Bài 1

KỸ THUẬT ĐỊNH NHÓM MÁU HỆ ABO
NHỮNG KHÓ KHĂN VÀ CÁCH GIẢÛI QUYẾT
I.Đặt vấn đề:
Hệ ABO là hệ thống nhóm máu được phát hiện sớm nhất do
Landsteiner (1900). Đây là nhóm máu cực kỳ quan trọng vì là nguyên
nhân chính yếu của các tai biến truyền máu. Do đó việc xác đònh
chính xác nhóm máu hệ ABO là rất cần thiết .
II.Kháng nguyên – kháng thể hệ ABO:
1.Kháng nguyên ABO
Bắt đầu xuất hiện ở bào thai 37 ngày tuổi.
Phát triển hoàn toàn lúc 3 tuổi.
Kháng nguyên có cấu trúc gồm 2 phần:
+ Một phần có bản chất Protein có khả năng sinh kháng thể.
+ Một phần có bản chất Gluxit hoặc Lipit ( còn gọi là
Hapten ),có khả năng kết hợp kháng thể.
Tồn tại ở hầu hết các tế bào của cơ thể ( ngoại trừ các tế bào
thần kinh, tế bào gan, tế bào Malpighi và mô liên kết )
Kháng nguyên thường tồn tại suốt cuộc sống nhưng có thể suy
giảm, yếu đi khi về già hoặc trong 1 số trường hợp bệnh lý.
Kháng nguyên hệ ABO cũng tuân theo đònh luật di truyền
Mendel.
2) Kháng thể ABO:
- Bản chất là kháng thể tự nhiên.
- Thông thường là IgM, 1 số rất ít trường hợp là IgM + IgA hay
IgM + IgG.
- Hoạt động tốt ở nhiệt độ từ 40C đến 200C trong môi trường
NaCl 0,9%.
- Nồng độ thay đổi từ người này sang người khác.


3.1.1) Phương pháp huyết thanh mẫu:


Trên 1 lam kính: nhỏ 3 giọt huyết thanh mẫu chống A, chống B,
chống AB vào 3 vò trí khác nhau.
Thêm 1 giọt hồng cầu cần đònh nhóm 10 – 20% (được pha với
NaCl 0,9%).
Trộn đều bằng que thủy tinh thành 1 vòng tròn có đường kính 2 –
3cm.
Lắc nhẹ liên tục trong vòng 2 phút rồi đọc kết quả.
3.1.2) Phương pháp hồng cầu mẫu:
trí

Trên 1 lam kính: nhỏ 2 giọt huyết thanh cần đònh nhóm vào 2 vò
khác nhau.

Thêm 1 giọt hồng cầu mẫu A, 1 giọt hồng cầu mẫu B vào 2 vò trí
trên (hồng cầu mẫu đã được pha 10 – 20% trong NaCl 0,9% ).
Trộn đều và lắc nhẹ liên tục trong vòng 2 phút rồi đọc kết quả.
3.2) Đònh nhóm trong ống nghiệm
3.2.1) Phương pháp huyết thanh mẫu:
- Nhỏ vào 3 ống nghiệm mỗi ống 1 giọt huyết thanh mẫu chống A,
chống B, chống AB.
- Thêm 1 giọt hồng cầu cần đònh nhóm 2 – 5% ( pha trong NaCl
0,9% ) vào mỗi ống nghiệm trên.
- Lắc đều, quay ly tâm 1000 vòng/ phút/ 1 phút.
- Nghiêng nhẹ thành ống nghiệm, đọc kết quả bằng mắt thường và
kính hiển vi.

3.2.2) Phương pháp hồng cầu mẫu:

Để giải quyết ta tiến hành các bước sau:
+ Rửa hồng cầu cần đònh nhóm và hồng cầu O ( có đầy đủ kháng
nguyên hệ hồng cầu ) bằng NaCl 0,9% 3 lần. Pha thành hồng cầu 5%.
Chứng tự thân:
Nhỏ vào ống nghiệm 2 giọt huyết thanh và 1 giọt hồng cầu cần
đònh nhóm.
Lắc đều, quay ly tâm 1000 vòng/ phút/ 1 phút.
Đọc kết quả bằng mắt thường và kính hiển vi.
+ Chứng AB:
Nhỏ vào ống nghiệm 2 giọt huyết thanh máu AB và 1 giọt hồng
cầu cần đònh nhóm.
Lắc đều, quay ly tâm 1000 vòng/ phút/ 1 phút.


