BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

HỒ THỊ HẢO

HỒ THỊ HẢO

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN
AXIT LACTIC TỪ TINH BỘT HẠT MÍT
NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN
AXIT LACTIC TỪ TINH BỘT HẠT MÍT
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG
Mã số:

60 54 02

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS.TRƯƠNG THỊ MINH HẠNH

Đà Nẵng – Năm 2011

Đà Nẵng - Năm 2011


Phản biện 2: PGS.TS. PHẠM NGỌC ANH

Tên bảng

Trang

1.1

Hình thái và kiểu lên men lactic của một số vi khuẩn lactic

11

1.2

Thành phần hóa học của hạt mít

21

2.1

Thành phần môi trường lên men axit lactic

28

2.2

Thành phần môi trường MRS Agar

29



2

3.6

Các ñiều kiện thí nghiệm TYT 2

Luận văn ñược bảo vệ trước hội ñồng chấm Luận văn tốt

3.7

Kết quả thí nghiệm theo thực nghiệm TYT 22

52

nghiệp thạc sĩ Kỹ thuật họp tại Đại Học Đà Nẵng vào ngày 23

3.8

Bảng giá trị tính phương sai dư

55

tháng 4 năm 2011.

3.9

Kết quả tính bước chuyển ñộng δ j của các yếu tố

56

3.9

Quá trình lên men lactic

44

3.10

Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến hàm lượng axit lactic tạo thành

45

3.11

Ảnh hưởng của tỷ lệ giống ñến lượng axit lactic tạo thành

46

Ảnh hưởng của nồng ñộ dịch ñường ñến hàm lượng axit lactic tạo

47

3.12

1.1

Hai dạng ñồng phân của axit lactic

5


1.6

Lactobacillus acidophilus

13

1.7

Streptococcus lactic

13

1.8

Thuốc Biolactyl

15

12

1.9

Cây mít

20

1.10

Hạt mít


36

3.3

Đường chuẩn glucoza

37

3.4

Dịch ñường sau thủy phân

39

3.5

Dịch ñường ñã khảo sát nồng ñộ trước lúc lên men

40

3.6

Các khuẩn lạc Lactobacillus casei ở các mức pha loãng 10-3

42

3.7

Đường cong biểu diễn mật ñộ tế bào ở các mức pha loãng



L.bulgaricus

: Lactobacillus bulgaricus:

L. acidophilus : Lactobacillus acidophilus
Opt

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Số liệu, kết quả báo cáo trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược
công bố ở bất cứ công trình nào khác.

Tác giả

: Optimum

Hồ Thị Hảo


-1-

-2-

MỞ ĐẦU

vào việc tận dụng các phế phẩm nông nghiệp như bã mía, bã ngô, lõi ngô, cám mỳ,
rơm rạ, rỉ ñường...[16],[23],[28],[36].
Mít là loại trái cây nhiệt ñới có giá trị. Quả mít ñã ñược sử dụng ñể ăn tươi từ

1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

cứu tổng hợp nhựa axit polylactic (PLA) – một loại nhựa sinh học từ axit lactic.
PLA là sự lựa chọn thích hợp thay cho nhựa có nguồn gốc từ dầu mỏ, vì nó vừa có
thể phân huỷ ñược, vừa ít ñộc tính ñối với con người. PLA ñược sử dụng làm
nguyên liệu sản xuất bao bì phân bón, thực phẩm và các loại bát, ñĩa dùng một lần.
Đặc biệt trong y học và dược học, kết hợp với sự phát triển của công nghệ sinh học
và di truyền, axit lactic ñược nghiên cứu nhằm sản xuất phục vụ những nhu cầu
thiết yếu về sức khỏe của con người. Trong phẫu thuật chỉnh hình, các hợp chất cao
phân tử tổng hợp từ axit lactic và những dẫn xuất của nó là những chất liệu cấy
ghép sinh học thích hợp và hiệu quả cao. Canxi lactat là loại dược phẩm nhằm bổ
sung canxi dưới dạng dễ hấp thu cho cơ thể. Sắt lactat ñược sử dụng ñể chữa bệnh thiếu
máu…[16], [28], [37].
Axit lactic ñược sản xuất từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như rỉ ñường,
củ cải ñường, nước mía, tinh bột... Nhằm ñể hạ chi phí sản xuất axit lactic, ngày
nay ñang có rất nhiều nghiên cứu thay thế nguồn cacbon và nitơ ñắt tiền trong môi
trường lên men bằng các nguyên vật liệu rẻ tiền hơn. Trong ñó, tập trung chủ yếu

nhiên sự hiểu biết về các thành phần dinh dưỡng còn hạn chế [35].
Quá trình nghiên cứu xác ñịnh thành phần dinh dưỡng của hạt mít ñã ñược
khảo sát trong thời gian gần ñây, trong hạt mít có chứa tới 77,76% tinh bột và là
một nguồn nguyên liệu rẻ tiền, sẵn có [38], [43]. Thủy phân tinh bột từ hạt mít ñể
lên men sản xuất cồn và axit lactic là một hướng mới nhưng chưa ñược nghiên cứu nhiều.
Việc tận dụng ñược nguồn phụ phẩm rẻ tiền, dễ kiếm, cũng như nhằm hạn
chế lượng chất thải trong quá trình chế biến, chống ô nhiễm môi trường là một
thiên hướng lớn ñối với các nhà nghiên cứu. Trong công nghệ sản xuất axit lactic,
việc sử dụng các nguồn nguyên liệu như ñường, rỉ ñường, nước mía ép, củ cải
ñường, tinh bột…ñã ñược nghiên cứu nhiều nhưng hiện nay việc sử dụng tinh bột
hạt mít ñể sản xuất axit lactic thì chưa thấy công bố.
Ở nước ta, việc sử dụng axit lactic trong công nghệ thực phẩm và phi thực
phẩm khá nhiều nhưng chủ yếu là thu mua từ nước ngoài với giá thành cao.
Nghiên cứu quá trình thủy phân tinh bột hạt mít (một nguồn phế phẩm công nghiệp

