VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ LÊN MEN DẤM TÁO MÈO
BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN CHÌM

Người hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Việt Anh
Sinh viên thực hiện : Nguyễn Quang Tuấn
Lớp

: 12 - 03

HÀ NỘI – 2016


Lời cảm ơn
Để hoàn thành được bài báo cáo thực tập chuyên đề tốt nghiệp, em xin
gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến tất cả quý Thầy Cô, những người đã cho em
những kiến thức cơ bản, những bài học, những kinh nghiệm quý báu để em có thể
hình dung được một cách khái quát những gì cần làm khi bước vào thực tập này
cũng như áp dụng những kiến thức đó trong quá trình thực tập và viết chuyên đề.
Đặc biêt, em xin cảm ơn TS. Nguyễn Thị Việt Anh người đã tận tình hướng dẫn
em trong suốt thời gian thực tập. Sự chỉ bảo tận tình và chu đáo của cô giúp em
hoàn thành tốt hơn bài báo cáo, giúp em nhận ra sai sót cũng như tìm ra hướng đi
đúng khi em gặp khó khăn, bối rối. Em xin chân thành cảm ơn ThS. Hà Thị
Phương và các cô, chú, anh, chị công tác tại bộ môn Công nghệ lên men đã tạo
mọi điều kiện giúp đỡ em trong thời gian em tiến hành thực tập và cho em những
lời khuyên để hoàn thành tốt hơn bài báo cáo thực tập. Mặc dù đã có nhiều cố


Trang
Giới thiệu ............................................................................................................... 1
Phần I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 4
1.1. NGUYÊN LIỆU QUẢ TÁO MÈO ................................................................. 4
1.1.1. Giới thiệu chung về cây táo mèo.................................................................. 4
1.1.2. Công dụng của táo mèo ................................................................................ 5
1.2. TÁC ĐỘNG CỦA ENZYME PECTINASE ĐẾN KHẢ NĂNG TRÍCH
LY DỊCH QUẢ ...................................................................................................... 7
1.2.1. Enzyme pectinase ......................................................................................... 7
Phân loại enzym pectinaza: .................................................................................... 8
1.2.2. Cơ chất pectin............................................................................................... 9
1.3. CÁC VI SINH VẬT SỬ DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN
DẤM ..................................................................................................................... 12
1.3.1. Nấm men .................................................................................................... 12
1.3.2. Vi khuẩn acetobacter ................................................................................. 14
1.3.3. Phương pháp lên men chìm trong sản xuất axit axetic từ vi khuẩn
Acetobacter........................................................................................................... 21
PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................... 23
2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ ................................................................... 23
2.1.2. Hóa chất...................................................................................................... 23
2.1.3. Máy móc dụng cụ ....................................................................................... 24
2.2. PHƯƠNG PHÁP ........................................................................................... 24
2.2.1. Phương pháp hóa lý, hóa sinh .................................................................... 24
2.2.2. Phương pháp vi sinh ................................................................................... 31
Phần 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 33
3.1. KHẢO SÁT NGUYÊN LIỆU....................................................................... 33
3.2. NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU CHO QUẢ
TRÌNH LÊN MEN DẤM TÁO MÈO ................................................................. 34
3.2.1. Xử lý bằng enzyme Pectinex Ultra SP-L ................................................... 34

Hình 3.5. Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian tới hoạt lực của enzym pectinaza ... 39
Hình 3.6. Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng làm trong của
pectinase ............................................................................................................... 40
Hình 3.7. Biểu đồ ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme ultra clear đến khả năng làm
trong...................................................................................................................... 41
Hình 3.8. Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian đến khả năng làm trong của ezyme
pectinase ultra clear .............................................................................................. 42
Hình 3.9. Dịch quả sau thủy phân bằng enzyme.................................................. 43
Hình 3.10. Biến đổi động học quá trình lên men rượu ........................................ 44
Hình 3.11. Dịch quả sau 3 ngày lên men rượu..................................................... 44
Hình 3.12. Biến đổi động học quá trình lên men dấm ......................................... 46
Hình 3.13. Các mẫu giấm táo sau khi thanh trùng ............................................... 47
Hình 3.14. Quy trình sản xuất dấm táo ................................................................ 49