Đọc kết quả bằng mắt thường và kính hiển vi.
Lưu ý: phản ứng âm tính thì phương pháp đònh nhóm bằng huyết
thanh mẫu được bảo đảm.
+ Chứng đồng loài:
Nhỏ vào ống nghiệm 2 giọt huyết thanh cần đònh nhóm và 1 giọt
hồng cầu O.
Lắc đều, quay ly tâm 1000 vòng/ phút/ 1 phút.
Đọc kết quả bằng mắt thường và kính hiển vi.
Lưu ý: phản ứng âm tính thì phương pháp đònh nhóm bằng hồng
cầu mẫu được bảo đảm.
Dựa vào kết quả 3 chứng, ta có thể chia những trường hợp khó
khăn thành 2 nhóm chính như sau:
1/Khi cả 3 chứng nói trên đều âm tính
2/Khi 1 hay cả 3 chứng nói trên đều dương tính
Khi cả 3 chứng nói trên đều âm tính
1.1) Trường hợp có kháng – kháng thể:

- Khi để hồng cầu cần đònh nhóm ủ ở 370C thì hiện tượng ngưng
kết mất dần.
- Giải quyết bằng cách rửa hồng cầu cần đònh nhóm bằng NaCl
0,9% ấm 370C và đònh nhóm trong ống nghiệm ở 370C
2.2) Trường hợp có kháng thể tự miễn:
Nhận xét:
- Có thể có kháng thể tự miễn.
- Các kháng thể này thường đã cố đònh trên bề mặt hồng cầu.
- Giải quyết bằng cách xem lại chẩn đoán lâm sàng, rửa hồng
cầu cần đònh nhóm bằng NaCl 0,9% ấm 370Cvà đònh lại.
- Nếu cần thiết phải tiến hành các kỹ thuật sâu hơn.
2.3) Trường hợp hồng cầu chuỗi tiền
Nhận xét:
- Có sự tăng bất thường Protein trong huyết thanh.
- Có sự ngưng kết tầng nhanh và nó sẽ được phân tán rất nhanh
khi ta nhỏ vào hồng cầu cần đònh nhóm 1 giọt NaCl 0,9%.


- Giải quyết bằng cách rửa hồng cầu cần đònh nhóm bằng NaCl
0,9%; đònh lại phương pháp huyết thanh mẫu.
- Phương pháp hồng cầu mẫu thì pha loãng huyết thanh cần đònh
nhóm trong NaCl 0,9% cho đến khi nồng độ Protein trong huyết thanh
không đủ để kết tầng thành hình chuỗi tiền thì đònh lại.
V.Kết luận
- Xác đònh nhóm máu hệ ABO là 1 khâu cực kỳ quan trọng.
- Phải kiểm tra đầy đủ các thủ tục hành chánh.
- Đònh nhóm 2 lần bằng 2 phương pháp.
- Đối chiếu kết quả:
+ Nếu kết quả phù hợp trả kết quả nhóm máu.
+ Nếu kết quả không phù hợp, kiểm tra lại toàn bộ các bước,

+ Trước truyền máu, hồng cầu túi máu được kiểm tra với huyết thanh
bệnh nhân.
+ Nếu trong huyết thanh bệnh nhân có kháng thể chống lại các kháng
nguyên tương ứng trên hồng cầu túi máu thì sự ngưng kết sẽ xuất hiện.
+ Điều đó thể hiện sự không thuận hợp ở bệnh nhân này đối với túi
máu.
+ Nếu không có sự ngưng kết xảy ra, túi máu được xem như thuận
hợp hay an tòan để truyền cho bệnh nhân.
Mục đích phản ứng chéo
Đây là bước kiểm tra cuối cùng sự thuận hợp của nhóm máu ABO. Có
thể phát hiện được sự hiện diện của kháng thể trong huyết thanh bệnh
nhân trong 1 số trường hợp.
Quy trình phản ứng chéo
Gồm các bước:
Kiểm tra thông tin bệnh nhân:
+ Họ tên bệnh nhân phải đầy đủ, rõ ràng.
+ Cần có mã số hồ sơ bệnh án, hay số nhập viện.
+ Tiền sử truyền máu và các phản ứng truyền máu trước đó ( nếu có ).
2) Kiểm tra mẫu máu bệnh nhân:
+ Phải đầy đủ họ tên, mã số bệnh nhân trên mẫu máu và khớp với
phiếu yêu cầu.
+ Mẫu máu được lấy tối đa trong vòng 3 ngày.
+ Kiểm tra hiện tượng tán huyết, các cục fibrin trong mẫu máu.
3) Xác định lại nhóm máu ABO, Rh:
+ Định lại nhóm máu ABO bằng cả 2 phương pháp.