- Tận dụng lượng phế phụ phẩm trong quá trình chế biến các sản phẩm từ
quả mít ñể tạo ra nguồn nguyên liệu chính ñể sản xuất axit lactic.
- Giải quyết ñược vấn ñề ô nhiễm môi trường, bảo vệ sức khỏe cộng ñồng,
nâng cao hiệu quả kinh tế trong sản xuất.
- Tăng nguồn thu nhập cho người trồng mít
- Giảm lượng axit lactic ngoại nhập, chủ ñộng sản xuất, tiết kiệm ngoại tệ.
8. CẤU TRÚC CỦA LUẬN VĂN
Ngoài phần mở ñầu, kết luận và kiến nghị, tài liệu tham khảo, phụ lục, trong

xuất và chế phẩm γ-amylaza của Genencor Bio-products Co.Ltd, China sản xuất.

luận văn gồm có các chương sau:

- Sử dụng chủng vi khuẩn Lactobacillus casei ñể lên men dịch sau thủy phân.

+ Chương 1: Tổng quan.

4. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
- Sử dụng hạt mít ñược thu mua tại các ñầu mối nguyên liệu của Công ty cổ
phần Vinamit trên Daklak.
- Lên men axit lactic từ dịch thủy phân từ tinh bột hạt mít.
5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Phương pháp lấy mẫu, chuẩn bị mẫu và bảo quản mẫu.
- Phương pháp hóa lý
- Phương pháp hóa học
- Phương pháp hóa sinh
- Phương pháp vi sinh vật
- Phương pháp toán học
6. Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

ñược biết và sử dụng từ lâu ñời trong dân gian như: lên men chua rau quả, làm sữa chua…

Loại L-axit lactic ở dạng tinh thể không màu. Chúng có khả năng tan trong

Năm 1780 nhà bác học Thụy Điển Shale lần ñầu tiên ñã tách ñược axit lactic

nước, tan trong cồn etylic, tan trong eter, không tan trong CHCl3. Nhiệt ñộ nóng

từ sữa bò lên men chua. Năm 1857 Pasteur ñã chứng minh ñược sự lên men chua
sữa là do nhóm vi khuẩn lactic. Năm 1878 Lister phân lập thành công vi khuẩn
lactic ñầu tiên và ñặt tên là Bacterium lactis, nay gọi là Streptococus lactic. Về sau
các nhà khoa học liên tiếp phân lập ñược nhiều loại vi khuẩn lactic khác nhau. Từ
ñó công nghiệp lên men sản xuất axit lactic ñược hình thành từ năm 1881 [1], [3].

chảy là 28oC, góc quay cực ở 15oC là 2,67o.
Loại D-axit lactic là dạng tinh thể, tan trong nước, tan trong cồn. Nhiệt ñộ
nóng chảy là 28oC, nhiệt ñộ sôi 103oC, góc quay ở 15o là -2,26o.
Nếu D-axit lactic và L-axit lactic có trong hỗn hợp theo tỉ lệ 50:50, người ta
gọi là hỗn hợp raxemic. Hỗn hợp này ñược kí hiệu là DL-axit lactic. Trong quá

Ngày nay, việc sản xuất và tiêu thụ axit lactic trên thế giới khá nhiều. Vì axit

trình lên men không có một hỗn hợp lý tưởng này mà chỉ có ñược hỗn hợp này khi

lactic ñược lên men từ nhiều nguyên liệu khác nhau, chủ yếu là những nguyên liệu

tiến hành tổng hợp hữu cơ. DL-axit lactic là dịch lỏng dạng sino, có khả năng tan

có chứa tinh bột, ñường và nguyên liệu có khả năng chuyển hóa thành ñường. Hơn


và các hợp chất trung gian. Tùy thuộc vào các sản phẩm tạo thành mà quá trình lên
men lactic ñược chia thành 2 loại: lên men lactic ñồng hình và lên men lactic dị
hình [8], [11].
Lên men lactic ñồng hình, thực tế chỉ xuất hiện axit lactic, còn trong lên men
dị hình các sản phẩm cuối cùng khá ña dạng: axit lactic, etanol, axit axetic và CO2.
Chỉ có lên men lactic ñồng hình là có ý nghĩa về mặt công nghiệp.

Hình 1.1. Hai dạng ñồng phân của axit lactic [52].


-7-

-8-

Các vi khuẩn lactic ñồng hình phân giải glucose theo con ñường EMP [3].

Glucose

Tùy thuộc vào tính chuyển hóa không gian của men xúc tác cho phản ứng tạo axit

Gluco-6- photphat

lactic, lactac dehdrogenase, và tùy vào sự tồn tại của men lactate-racemase mà có
Fructo-1,6-diphotphat

thể xuất hiện các dạng decacboxyl hóa và chuyển thành axit axetic, etanol và CO2

Glyceraldehyt-3-photphat
Dihydroaxeton photphat
NAD

NADH2

- Giai ñoạn thứ hai, là giai ñoạn phát sinh năng lượng. Giai ñoạn này gồm

NAD

những phản ứng còn lại. Ở giai ñoạn này, các trizophotphat sẽ ñược hoạt hóa tiếp

Lactat

ñể tạo thành hai hợp chất chứa các liên kết photphat cao năng 1,3diphotphoglycerat và photpho enolpiruvat. Cả hai hợp chất này ñược coi như hợp
chất siêu cao năng lượng. Hai chất này sẽ chuyển photpho cao năng cho ADP ñể
tạo thành ATP. Quá trình này ñược gọi là photphoril hóa ở mức cơ chất.
Lượng axit lactic tạo thành chiếm hơn 90%. Chỉ một lượng nhỏ pyruvat bị
khử cacbon ñể chuyển thành axit lactic, etanol, CO2 và axeton [1], [3].
Phương trình phản ứng tạo axit lactic: C6H12O6 = 2CH3CHOHCOOH
+225cal. Sự lên men lactic ñồng hình ñược biểu diễn theo sơ ñồ sau:

Hình 1.2. Lên men axit lactic ñồng hình nhờ các phản ứng theo con ñường EMP [3].
Các vi khuẩn lactic dị hình thiếu các enzyme chủ yếu của con ñường EMP,
do bị ñột biến một hoặc nhiều hơn một enzyme của con ñường này, ñó là aldolase
và trizophotphatizomerase.