Giới thiệu
Táo mèo (docynia indica) được phân bố nhiều tại các tỉnh miền núi phía
bắc Việt Nam.Thành phần hóa học có trong táo mèo bao gồm: các axit hữu cơ,
vitamin C, B, hydratcacbon, chất xơ, tannin, polyphenol, chất khoáng…Táo mèo
được sử dụng trong đông y như một vị thuốc chữa các bệnh về tiêu hóa, tan ứ
huyết, sát trùng tang cường miễn dịch, chống oxy hóa, hạ huyết áp, làm giãn động
mạch vành, cải thiện sức co bóp tim, phòng chống tích cực các biến chứng do cao
huyết áp gây ra, giảm cholesterol….
Loài người đã biết chế tạo và sử dụng giấm(vinegar) từ nhiều ngàn năm
trước. Giấm được dùng như vị thuốc, tác nhân phá hủy và chất bảo quản. Khoảng
5000 năm trước công nguyên, người Babylon đã biết dùng trái chà là để làm rượu
và giấm. Vết tích của giấm đã được tìm thấy ở Ai Cập cổ đại từ 3000 năm
trước công nguyên. Theo sự tích Thần Nông, giấm cũng được tìm thấy ở Trung
Quốc từ đời nhà Hạ, 2000 năm trước công nguyên. 500 năm trước công nguyên, ở
Hy lạp, Hippocrates, vị cha đẻ của ngành y học hiện đại, đã dùng giấm làm từ

và cả trong y học. Nhu cầu sử dụng acid hữu cơ ngày càng nhiều, trong đó có hai
loại acid acetic và acid lactic được sản xuất nhiều nhất và ứng dụng rộng rãi nhất.
Sản phẩm đồ uống giấm táo mèo có chứa các thành phần sinh hóa cần thiết điều
tiết hoạt động của tuần hoàn máu như các thành phần các axit hữ cơ và
polyphenol có tác động trực tiếp tới hoạt động của renin, dẫn tới làm giảm áp lực
huyết áp, giàu hàm lượng kali có tác đông tốt cho bệnh huyết áp cao, có các thành
phần đường dễ tiêu hóa, có tác động tốt tới hệ tim mạch, tiêu hóa. Do vậy có thể
nói sản phẩm đồ uống giấm táo mèo có tác dụng tốt trong phòng và chữa bệnh
cao huyết áp, giảm béo.
Do có nhiều tác dụng chức năng nên hiện nay sản phẩm giấm táo, đặc biệt
là giấm táo mèo, được người tiêu dùng ưa thích. Các sản phẩm giấm táo nhập
ngoại mặc dù có giá cao vẫn được chấp nhận tại thị trường Việt Nam. Từ yêu cầu
thị trường, rất nhiều sản phẩm giấm táo mèo được sản xuất tự phát tại các cơ sở
2

Comment [W1]:


sản xuất nhỏ. Tuy nhiên do được sản xuất theo phương pháp thủ công, không có
các quy trình chuẩn, do vậy khó quản lý về vệ sinh an toàn thực phẩm. Các sản
phẩm giấm táo mèo sản xuất trong nước hiện nay còn tiềm ẩn nhiều mối nguy.

