túi nhựa dập mẫu có màng lọc

Hình 3.4.3: Máy dập mẫu

Hình 3.4.4: Hút lấy mẫu bằng Micropipet
Bước 2. Pha loãng mẫu
Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu vời sai số ±5% cho vào một
ống nghiệm chứa 9ml dịch pha loãng SPW vô trùng ở nhiệt độ thích hợp.
Trộn kỹ bằng máy vortex trong 5 – 10 giây để thu được dung dịch pha loãng
10-2 (đối với các loại mẫu làm từ nguyên chất thì thu được dung dịch pha loãng là 10 1

). Nếu cần, lặp lại thao tác trên để có được dung dịch pha loãng 10 -3, 10-4, 10-5,… cho

đến khi thu được lượng vi khuẩn thích hợp.

NHÓM 5

Trang 17


Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc

Hình 3.4.5: Quy trình pha loãng
Bước 3. Cấy và ủ mẫu

NHÓM 5

Trang 19


Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc
: Số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ hai
d: hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất

KẾT LUẬN
Hiện nay, ngộ độc thực phẩm đã trở thành mối quan tâm của toàn xã hội. Có
nhiều nguyên nhân gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm nhưng phần lớn các trường hợp
có nguồn gốc từ vi sinh vật.
Ngộ độc thực phẩm thường xảy ra do nguyên liệu dùng chế biến hay thực
phẩm bị nhiễm vi khuẩn và độc tố của vi khuẩn. Một trong những loại ngộc độc thực
phẩm gây ra bởi vi sinh vật thường gặp là ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn E.coli.
Trong thực tế cuộc sống, theo dõi khảo sát đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm
để hạn chế sự ô nhiễm và tác hại của vi khuẩn trong quá trình thu hoạch các sản phẩm
nông nghiệp, chăn nuôi, đánh bắt hải sản đến quá trình ‘bảo quản chế biến và nấu
nướng tới tay người tiêu dùng thường rất phức tạp và gặp nhiều khó khăn.
Do đó các phương pháp phát hiện vi khuẩn E.coli có vai trò quan trọng trong
nhiệm vụ đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm nhằm làm giảm tỷ lệ ngộ độc do vi
khuẩn gây nên.

NHÓM 5

Trang 20