-9-

- 10 -

Sự lên men lactic dị hình xảy ra khi vi khuẩn gây lên men thiếu enzyme cơ bản
của sự ñường phân là aldolase và trioso isomerase. Khi ñó, glucose ñược chuyển hoá

Vi khuẩn lactac có chung các ñiểm như: bắt màu gram (+), không di ñộng,

tác nhân gây lên men lactic dị hình là Lactobacillus brevis, Leuconostoc mensenteroides.

không tạo bào tử (dù vậy, ngày nay người ta tìm thấy một số vi khuẩn sinh axit


- 11 -

- 12 -

lactic có khả năng tạo bào tử), nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, kị khí tùy ý, tế bào

Nhóm vi khuẩn lactic bao gồm nhiều loài khác nhau về hình dạng, song về

không chứa cytochobrom và enzyme catalase, lên men tổng hợp axit lactic [1], [5].

mặt sinh lý và khả năng lên men chúng tương ñối ñồng nhất. Môi trường sinh

Bảng 1.1. Hình thái và kiểu lên men lactic của một số vi khuẩn lactic [1], [3].

trưởng của chúng ngoài gluxit, khoáng, muối amon, photphat còn cần vitamin

Giống vi sinh vật

Kiểu

Sản phẩm chính Cấu hình

lên men


lactat

D(-)

L. delbrueckii

ñồng hình

latcat

D(-)

L.casei

ñồng hình

latcat

- Thuộc loại trực khuẩn nhỏ, có kích thước rất ngắn.
Chúng có thể tạo chuỗi, không di ñộng, gram (+).
- Có khả năng lên men một số loại ñường như
glucose, fructose, galactose, maltose, mannose, lactose.
- Trong quá trình lên men chúng tạo ra L-axit lactic
Hình 1.4. Lactobacillus casei [52]

L(-)

L. plantarum


Bifidobacterium bifidum

dị hình

lactat: acetat(2:3)

L(+)

- Lactobacillus casei thuộc nhóm các vi khuẩn lên men lactic ñồng hình.
Cấu trúc tế bào của lactobacillus casei thường thẳng, hình que và sắp xếp
theo dây chuyền. Kích thước tế bào khoảng 0,7-1,1 x 2,0-4,0 micrometer. Nó thuộc
dạng yếm khí tùy tiện. Điều này có nghĩa nó là một sinh vật có khả năng phát triển
trong cả hai môi trường hiếu khí và kỵ khí, nhưng phát triển tốt hơn và nhanh hơn
trong sự hiện diện của oxygen.

Cầu khuẩn
Stretoccus

ñồng hình

lactat

L(+)

S. faeclis

ñồng hình

lactat


lactat

L(+)

S. diacetilactics

ñồng hình

lactat

L(+)

Pediococcus cerevisiae

ñồng hình

lactat

DL

Leuconostoc cremoris

dị hình

Leuconostoc mesenteroides

1.2.2. Một số vi khuẩn lactic ñiển hình
Lactobacillus casei:

Trực khuẩn

Lactobacillus bulgaricus:

Ứng dụng vi khuẩn lactic ñể len men sữa chua: nhiều loại vi khuẩn lactic

- Thuộc loại trực khuẩn có kích thước rất dài, liên kết với nhau tạo thành
chuỗi, gram (+).

ñược ñưa vào quá trình sản xuất sữa chua. Sự lên men lactic trong quá trình sản
xuất vừa tăng giá trị dinh dưỡng vừa có tính chất chữa bệnh ñường ruột giúp ăn

- Chúng không có khả năng di ñộng

ngon miệng, dễ tiêu hóa vừa có tác dụng bảo quản lâu hơn sản phẩm sữa khỏi bị hư hỏng.

- Chúng có khả năng lên men ñược các loại ñường
như glucose, lactose, galactose, fructose

Ứng dụng ñể sản xuất dưa chua: muối chua rau quả là một quá trình hoạt
ñộng của vi khuẩn lactic và vi khuẩn axetic. Trong rau quả, vi khuẩn sẽ phát triển

- Chúng không có khả năng tạo ra nitrit từ nitrate.
Hình 1.5. L.bulgaricus [52]

tạo axit lactic và axit axetic cùng với một số chất hữu cơ khác. Các axit hữu cơ này
làm giảm pH của dịch, chống lại sự phát triển của các vi sinh vật gây thối làm hư

Lactobaciilus acidophilus:

thối rau quả. Bên cạnh ñó, nhờ có lượng axit hữu cơ tạo thành sẽ làm tăng hương vị


- Nhiệt ñộ phát triển tối ưu là 45 – 50oC.

men lactic tạo pH thích hợp cho sản phẩm và làm tăng hương vị cho sản phẩm.
Ứng dụng sản xuất ñậu phụ: giai ñoạn kết tủa protein của ñậu trong quá trình
sản xuất ñậu phụ theo phương pháp truyền thống thường dùng nước dưa chua (có vi
khuẩn lactic) ñể tạo kết tủa nhờ pH giảm ñến ñiểm ñẳng ñiện của protein ñậu nành.