3


Phần I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. NGUYÊN LIỆU QUẢ TÁO MÈO
1.1.1. Giới thiệu chung về cây táo mèo
Táo mèo là tên người H’Mông gọi quả sơn tra (Fructus Crataegi) thuộc chi
sơn tra (Crataegus), họ hoa hồng (Rosaceae).

dùi, sớm rụng. Cụm hoa chùm 1-3 hoa hoặc đơn, có lông, cuống hoa rất ngắn
hoặc không có. Đài có lông, mặt trong nhẵn, cánh hoa 5, màu trắng, mép có mũi
nhọn, nhỏ. Bầu 5 ô, mỗi ô có 3-10 noãn, xếp theo chiều dọc của bầu, vòi nhụy 5,
hàn liền với nhau ở gốc, có lông, quả dạng quả táo, hạt màu đen.

Hình 1.2. Cây táo mèo
1.1.2. Công dụng của táo mèo
Theo y học cổ truyền, sơn tra có vị chua ngọt, tính hơi ấm, quy kinh tan, tỳ,
vị, thuộc nhóm thuốc tiêu thực hóa tích, giúp tiêu hóa do tăng bài tiết acid mật và
5


pepsin dịch vị. Công dụng chủ yếu là điều trị các chứng rối loạn tiêu hóa do ăn
nhiều thịt, dầu mỡ, trẻ em ăn sữa không tiêu, … Đây chính là tác dụng giúp ăn
uống ngon miện của vị thuốc này.
Thực nghiệm invivo cho thấy dịch chiết sơn tra có tác dụng ức chế trực
khuẩn E.coli, trực trùng lị, bạch hầu, thương hàn, tụ cầu vàng khá mạnh. Khi sao
đen (sơn tra thán) có thể hấp thu hầu hết độc tố của vi khuẩn và các chất hoại tử,
làm giảm kích thích thành ruột, giảm nhu động ruột, cầm tiêu chảy, kết lỵ do
nhiều nguyên nhân khác nhau.
Nghiên cứu hiện đại cho thấy, sơn tra có tác dụng kháng khuẩn, cường tim,
làm giãn động mạch vành, chống rối loạn nhịp tim, hạ áp, bảo vệ tế bào gan, tăng
cường công năng miễn dịch, trấn tĩnh an thần, chống co thắt, ức chế quá trình
ngưng tập tiểu cầu, điều chỉnh rối loạn lipit máu, xơ vữa động mạch huyết áp cao,
phòng ngừa đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim, béo phì, lị trực khuẩn cấp, viêm ruột
cấp, tiêu chảy do nhiễm giun sán, viêm cầu thận cấp và mãn tính, hậu sản, ứ trệ
gây đau bụng, …
Các nhà y học Trung Quốc dã dùng viên Sơn Tra Giáng Mỡ (mỗi viên chứa
0,06g bột chiết sơn tra) điều trị rối loạn lipit máu với liều uống mỗi ngày 3 lần,
mỗi lần 2 viên, liệu trình bốn tuần. Kết quả cho thấy nồng độ cholesterol và

hợp các enzyme phân giải pectine.
Enzyme pectinase thuộc nhóm enzyme thủy phân. Nó sử dụng cơ chất là
pectin và sản phẩm sau khi thủy phân là acid pectic và methanol. Enzyme
pectinase được sử dụng nhiều trong công nghiệp chế biến trái cây nhằm mục đích
gia tăng hiệu suất thu hồi dịch quả, cải thiện chất lượng dịch quả và có tác dụng
làm trong (Nilay Demir et al, 2000).
Enzym pectinaza được sử dụng nhiều trong công nghiệp chế biến trái cây
nhằm mục đích gia tăng hiệu suất thu hồi dịch quả, cải thiện chất lượng dịch quả
và có tác dụng làm trong.
7