+ Định lại nhóm máu Rh bằng huyết thanh mẫu D.
+ Để xác định nhóm máu có thể dùng lam kính hoặc ống nghiệm.
4) Tiến hành phản ứng chéo.


Thêm 100L LISS vào trong cùng ống nghiệm.
Trộn kỹ, ủ dung dịch ở 370C trong 15 phút.
Sau ủ, quay ly tâm dung dòch ở tốc độ 3000 vòng/phút trong
15 giây, lắc nhẹ nhàng và đọc kết quả ( nếu cần thiết ).
Rửa dung dịch 03 - 04 lần bằng nước muối sinh lý 0,9% và đổ bỏ
hoàn toàn nước rửa cuối cùng.
Thêm 100µL AHG, trộn kỹ và quay ly tâm dung dịch ở tốc độ 3000
vòng/phút trong 15 giây.
Lắc nhẹ nhàng và đọc kết quả dưới kính hiển vi ( giai đoạn 2 ).
Nếu kết quả (-) cho thêm 50L hồng cầu cảm ứng, trộn kỹ và quay ly
tâm dung dịch ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 15 giây.
Lắc nhẹ nhàng và kiểm tra kết quả lại dưới kính hiển vi.
Kỹ thuật Card gel
Pha lỗng hồng cầu túi máu 1% bằng dung dòch đệm.
Cho 50L hồng cầu 1% vào lỗ Card gel.
Thêm 25µL huyết thanh bệnh nhân vào cùng lỗ Card gel trên.
Ủ Card gel ở 370C trong 15 phút.
Sau ủ, quay ly tâm Card gel trong 10 phút.
Đọc và ghi nhận kết quả.
Lưu ý: các bước kỹ thuật cần được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản
xuất.
Kỹ thuật tự chứng
Cần tiến hành khi phản ứng chéo (+).
Pha lỗng hồng cầu bệnh nhân bằng nước muối sinh lý 0,9%.
Tiến hành các bước kỹ thuật giống như phản ứng chéo.
Đọc và so sánh kết quả của ống tự chứng với phản ứng chéo.
Lưu ý: nồng độ, tỷ lệ của hồng cầu và huyết thanh cần tn theo kỹ thuật
sử dụng.
Các ngun nhân (+) trong phản ứng chéo

. Các vấn đề liên quan đến thuốc thử.
Các bước giải quyết trường hợp (+)
Kiểm tra nhóm máu ABO, Rh túi máu và bệnh nhân.
Làm tự chứng và Coombs trực tiếp.
Kiểm tra lại sàng lọc kháng thể ở bệnh nhân, định danh kháng thể
( nếu có và cần thiết ).
Tiến hành thêm các kỹ thuật khác.


Kỹ thuật trong trường hợp khẩn cấp,Cố gắng xác định nhóm máu
ABO, Rh của bệnh nhân.
Nếu không xác định được, sử dụng túi máu O- .
Ngay khi bệnh nhân đã được truyền máu, vẫn phải tiếp tục tiến hành
kỹ thuật phản ứng chéo.
Tài liệu tham khảo
Technical manual, 15th edition.
Modern blood Banking and Transfusion Practices, 4th edition.
HealthAtoZ.com
Redcross.org
Nobelprize.org
Bài 4

KỸ THUẬT LÀM TIÊU BẢN VÀ NHUỘM
I. KỸ THUẬT LÀM TIÊU BẢN
TIÊU BẢN MÁU DÀN:
Chuẩn bi:
Lam kính khô sạch,lam kéo, bút đánh dấu tiêu bản
Hóa chất cồn 700, 900
Bệnh phẩm là máu lấy từ mao mạch
I. KỸ THUẬT LÀM TIÊU BẢN (TT)