Streptococcus lactic:

Ứng dụng ñể sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa: các sản phẩm sữa có sử

- Có dạng hình cầu, dạng chuỗi

dụng lên men lactic thông thường là: sữa chua uống, sữa chua ăn, phomat, bơ…Các

- Nhiệt ñộ thích hợp phát triển: 30oC

qúa trình biến ñổi và chuyển hóa trong sản xuất ñều làm cho sản phẩm thêm giàu

- Chúng lên men ñược các loại ñường như:
glucose, maltose, rhamnose, lactose.

Hình 1.7. Streptococcus lactic[52]

dinh dưỡng và tạo cho sản phẩm có hương vị ñặc trưng.
Ứng dụng ñể ủ thức ăn cho gia súc: về nguyên tắc trên các loại cỏ, lá cây có

1.3. Ứng dụng của axit lactic

chứa các chất dinh dưỡng phù hợp với vi khuẩn lactic nên khi tiến hành ủ các loại


biolactyl. Sản phẩm này chuyên trị tiêu chảy bằng
một nhóm nhiều vi khuẩn lactic.

Chất dẻo trong tương lai: người ta ñã nghiên cứu những chất dẻo mới thay
thế cho chất dẻo cũ khó bị phân hủy. Chất dẻo mới này là một loại polymer có tên

Hình 1.8. Thuốc Biolactyl [50]

gọi là axit polylactic (PLA). Đó là sản phẩm ñược tạo ra nhiều loại vật liệu ứng

Ứng dụng axit lactic theo phương pháp vi lượng ñồng cân (homeopathy):

dụng trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau như: công nghiệp dệt, công nghiệp

trong quá trình vận ñộng của cơ thể, mô cơ hoạt ñộng mạnh và trong một thời gian

thuộc da, công nghiệp bao bì…Những vật liệu này sau khi vứt bỏ chúng sẽ bị phân

dài sẽ gây ra hiện tượng mệt mỏi. Hiện tượng mệt mỏi này do các phản ứng sinh

hủy bởi vi sinh vật, không gây ô nhiễm môi trường [13], [16], [17].

hóa xảy ra trong mô cơ, tạo axit lactic. Các thầy thuốc ñã tạo ra một vị thuốc bao

1.3.4. Ứng dụng trong mỹ phẩm

gồm axit lactic kết hợp với cây kim sa có khả năng giúp cơ thể không còn mệt mỏi
và có khả năng làm việc trong thời gian dài.
Ứng dụng axit lactic trong phẩu thuật chỉnh hình, người ta thường sử dụng


Sau ñó có nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới ñã nghiên cứu và khảo sát lên men

ñang nghiên cứu tạo ra những vật liệu sinh học dùng trong y học bằng các

sản xuất axit lactic từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau. Vi khuẩn lên men chủ yếu

copolymer của axit lactic. Các copolymer này có tính năng rất giống những bộ

từ nguồn cacbon chính là dịch ñường, từ một số nguyên liệu có khả năng chuyển biến

khung xương ñộng vật. Hướng này ñang ñược nghiên cứu và trong tương lai nó sẽ

thành ñường. Năm 2001, Hassan K. Sreenath, AnaB.Moldes, RichardG. Koegel

ñược ứng dụng nhiều.

& Richard J. Straub, Sản xuất axit lactic từ chất thải nông nghiệp [36]. Năm
2003, Takashi Ueno, Yasuhiro Ozawa, Masaki Ishikawa, Kotoyoshi Nakanishi &
Toshinori Kimura, Sản xuất axit lactic từ chất thải thực phẩm như bã dứa (từ dứa


- 17 -

- 18 -

ñóng hộp) và bã nho (từ sản xuất vang nho) [39]. Năm 2006, Walaiporn

liệu khác nhau ñể có thể lên men axit lactic thì khá phong phú như rỉ ñường, ñường


1.6.1. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng

- Năm 2007, Se´ bastien Givry Vincent Prevot Francis Duchiron, sản

1.6.1.1. Nguồn cacbon

xuất axit lactic từ thủy phân hemicenllulo bởi các tế bào của Lactobacillus

Nguồn cacbon có ý nghĩa hàng ñầu trong sự sống sinh vật, thức ăn chủ yếu

bifermentans cố ñịnh trong Alginat- Ca bằng cách sử dụng phương pháp phản

cùa vi sinh vật hyñrocacbon. Trao ñổi, chuyển hóa hyñrocacbon ñáp ứng ba nhu

ứng bề mặt [22].

cầu của tế bào: sản sinh ra năng lượng, tạo ra những tiền chất, tạo ra các quá trình

Hầu hết các ñề tài nghiên cứu ñều tập trung sản xuất axit lactic từ nhiều

oxy hóa-khử ñể biến ñổi những tiền chất thành các sản phẩm trung gian hoặc sản

nguồn nguyên liệu khác nhau. Nhưng chưa có ñề tài nào dùng tinh bột từ hạt mít ñể

phẩm cuối cùng dùng ñể xây dựng tế bào, ñồng thời tích tụ trong môi trường một

lên men lactic.

hoặc một vài sản phẩm sinh tổng hợp thừa [1], [3].


1.6.1.3. Ảnh hưởng của photphat vô cơ

nghiên cứu ở một số Trường Đại Học tuy không nhiều. Năm 2009, tại trường Đại

Tất cả các hoạt ñộng của tế bào ñều cần năng lượng, nguồn năng lượng ñược

Học Bách Khoa Thành Phố Hồ Chí Minh, Nguyễn Minh Hiền, Nguyễn Thúy

tích trữ chủ yếu ở các liên kết cao năng với gốc phosphat. Vì thế các gốc này có vai

Hương, Nghiên cứu quá trình thủy phân tinh bột hạt mít bằng enzyme Termamyl

trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa năng lượng của hệ thống sinh học ở tế

120L và AMG 300L ñể lên men rượu chưng cất [42].

bào [1], [3].