Lượng dịch quả có xu hướng giảm dần khi nồng độ enzyme thấp hơn hoặc
cao hơn. Khi thừa cơ chất, vận tốc phản ứng tăng khi nồng độ enzym tăng nhưng
khi nồng độ enzym bão hòa với nồng độ cơ chất thì vận tốc phản ứng không thay
đổi hoặc không tăng thêm khi tăng nồng độ enzym. Phản ứng thủy phân xúc tác
bởi enzym cần có một khoảng thời gian tối thiểu đối với từng loại enzym. Việc
kéo dài thời gian cho hoạt động thủy phân là cần thiết để tạo ra lượng sản phẩm
(dịch quả) nhiều. Tuy nhiên, thời gian thủy phân quá kéo dài cũng không tạo ra
lượng sản phẩm nhiều hơn mà lại mất nhiều thời gian. Ngược lại thời gian thủy
phân quá ngắn là không đủ cho phản ứng.
Phân loại enzym pectinaza:
Enzym pectinaza gồm 3 loại nhóm chính: pectinestaraza, các enzyme khử
mạch polyme và protopectinaza.

PE (pectinesteraza) xúc tác thủy phân liên kết este của axit pectic với nhóm
metyl giải phóng ra pectat và metanol. Các pectat dễ kết lắng trong điều kiện có
Ca2+, làm cho sản phẩm kém ổn định, đồng thời rượu metanol là thành phần
không mong muốn trong sản phẩm. Do đó enzym này ít được sử dụng trong sản
xuất.

này cũng được chia làm 2 nhóm dựa vào vị trí liên kết glycozit bị thủy phân.
Gồm: endo-glucozit - polygalacturonaza và exo-glucosidaza-polygalacturonaza.
Ngoài các enzyme chủ yếu kể trên, tham gia sự phân giải các hợp chất
pectin còn có: enzym protopectinaza xúc tác sự thủy phân protopectin không tan
thành pectine hòa tan. Enzym này thường được dùng cho các loại quả như nho,
enzym tác động phá vỡ cấu trúc thành tế bào giúp trích rút dịch nhiều hơn.
1.2.2. Cơ chất pectin
Pectin là một polysaccharide tồn tại phổ biến trong thực vật, là thành phần
tham gia xây dựng cấu trúc tế bào thực vật. Ở thực vật pectin tồn tại chủ yếu ở 2
dạng là pectin hòa tan và protopectin không hòa tan. Dưới tác dụng của acid,
enzyme protopectinaza hoặc khi gia nhiệt thì protopectin chuyển thành pectin.
Pectin như một loại keo gắn chặt các tế bào thực vật với nhau, vì thế người ta gọi
chúng là chất cement trong cấu trúc tế bào thực vật. Khi quả còn xanh,
protopectin chiếm tỉ lệ khá cao, protopectin không hòa tan trong nước, giúp quả
có độ cứng. Khi quả chín dần, dưới tác dụng của enzyme protopectinase,
protopectin sẽ chuyển sang pectin hòa tan, làm giảm sự liên kết giữa các tế bào,
quả trở nên mềm hơn. Quá trình này cũng xảy ra dưới tác dụng của axit hoặc khi
gia nhiệt.
Pectin là hợp chất cao phân tử polygalactoronic có đơn phân tử là
galactoronic và rượu metylic. Trọng lượng phân tử từ 20.000 - 200.000 đvC. Hàm
9


lượng pectin 1% trong dung dịch có độ nhớt cao, nếu bổ sung 60 % đường và
điều chỉnh pH môi trường từ 3,1-3,4 sản phẩm sẽ tạo đông.
Cấu tạo phân tử pectin là một dẫn suất của acid pectic, acid pectic là một
polymer của acid D-galacturonic liên kết với nhau bằng liên kết 1-4-glycozide.

Hợp chất pectin được đặc trưng bởi 2 chỉ số quan trọng là chỉ số methoxyl
“MI” biểu hiện cho phần trăm khối lượng nhóm methoxyl –OCH3 có trong phân

và vỏ cùi. Tuy nhiên, một số loại quả thì hàm lượng pectin trong thịt quả cao hơn
như: chuối, ...
Lượng pectin là nguyên nhân chính làm tăng độ nhớt dịch quả, gây khó
khăn cho quá trình chế biến và sản xuất rượu vang. Hàm lượng pectin cao làm
tăng độ nhớt dịch quả nên hiệu suất lọc giảm, rượu vang và dấm trong quá trình
tàng trữ lâu dài sẽ bị lắng cặn, vẩn đục.
11


Vì thế trong quá trình lên men rượu và lên men dấm, đặc biệt đối với
nguyên liệu ban đầu là hoa quả, những chất có hàm lượng pectin cao thì việc xử
lý bằng enzyme pectinase:
•

Làm tăng hiệu suất chiết rút dịch quả.