Lắc khô hoặc để khô tự nhiên
Không cần cố định mà nhuộm ngay
Ngoài ra còn làm tiêu bản: soi tươi, tiêu bản tủy đồ, làm tiêu
bản dịch
II.KỸ THUẬT NHUỘM
Có nhiều cách nhuộm nhưng trong huyết học thường nhuộm Giemsa
Dụng cụ:
Giá nhuộm, ống đong hoặc cốc có vạch hoặc pipet
Hóa chất: Giemsa mẹ, cồn cố định, nước cất, nước thường
Tiêu bản máu
Tiến hành:
Cố định tiêu bản bằng cách cho 1-2 giọt cồn tuyệt đối lên tiêu
bản
Và lăn cho cồn chảy khắp tiêu bản.
Để khô tự nhiên
Pha thuốc nhuộm Giemsa tỉ lệ 1/10
Đặt lam cần nhuộm lên giá
Phủ lên khắp tiêu bản dd Giemsa 1/10
Để 15 phút, rửa nước thường cho sạch hết cặn
Để khô trên giá đỡ thẳng đứng
Và đọc khi cần thiết

Bài 5

KỸ THUẬT LẤY MÁU MAO MẠCH
I. CHUẨN BỊ:
Dụng cụ: Kim chích, bông thấm, dây garo.
Hóa chất: Cồn 700



Chọn vị trí lấy máu: thường là ở tĩnh mạch khuỷu tay
Sát khuẩn da lần thứ 1 bằng bông tẩm cồn 700
Garo phía trên nơi chích để vài phút cho TM nổi lên
Sát khuẩn da lần 2
Cầm bơm kim tiêm trong lòng bàn tay phải,ngón trỏ tỳ vào đốc
kim


Đặt đúng hướng của TM đi lên, đầu vát của kim hướng lên trên
Đặt kim tiêm so với cánh tay 1 góc khoảng 300
Tỳ chắc ngón tay vào đốc kim và chọc qua da với động tác dứt
khoát
II. TIẾN HÀNH (TT)
Luồn kim vào TM
Khi kim vào TM có thể nới dây garo ra và rút máu sao cho đủ số
lượng cần thiết
Tháo dây garo, đặt miếng bông tẩm cồn lên chỗ tiêm chích, rút kim
ra với động tác nhanh, bảo bệnh nhân ép lên chỗ lấy máu khoảng 5p
Tháo kim ra cho vào thùng hủy kim, bơm đủ số lượng máu vào lọ
chứa mẫu
III. CHÚ Ý
Trước khi lấy máu phải đối chiếu họ, tên, tuổi, chẩn đoán, chỉ định
xét nghiệm của bệnh nhân...
Không được lấy máu ở nơi nghi do tắc mạch, phù nề, viêm nhiễm
Không lấy máu quá lâu. Khi bơm vào ống nhớ lắc trộn đều.
Bài 7

PHA CHẾ CÁC DUNG DỊCH NHUỘM
1. DUNG DỊCH GIEMSA ĐẬM ĐẶC
- Giemsa bột

3. DUNG DỊCH NHUỘM HỒNG CẦU LƯỚI
3.1 Dung Dịch Xanh Cresyl 1%:
- Xanh Cresyl
:
1g
- Natri Citrat 3%
:
20 ml
- NaCl 0,9%
:
80 ml ml
Lắc cho tan đều rồi lọc. Chỉ dùng trong 1 tháng
3.2 Dung Dịch Xanh Cresyl trong cồn:
- Xanh Cresyl ánh
:
1g
- Cồn tuyệt đối
:
100 ml
4. DUNG DỊCH NHUỘM PEROXYDAZA:
+ Dung dịch A:
- Benzidin
:
0,25g
- Cồn Ethylic 95%
:
100 ml
+ Dung dịch B:
- Nitroprussiate sodium
:

- Cồn Ethylic tuyệt đối
:
30ml
- Nước cất
:
100ml
+ Dung dịch C: - Dung dịch A :
60ml
- Dung dịch B :
40ml
0
+ Cồn Ethylic 70
+ Dung dich Giemsa 10%
6. DUNG DỊCH NHUỘM RNA TRONG NGUYÊN SINH CHẤT:
6.1 Dung dịch cố định:
- Cồn Ethylic tuyệt đối
:
60ml
- Chloroform
:
30ml
- Acid Acetic
:
10ml
6.2 Dung dịch đệm walpole ( PH = 4.8 )
- Dung dịch Acid Acetic 0,6g/100ml
:
80ml



:
10ml
Hoặc:
- Heparin
:
10mg
- NaCl 0,9% :
0,25ml
4. DUNG DỊCH ACD:
- Acid Citric :
0,8g
- Citrat natri :
2,2g
- Gluco :
2,2g
- Nước cất
:
100ml
5. DUNG DỊCH CPD:
- Acid citric :
0,32g
- Citrat natri :
2,63g
- Phosphat
:
0,25g
- Destroze
:
2,32g
- Nước cất

Điều chỉnh PH = 6
Bảo quản 4oC, dùng trong 1 tuần
2. DUNG DỊCH CANXICLORUA 0,025M
- Dung dịch Canxiclorua 0,1M

:

- Nước cất

3 thể tích

:

1 thể tích

Chỉnh PH = 6
Chỉ pha khi dùng
3. DUNG DỊCH THROMBOPLASTINCANXI:
- Bột hoạt chất Thromboplastin

:

50mg

- NaCl 0,9%

:

1ml


40g

- Nước

:

180ml

- Acid sunfuric nguyên chất :

180ml

2.2 Dung dịch Sunfocromic loại thường:
- Kalibicromat

:

50g

- Acidsunfuric nguyên chất :

50ml

- Nước cất

1000ml

:

3. PHA LOÃNG VÀ BẢO QUẢN CỒN:

:
1000ml
DUNG DỊCH NƯỚC MUỐI SINH LÝ
- NaCl
:
8,5 g


- Nước cất
:
1000 ml
II. DUNG DỊCH ĐẾM SỐ LƯỢNG BẠCH CẦU
DUNG DỊCH LAZARUS :
- Acid Acetic
:
50 ml
- Xanh Methylen 1% :
20 giọt
- Nước cất vừa đủ
:
1000 ml
DUNG DỊCH TURK :
- Acid Acetic
:
2 ml
- Gentian violet
:
1 giọt
- Nước cất
:

- Nước cất vừa đủ
:
1000 ml

DUNG DỊCH MAGNESIUM SULFAT 14% :
- Magnesium sulfat :
14 g
- Nước cất vừa đủ
:
100 ml
DUNG DỊCH PHA LOÃNG NƯỚC NÃO TỦY ĐỂ ĐẾM TẾ
BÀO MÁU :
- Acid acetic :
10 ml
- Crystal violet :
0,1 ml
- Nước cất
:
90 ml
Lọc kỹ trước khi dùng
V. DUNG DỊCH ĐỊNH LƯỢNG HUYẾT SẮC TỐ
DUNG DỊCH ACID CLOHYDRIC 0.1N
Acid clohydric nguyên chất (HCL)
:
8,6 ml
Nước cất vừa đủ
:
1000ml



Đếm HC:
+ Đặt buồng đếm lên kính hiển vi


+ Để 2-3 phút cho HC lắng đều
+ Lấy vi trường bằng vật kính 10, chuyển sang 40
3.Tiến hành (TT)
+ Đếm HC trong 80 ô vuông nhỏ trong 5 khu vực Của HC
( Smic Neubauer, Thoma, Goriaep): đếm 4 khu ở 4 góc và 1 khu ở giữa
+ Ở mỗi khu sẽ đếm các HC nằm trong ô kẻ còn các HC nằm
trên đường cạnh các hình vuông thì chỉ đếm các HC ở cạnh trên và cạnh
trái. Ghi số HC mỗi khu Giữa các khu không được chênh lệch quá 10 con
Tính Kết quả:
+ Sau khi đếm được số lượng HC trong 80 ô vuông con tức là
trong 80/4000mm3
+ Nhân với độ pha loãng 200 lần
+ Tính ra 1mm3 = SLHC/5khu x 10.000