Như vậy, việc sử dụng axit lactic hiện nay ở nước ta rất nhiều, trong khi ñó
quá trình lên men sản xuất axit lactic thì còn hạn chế. Hơn nữa, các nguồn nguyên


- 19 -

1.6.1.4. Ảnh hưởng của nguồn muối khoáng
Môi trường tổng hợp ñòi hỏi phải bổ sung các nguyên tố khoáng cần thiết.

- 20 các dung dịch thường xuyên có ion H+ tự do. Nồng ñộ H+ trong môi trường dinh
dưỡng có ảnh hưởng lớn ñến sự trao ñổi chất và phát triển của vi sinh vật.


hàng loạt các yếu tố khác nhau, tác ñộng qua lại với nhau và với môi trường bên
ngoài. Ảnh hưởng của các yếu tố bên ngoài thường thể hiện dưới dạng thích hợp

Đây là một loại cây ăn quả ñược trồng ở vùng
nhiệt ñới hoặc cận nhiệt ñới.

hay không thích hợp cho hoạt ñộng của tế bào và các enzyme trong chuỗi trao ñổi
chất [1], [3].

Cây mít không thể phát triển ở vùng có
khí hậu lạnh

1.6.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ
Hoạt ñộng trao ñổi chất của vi sinh vật có thể coi là kết quả của các phản

Một số ñiều kiện về khí hậu thổ nhưỡng
của cây mít:
Hình 1.9. Cây mít [51].

ứng hóa học. Vì các phản ứng này phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt ñộ nên yếu tố nhiệt

-

Độ cao: từ mực nước biển – 1600m

ñộ rõ ràng ảnh hưởng sâu sắc ñến các quá trình sống của tế bào. Tế bào thu ñược

-

Lượng mưa: 1000 – 2400mm

1.6.2.2. Ảnh hưởng của pH
Vi sinh vật sống và phát triển trong các môi trường lỏng chịu ảnh hưởng trực
tiếp hoặc gián tiếp của các ion H+ và OH- do các phân tử nước phân ly ra. Trong

Hạt mít ñược coi là phế phụ phẩm trong
quả mít, hạt mít chiếm khoảng 10 – 15% tổng
khối lượng của trái mít.

Hình 1.10. Hạt mít [45].


- 21 -

- 22 -

Hạt mít ñược chứa bên trong múi mít và ñược bao bọc trong một lớp vỏ mỏng
màu trắng. Hạt mít tươi thường có màu nâu sáng cho ñến nâu, có hình bầu dục hoặc
hình tròn.

1.7.2. Tinh bột hạt mít
Từ bảng 1.2, tôi thấy hàm lượng tinh bột trong hạt mít ñạt tới 77.76 ±0.96%
so với tổng số hàm lượng chất khô có trong hạt. Dưới kính hiển vi ñiện tử quét

Chiều dài hạt khoảng 2 – 3 cm (0.8 – 1.2 inch), ñường kính khoảng 1.0 –
1.5cm (0.4 – 0.6 inch). Trung bình trong một quả mít có 100 – 500 hạt. Hạt mít có

(SEM), và kính hiển vi quang dưới ánh sáng bình thường cho thấy các hạt tinh bột
có hình tròn và hình vuông là chiếm ưu thế (hình 1.11). [19].

thể bảo quản trong thời gian một tháng nếu ñược bảo quản trong ñiều kiện lạnh và

0.99 ± 0.08

2.2

Xơ thô

2.36 ± 0.04

1.67 ± 0.11

3.06

3.97 ± 0.04

3.92 ± 0.03

3.6

81.64

82.25

74

Hàm lượng tinh bột

77.76 ± 0.96

-


Tro
Carbonhydrat tổng số

(a)

Hình 1.11. Hình chụp cấu hình phân tử tinh bột hạt mít [19]


- 23 -

- 24 -

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Một số thiết bị thông dụng khác như: Tủ cấy Laminar; Nồi hấp thanh trùng
Hirayama HVE-50; Cân ñiện tử Excell; Tủ ấm Memmert; Máy lắc Edmund Buhler
Gmbtt… (phụ lục 2.1)

2.1. Đối tượng nghiên cứu

- Dụng cụ, vật liệu dùng trong thực nghiệm (phụ lục 2.2)
Hóa chất: Sử dụng các hóa chất trong phòng thí nghiệm Trường Đại học

2.1.1. Hạt mít
Hạt mít ñược thu mua tại một số cơ sở bóc múi mít cung cấp cho Công ty
Vianamit - tại thị xã Buôn Hồ, huyện Krôngbuk, tỉnh Daklak.
2.1.2. Enzyme thủy phân

Bách Khoa Đà Nẵng và một số hóa chất liên quan mua tại Đà Nẵng và TP. Hồ Chí
Minh (phụ luc 1.1 và 1.2)


ñể xác ñịnh hàm lượng tinh bột của hạt mít, xem phụ lục 3.1 và 3.2
2.2.1.2. Xác ñịnh hàm lượng ñường khử bằng phương pháp Graxianop [6]

dụng. Chúng tôi bảo quản chủng vi khuẩn này ở ñiều kiện 0-5oC trong suốt thời gian nghiên cứu.

Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng

2.1.4. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất trong quá trình nghiên cứu

2K3Fe(CN)6 + 2KOH

2K4Fe(CN)6 +H2O + O

Thiết bị:

Tiếp theo oxi hóa ñường ñể tạo thành axit ñường

- Tủ sấy: dùng ñể sấy nguyên liệu và dụng cụ

CH2CH(CHOH)4 + O

- Máy so màu

Phản ứng tổng quát là:

COOH(CHOH)4COOH

4K3Fe(CN)6 + 4KOH + CH2CH(CHOH)6CHO


- Axit sunfuric ñậm ñặc

khuẩn là 6.0…).