•

Độ nhớt của dịch quả giảm mạnh.

•

Giúp quá trình lọc tốt và nhanh hơn.

•

Hiệu suất thu ép cao hơn (tăng 14-30%).

•


trình lên men bằng phương pháp công nghệ sinh học tạo ra các sản phẩm đặc
trưng, chi phí thấp được quan tâm nhiều nhất. Các loại nấm men được ứng dụng
vào công nghiệp sản xuất đồ uống có cồn như rượu, bia, dấm…. Công nghệ sản
xuất thực phẩm: bánh mì với khá nhiều sản phẩm đa dạng phong phú. Công nghệ
sản xuất nguồn nguyên nhiên liệu (bioethanol)…. Ngày nay còn hướng đến lĩnh
vực đồ uống không cồn, probiotic, thực phẩm chức năng đem lại nguồn thực
phẩm có giá trị dinh dưỡng cao.
Saccharomyces là một trong các loại nấm men điển hình, có khoảng 40 loài
(van der Walt, J.P. 1970), chúng hiện diện nhiều trong sản phẩm có đường, đất,
trái cây chin, phấn hoa, … Chúng có hình bầu dục, gần tròn, kích thước khoảng 6
– 8 µm x 5 - 6µm. Saccharomyces cerevisiae thường có cấu tạo hình elip, đường
kính lớn từ 5 – 10 nm và đường kính nhỏ từ 1 – 7 nm, tế bào gia tăng kích thước
theo độ tuổi, thể tích tế bào đơn bội là 29mm3 và tế bào lưỡng bội là 55mm3. Các
tế bào của nấm men mang cấu trúc và chức năng của eukaryote bậc cao.

13


Hình 1.3. Nấm men Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae là loài nấm men được sử dụng rộng rãi nhất
trong công nghiệp sản xuất bánh mì và đồ uống có cồn. Saccharomyces
cerevisiae được dùng trong phòng thí nghiệm và giữ vai trò quan trọng trong
nghiên cứu vi sinh tế bào, tìm hiểu những thông tin về tế bào để phục vụ những
nghiên cứu của con người.
Quá trình lên men rượu bằng nấm men, thực chất là quá trình chuyển hóa
đường thành rượu etylic, CO2 và các sản phẩm phụ khác như Glycerin.
C6H12O6→ 2C2H5OH + 2CO2 +Q
1.3.2. Vi khuẩn acetic acid
Vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp acid acetic từ đường, hoặc rượu được
phát hiện đầu tiền từ năm 1864 là loài Acetobacter aceti. Sau đó vào năm 1935,

cao), không di động trên cơ chất tạo váng dày trong, có khả năng phát triển ở
nồng độ rượu cao 10-12% và có khả năng tích lũy 9,5% axit axetic.
Acetobacter xylinum: tế bào hình que, không di động tạo thành váng
dày trên cơ chất, nhuộm màu xanh với iot và axit sunfuric, có khả năng tích lũy
được 4,5% axit axetic.
Acetobacter shuizenbachii: trực khuẩn dài, khi già mới tạo thành váng
dày không bền có khả năng tích lũy 11,5% axit axetic.
Trong sản xuất với mỗi phương pháp khác nhau cần phải chọn những
chủng vi khuẩn có đặc tính thích hợp để quá trình lên men đạt hiệu quả cao nhất.
Các chủng vi khuẩn được lựa chọn phải thỏa mãn một số yêu cầu sau:
Phải oxy hóa rượu tốt nhất và oxy hóa dấm thấp nhất.
Phải tạo ra dấm có chất lượng tốt (thơm, có nồng đô axit axetic cao).
15


Chịu được độ rượu và axit cao.
Các tính chất ban đầu của chúng phải giữ nguyên trong suốt quá trình.
Điều kiện nuôi cấy, phân lập và bảo quản giống đoen giản, không tốn
kém.
Đặc điểm trao đổi chất:
Một trong những đặc điểm chính AAB (vi khuẩn acetic acid) là khả oxy
hoá nhiều nguồn cơ chất và tích luỹ sản phẩm trao đổi chất trong môi trường mà
không gây độc cho sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn. Khả năng này là do hoạt
động của enzyme dehydrogenase trong thành tế bào.
Sự chuyển hoá ethanol: sự oxy hoá ethanol thành acid acetic là một đặc
điểm chính của AAB.Sự oxy hoá ethanol bởi AAB xảy ra qua 2 giai đoạn:
Giai đoạn 1: Ethanol bị oxy hoá thành acetaldehyde.
Giai đoạn 2: Acetaldehyde bị hydrate hoá thành acid acetic. Hai enzyme
đóng vai trò quan trọng trong quá trình oxy hoá là enzym của màng tế bào chất:
alcohol dehydrogenase và aldehyde dehydrogenase.

ammonium. Sự phát triển của chúng có thể được kích thích hoặc bị ức chế tùy
vào sự có mặt của amino acid trong môi trường. Glutamate, glutamine, proline,
histidine kích thích sự phát triển của AAB, trong khi đó valine, threonine,
homoserine lại gây hiệu quả ức chế sự phát triển của vi khuẩn.
1.3.2.1. Quá trình sinh tổng hợp axit axetic từ vi khuẩn axit axetic
Để chuyển hóa rượu thành axit axetic, rượu phải thẩm thấu qua thành tế
bào vi khuẩn. Ở đây sẽ xảy ra quá trình chuyển hóa rượu thành axit axetic rồi
thẩm thấu ra ngoài môi trường. Thực chất của quá trình này gồm 2 phản ứng với
2 enzyme của vi khuẩn acetic xúc tác. Sau sự hydrat hóa acetaldehyde diễn ra
17


phản ứng loại hydro lần thứ hai. Hydro được NADP nhận và qua các xitocrom
của chuỗi hô hấp được chuyển cho O2(chất nhận). Trong lên men axit axetic, cơ
chất dinh dưỡng chủ yếu là cồn etanol với nồng độ trên dưới 10% trong môi
trường. Ngoài ra còn có them một ít đường, nguồn Nitơ vô cơ hoặc hữu cơ, cũng
như các chất khoáng khác.
1.3.2.2. các điều kiện ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp axit axetic
a) Ảnh hưởng của oxy.
Quá trình sinh tồng hợp axit axetic bởi vi khuẩn axetic là quá trình chuyển
hóa bởi phản ứng oxy hóa etanol, trong đó oxy đóng vai trò như chất nhận hydro,
do vậy sự có mặt của oxy trong quá trình là quan trọng. Trong các quá trình lên
men, phương pháp lên men chìm là phương pháp đạt hiệu suất lên men tốt nhất,
có thể áp dụng trong sản xuất công nghiệp, do quá trình lên men được sục khí
mạnh, lên tục, nhờ oxy được phân tán đều trong khối dịch, do vậy tốc độ lên men
xảy ra mạnh, năng suất lên men cao hơn so với phương pháp lên men bề mặt
(phương pháp lên men chậm), oxy chỉ được tiếp xúc trên bề mặt thoáng của dịch
lên men.
Tuy nhiên, các nghiên cứ đã chỉ ra rằng, nồng đọ oxy hòa tan quá cao trong
môi trường lên men có ảnh hưởng tới sự phát triển của vi khuẩn axit axetic, dẫn