- Axit sunfuric 10%

Cách tiến hành xem phụ lục 3.3

- Dung dịch chì axetat basic: + Chì axetat Pb(CH3COO)2 300gam
+ Chì oxyt (bột)

100gam

+ Nước cất

700gam

Nghiền nát chì axetat, cho vào chậu sứ với chì oxyt và nước cất, khuấy cho
ñến khi tan hoàn toàn. Lọc và bảo quản trong chai nút kín.
- Dung dịch para oxydiphenyl 0,75%
+ Para oxydiphenyl 0,75gam
+ NaOH 2% vừa ñủ 100ml
Cách tiến hành và tính toán theo phụ lục 3.5.
2.2.1.4. Xác ñịnh hàm lượng ñường khử bằng phương pháp so màu sử dụng acid
dinitro salicylic (DNS) [6].
Mục ñích: Nhằm kiểm tra và ñiều chỉnh nồng ñộ dịch ñường sau thủy phân
ñể thuận lợi cho quá trình lên men.

2.2.1.6. Xác ñịnh hoạt lực của γ-amilaza theo phương pháp vi lượng của
V.Y.Rodzevich, O.P.Korenbiakina [6]

trong dịch chế phẩm nghiên cứu tới các dextrin có phân tử lượng khác nhau. Đo
cường ñộ màu tạo thành giữa tinh bột và các sản phẩm thủy phân của nó với iot
bằng máy so màu quang ñiện sẽ tính ñược hoạt ñộ enzyme.

nâu ñồng thời không lưu lại mùi xút (mùi ñặc trưng của NaOH) trong bột hạt mít
thành phẩm. Tiếp ñến là thái mỏng hạt mít ñể rút ngắn thời gian sấy khô. Những
miếng hat mít tươi này sấy liên tục ở nhiệt ñộ 55 -60oC từ 60 ñến 72giờ. Cuối cùng
là xay bột ñáp ứng cho quá trình nghiên cứu sau này.


- 27 -

- 28 -

Hạt mít

Bột hạt mít ñem hòa nước

Làm sạch và làm ráo

Hồ hóa ở to = 95oC, T = 45 phút, ñiều chỉnh về pH=5,5-6

Tách lớp vỏ cứng bên ngoài
Bổ sung chế phẩm α-amylaza, tỉ lệ 0,1%
Tách vỏ nâu
Nâng nhiệt ñộ lên 95oC và giữ 120 phút
Rửa sạch và làm nhỏ
Hạ to = 60oC và ñiều chỉnh pH = 4,25
Sấy khô
Xay bột

ứng cho quá trình lên men lactic.

Cao nấm men

8,0

Merck, Đức

K2HPO4

0,5

Merck, Đức

Trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết và thừa kế kết quả nghiên cứu của Nguyễn

Gam/lít

Nguồn cung cấp

Minh Hiền, Nguyễn Thúy Hương (Trường ĐH Bách khoa TP.HCM) [42], tác giả ñã

KH2PO4

0,5

Merck, Đức

1,0




- 29 -

- 30 -

Sau khi phối trộn tất cả các thành phần, tiến hành hiệu chỉnh pH môi trường
bằng H2SO4 20% và NaOH 5N [34] ñể ñưa pH về giá trị cần cho quá trình lên men.

Chủng vi khuẩn lactobacillus casei ở dạng ñông khô, hoạt hóa ở môi trường
trên theo các bước sau:

Hấp tiệt trùng dịch lên men ở nhiệt ñộ 121oC trong thời gian 20 phút.
2.2.2.4. Phương pháp lên men lactic

- Dùng que cấy lấy một lượng vừa phải chủng ñông khô cho vào lọ ñựng
10ml nước muối sinh lý ñã qua hấp tiệt trùng, khuấy tan ñều.

- Giống vi khuẩn sau khi nuôi cấy ñạt yêu cầu, kiểm tra và khảo sát theo các ñiều

- Chuẩn bị môi trường MRS ñã hấp tiệt trùng, ñổ ñều trên 5 ñĩa petri, làm nguội.

kiện thích hợp.

- Dùng pipet vô trùng hút 1ml dịch khuẩn trên cho vào ñĩa petri, sau ñó dùng

- Dịch ñường sau khi xác ñịnh nồng ñộ và bổ sung một số thành phần khác.

que trang trang ñều trên bề mặt thạch.


10,0

Để ñịnh lượng chính xác, cần phải thực hiện sao cho mỗi một khuẩn lạc chỉ

Cao thịt

8,0

ñược hình thành từ một tế bào. Do dịch tế bào sử dụng trong phòng thí nghiệm

Cao nấm men

4,0

thường có nồng ñộ cao, thường nhiều hơn 106 tế bào/ml, nên cần thiết phải ñược

Glucose

20,0

pha loãng trước khi cấy. Phương pháp chuẩn là thực hiện các bước pha loãng ñể

K2HPO4

2,0

giảm nồng ñộ tế bào từ 10 ñến 100 lần cho ñến khi ñạt vài nghìn tế bào/ml.

Vì vậy, số lượng khuẩn lạc ñếm ñược gần như tương ñương với số lượng tế bào sống.


1ml

do ñó môi trường nhân giống ñược thiết kế có thành phần giống môi trường lên

pH = 6,2 ±0,2

2.2.3.3. Phương pháp chuyển giống sang môi trường lên men

men nhằm tạo ñiều kiện thích nghi cho chủng nghiên cứu và giảm thời gian lên
men.


- 31 -

- 32 -

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Mật ñộ giống cấy phải ñược xác ñịnh trước khi thực hiện việc lên men thông
qua phương pháp xác ñịnh gián tiếp mật ñộ tế tào bằng cách ño OD620nm [39].
Trong qúa trình nhân giống và lên men phải theo dõi tính thuần khiết của

3.1. Khảo sát ñặc ñiểm của các nguyên liệu trong nghiên cứu

giống cấy, tránh tình trạng bị tạp nhiễm vi sinh vật lạ gây ảnh hưởng ñến hiệu suất

3.1.1. Bột hạt mít

lên men và làm sai lệch kết quả khảo sát.



3

3

Đã tách sạch lớp vỏ nâu của hạt, màu của hạt ñẹp, trắng

4

4

Đã tách sạch lớp vỏ nâu của hạt, màu của hạt ñẹp, trắng

ñẹp, hơi vàng nâu

Như vậy, bắt ñầu ở nồng ñộ NaOH 3% là ñã tách hết lớp vỏ nâu, ngâm lại
bằng nước lạnh và rửa sạch ñể không còn lưu lại mùi của xút. Ở nồng ñộ xút càng
cao thì lớp vỏ nâu cũng ñược tách sạch, tuy nhiên về mặt kinh tế sẽ không ñạt yêu
cầu và mùi của xút còn lưu lại trên hạt mít ảnh hưởng ñến chất lượng của bột hạt
mít. Vì vậy chúng tôi chọn nồng ñộ NaOH 3% ñể tách sạch lớp vỏ nâu của hạt mít.
Sau khi tách xong vỏ nâu, hạt mít ñược thái nhỏ, ñể ráo, sấy khô, xay thành bột ñể
thuận lợi cho quá trình nghiên cứu.
Nguyên liệu sau khi sấy khô, ñể kiểm tra dư lượng của NaOH còn trong hạt
mít vì mùi của NaOH ảnh hưởng ñến chất lượng của bột hạt mít, chúng tôi tiến
hành kiểm nghiệm bằng cách ngâm nước cất trở lại ñến khi lát hạt mít trương nở,


- 33 -

- 34 -


3.1.1.2. Xác ñịnh hàm lượng tinh bột của hạt mít

Chúng tôi tiến hành thực nghiệm với chế phẩm enzyme ñưa về bằng cách

Chúng tôi tiến hành xác ñịnh hàm lượng tinh bột của hạt mít theo phương

pha loãng 10 lần. Dựa vào nguyên tắc ñã trình bày ở mục 2.2.1.5 và phụ lục 3.3.

pháp thủy phân bằng axit như ñã trình bày ở 2.2.1.1. Từ ñó tôi ñịnh lượng hàm

Chúng tôi tiến hành thực nghiệm và nhận thấy: ống chứa dung dịch kiểm chứng có

lượng ñường khử tạo thành theo phương pháp Graxianop như ñã trình bày ở mục

màu xanh, ống chứa dung dịch thí nghiệm có màu tím.

2.2.1.2, phụ lục 3.1 và 3.2.

Đo cường ñộ màu của các dụng dịch ở bước sóng λ = 656nm so với nước

Với hạt mít thu mua từ các nguồn nhỏ lẻ khác nhau thì kết quả tinh bột xác
ñịnh ñược trình bày ở bảng 3.2

cất, kết quả ñược trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả ño OD của dịch kiểm chứng và mẫu thí nghiệm

Bảng 3.2. Hàm lượng tinh bột của hạt mít
Số lần ño
KQ ño

Dịch ñường

2,5

2,4

2,3

2,4

2,4

a (gam)

0,014

Mbột, %

65,62

Mật ñộ quang

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Trung bình


Trong ñó:

- 36 -

D1 là mật ñộ quang ño ñược của dung dịch kiểm chứng

thể bị giảm, nếu vậy chúng tôi thay chế phẩm mới sản xuất khác hoặc tăng hàm

D2 là mật ñộ quang ño ñược của dung dịch thí nghiệm

lượng chế phẩm enzyme bổ sung khi thủy phân.

0,1 là lượng tinh bột ñem phân tích, gam.

3.1.3. Vi khuẩn lên men lactic

C: là lượng tinh bột ñược thủy phân

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng vi khuẩn lactobacillus casei.

Vậy hoạt lực của chế phẩm enzyme α-amylaza ñược tính như sau:

Chủng này ñang ở dạng ñông khô nên chúng tôi tiến hành hoạt hóa chủng. Sau khi

Cứ 5ml enzyme

hoạt hóa, vi khuẩn có dạng như hình 3.2, sau ñó chúng tôi chọn những ñốm khuẩn

thủy phân ñược 0,051g bột trong 10phút



( 4,3 − 0,6) × 1 × 3,3 × 60
= 146,52
0,5 × 10

Theo quy trình ñề xuất ở mục 2.2.2.2, chúng tôi cân 30 gam bột hạt mít hòa
trong 100ml nước, khuấy ñều và ñun cách thủy ở nhiệt ñộ sôi, thời gian 45 phút

sau thực nghiệm, chúng tôi có ñược kết quả như sau:

HdG =

Hình 3.2. Vi khuẩn L.casei sau khi hoạt hóa
3.2. Nghiên cứu quá trình thủy phân tinh bột

lượng bột có trong dịch bột, hạ nhiệt ñộ xuống ñến 95oC và giữ trong bể ổn nhiệt
120 phút. Sau khi kết thúc quá trình dịch hóa, ñưa nhiệt ñộ xuống 60oC và ñiều
chỉnh pH = 4,25, bổ sung chế phẩm γ – amylaza với các tỷ lệ khác nhau: 0,12%;
(ñơn vị/ml)

Vậy, hoạt lực của chế phẩm enzyme γ – amylaza ñược tính là:
HñG = 146,52 *10 = 1465 ñơn vị/ml.
Kết luận: Cũng tương tự như chế phẩm enzyme α-amylaza, chúng tôi xác
ñịnh ñược hoạt lực của chế phẩm γ – amylaza với mục ñích thuận lợi cho suốt quá
trình nghiên cứu. Vì trong thời gian nghiên cứu, hoạt lực của chế phẩm enzyme có

0,14%; 0,16%; 0,18% và 0,20%. Giữ ở bể ổn nhiệt trong thời gian 175 -180 phút.
Sau quá trình thủy phân thì lọc lấy dịch ñường và ñịnh lượng hàm lượng ñường khử
tạo thành. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng hai loại chế phẩm enzyme αamylaza và γ – amylaza ñể thủy phân tinh bột hạt mít. Nhưng chế phẩm enzyme
α-amylaza tại thời ñiểm nghiên cứu có nguồn gốc sản xuất từ hãng Novozyme,

Lượng enzyme γ –

Lượng ñường khử tạo

Hiệu suất

amylaza bổ sung, %

thành, gam/100ml

thủy phân,%

1

0,12

10,769

49,233

2

0,14

11,667

53,339

OD ở các mức nồng ñộ dịch ñường chuẩn (ñường glucose chuẩn) khác nhau nhằm


như ñã trình bày ở mục 2.2.1.4 và phụ lục 3.6. Trong phương pháp này, chúng tôi
tiến hành xây dựng ñường chuẩn ñường glucose.
3.2.1. Xây dựng ñường chuẩn ñường glucose
Với nguyên tắc cơ bản ñã trình bày ở mục 2.2.1.4, chúng tôi tiến hành ño

Chú ý: cách tính hiệu suất thủy phân xem ở phụ lục 5.2
Qua bảng kết quả trên ta thấy, tại thời ñiểm khảo sát, lượng chế phẩm
enzyme γ – amylaza bổ sung càng tăng thì lượng dịch ñường tạo thành càng cao.
Khi hàm lượng enzyme là 0,18% dịch bột thì lượng ñường tạo thành là cao nhất,
ñồng thời hiệu suất thủy phân ñạt ñược cũng cao nhất (ñồ thị ở phụ lục 5.1). Nếu
tiếp tục tăng hàm lượng enzyme bổ sung, vì có sự cạnh tranh giữa enzyme và cơ
chất nên lúc này hàm lượng ñường tạo thành giảm dần. Chính vì vậy, những nghiên
Hình 3.3. Đường chuẩn glucoza
Từ ñồ thị ñường chuẩn, chúng tôi xác ñịnh hàm lượng ñường khử tạo thành
ở các mức bổ sung chế phẩm enzyme γ – amylaza khác nhau như trình bày ở trên.
Mục ñích là ñể tìm ra hàm lượng chế phẩm γ – amylaza thích hợp cho quá trình
ñường hoá sao cho sau khi kết thúc quá trình thủy phân thì lượng ñường khử tạo
thành là cao nhất.

cứu tiếp theo tôi thủy phân tinh bột bởi 0,1% chế phẩm enzyme α-amylaza và
0,18% chế phẩm enzyme γ – amylaza ñể tạo dịch ñường cho quá trình lên men lactic.
Nhận xét: Từ kết quả thực nghiệm thu ñược, chúng tôi thấy dưới sự xúc tác
của hai loại chế phẩm enzyme trên, tinh bột của hạt mít ñược thủy phân khá triệt ñể.


- 39 -

Hình 3.4. Dịch ñường sau thủy phân
Dịch sau thủy phân tiến hành lọc trên giấy lọc nhiều lần. Hàm lượng ñường
thu ñược sau thủy phân ñủ ñiều kiện cho quá trình lên men lactic.


- Pha loãng môi trường trên trong nước cất ñã hấp vô trùng bằng cách sử

khảo sát khác nhau. Trước khi khảo sát quá trình lên men, chúng tôi chọn phương

dụng 7 ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml nước cất vô khuẩn và một số ống hút 1ml ñã

pháp so màu sử dụng axit dinitrosalycilic (DNS), ñược trình bày ở mục 2.2.1.4 và

hấp tiệt khuẩn. Mức ñộ pha loãng khác nhau như sau:

mục 3.2 ñể xác ñịnh và ñiều chỉnh nồng ñộ của dịch ñường chuẩn bị lên men. Đồng
thời với quá trình trên, chúng tôi chuẩn bị trước dịch vi khuẩn ñể khảo sát ñộng thái
sinh trưởng và phát triển của loại vi khuẩn này nhằm thuận lợi cho quá trình lên
men và rút ngắn thời gian lên men.
Dịch ñường sau khi ñã ñiều chỉnh về nồng ñộ khảo sát, chúng tôi tíến hành
bổ sung thành phần dinh dưỡng như ñã trình bày ở mục 2.2.2.3. Tiếp ñến là hấp
thanh trùng môi trường và lên men.

+ Hút 1ml mẫu dịch vi khuẩn trên cho vào ống nghiệm thứ nhất chứa 9ml
nước cất, khuấy ñều. Ta có mức ñộ pha loãng lúc này là 10-1 lần
+ Tiếp tục hút 1ml ở ống nghiệm thứ nhất cho vào ống nghiệm thứ hai chứa
9ml nước cất vô khuẩn. Trộn ñều và ta ñược ñộ pha loãng là 10-2
+ Tiếp tục chúng tôi làm tương tự và có các mức ñộ pha loãng khác nhau
như sau: 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7
Ở mỗi ñộ pha loãng phải khuấy ñều và lắc kỹ. Tương ứng với mỗi ñộ pha
loãng, tiến hành gieo cấy vào hộp petri theo trình tự như sau: