VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN HOÁ HỌC CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN

BÁO CÁO CHUYÊN ĐỀ 2.4.1
(HĐ số

ngày

tháng

năm 2014)

Tên chuyên đề:
NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN KHỬ TRÙNG TẠO MẪU
NUÔI CẤY MÔ TỪ CHỒI NGỦ

Thuộc đề tài: “Nghiên cứu và xây dựng quy trình chiết tách hoạt chất rotundin
trong cây bình vôi trồng ở qui mô sản xuất thử, áp dụng tại tỉnh Thái Bình”
Mã số: VAST.NĐP.07/14-15
Người thực hiện: TS. Nguyễn Văn Dư

Hà Nội, 2014


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN HOÁ HỌC CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN

BÁO CÁO CHUYÊN ĐỀ
(HĐ số

ngày

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU.................................................................2
1.1. Nghiên cứu về nhân giống các loài trong chi Bình vôi............................................................2
CHƯƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................4
1.2. Mục tiêu nghiên cứu.................................................................................................................4
1.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu............................................................................................4
1.4. Nội dung nghiên cứu.................................................................................................................4
1.5. Phương pháp nghiên cứu..........................................................................................................4
2.4.1. Phương pháp luận..................................................................................................................4
2.4.2. Phương pháp thực nghiệm.....................................................................................................4
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.........................................................9
1.6. Công thức khử trùng thích hợp cho tạo mẫu sạch in vitro........................................................9
3.2. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi Bình Vôi in vitro..........11
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KHUYẾN NGHỊ...........................................................14
1.7. Kết luận...................................................................................................................................14
1.8. Khuyến nghị............................................................................................................................14
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................................15


ĐẶT VẤN ĐỀ
Chi Bình vôi (Stephania) gồm nhiều loài cây thuốc quý có tác dụng an
thần, chữa ho, sốt, lỵ, dạ dày, chữa mất ngủ, chúng còn được sử dụng để chữa
bệnh ung thư một trong những căn bệnh của thế kỷ. Hiện nay các tài liệu mô tả
về các đặc điểm sinh vật học, sinh thái học của các loài Bình vôi rất hạn chế.
Trong đó loài Bình vôi (Stephania rotunda Lour.) đang bị suy giảm nghiêm
trọng trong tự nhiên. Do vậy việc hiểu biết một số đặc điểm sinh vật học của
loài cây này có ý nghĩa lớn nhằm góp phần bảo tồn nguồn gen và phát triển
loài cây thuốc quý hiếm này. Bên cạnh đó, sự hiểu biết về tầm quan trọng, lợi
ích và công tác nhân giống, đặc biệt là nhân giống sinh dưỡng loài cây này
không chỉ giúp cho công tác bảo tồn mà còn có thể tạo ra nguồn nguyên liệu
đảm bảo cả số lượng và chất lượng cho việc sản xuất hóa dược với quy mô lớn.

hợp chất alkaloid rotundine từ cây Bình vôi (Stephania rotunda Lour.)”. Trong
đề tài này, các tác giả đã nghiên cứu và thử nghiệm thành công việc nhân
giống loài Bình vôi (Stephania rotunda Lour.) bằng phương pháp nuôi cấy mô
và đi đến một số kết luận sau:
Khả năng tạo mô sẹo từ khúc cắt thân đạt hiệu quả cao trên môi trường
MS bổ sung 2,4-D 5 mg/l, BA 0,2 mg/l.
Môi trường có hàm lượng khoáng cao thích hợp cho quá trình tạo mô sẹo
từ khúc cắt thân.
2


Trên môi trường MS bổ sung BA 1,0 mg/l, NAA 0,2 mg/l, quá trình hình
thành chồi từ chồi ngủ xẩy ra thuận lợi.
Ở tất cả các mẫu thí nghiệm (thân, củ, mô sẹo) đều có alkaloid rotundine.
Trong đó, củ có hàm lượng rotudin cao nhất.

3


CHƯƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.2.

Mục tiêu nghiên cứu
- Bước đầu xây dựng được kỹ thuật khử trùng tạo mẫu nuôi cấy mô từ

chồi ngủ Bình vôi bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.
1.3.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu của đề tài là cây Bình vôi (Stephania rotunda

Số mẫu của mỗi công thức thí nghiệm phải đủ lớn (≥ 30)

-

Thí nghiệm được lặp lại ≥ 3 lần.

2.4.2. Phương pháp thực nghiệm

4


Sử dụng chồi ngủ làm nguồn vật liệu khởi đầu, tiến hành khử trùng và cấy
vào môi trường MS cơ bản. Khi mẫu tái sinh và bật chồi, sau 2-3 tuần cắt chồi
và cấy chuyển sang môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng để
nghiên cứu khả năng nhân nhanh chồi. Khi các chồi dài khoảng 3-5 cm thì tiến
hành cắt và cấy chuyển sang môi trường kích thích tạo rễ, những chồi không
đủ kích thước thì tiếp tục cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh.
Các môi trường thí nghiệm được chỉnh pH đến 5,8 sau đó khử trùng ở
120oC trong thời gian 20 phút.
Các mẫu cấy được nuôi ở điều kiện ánh sáng trắng 12 giờ/ngày, cường độ
3.000 lux, nhiệt độ 25-27 oC .
Đề tài tiến hành 2 thí nghiệm với các phương pháp bố trí thí nghiệm như
sau:
2.4.2.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của loại hóa chất và thời gian khử trùng đến
khả năng tạo mẫu sạch in vitro
Có nhiều hóa chất được sử dụng để khử trùng mẫu cấy nhằm loại bỏ
nguồn bệnh và tạo được lượng lớn các mẫu sạch in vitro, nhưng hai loại hóa
chất được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả cao là HgCl 2 và NaClO.
-


(mẫu) (%)
KT1
KT2

4
6

30
30

KT3

8

30

KT4 Javen
KT5 60%
KT6 (NaClO)

6
12
18

30
30
30

HgCl 2
0,1%

Môi
trường
dinh
dưỡng

Tổng số
mẫu cấy
ban đầu
(chồi)

MT1
MT2
MT3
MT4

½ MS
MS
WPM
B5
(Gamborg)
N6 (Chu)

45
45
45
45

MT5

Số mẫu


x100 (%)

x100 (%)

Số mẫu cho mỗi thí nghiệm ≥ 30 mẫu, Thời điểm thu thập số liệu sau 2
tuần nuôi cấy.
7


2.5.2. Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu được xử lý bằng chương trình Excel
Dùng phương pháp phân tích số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel
2007, các bước tiến hành như sau: mở bảng tính Excel → Data → Data
analysis → Anova single factoc hoặc Anova two factoc with replication →
chọn vùng dự liệu phân tích, vùng xuất dữ liệu và độ tin cậy 0.05→ nhấn Ok.

8


CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
1.6.

Công thức khử trùng thích hợp cho tạo mẫu sạch in vitro
Trong quy trình kỹ thuật nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy

in vitro, tỷ lệ mẫu sạch có khả năng tái sinh chồi có ý nghĩa rất quan trọng đối
với các bước tiếp theo. Vì vậy, cần phải tìm ra công thức khử trùng tối ưu để
nâng cao hiệu quả tạo mẫu sạch in vitro và khả năng nảy chồi của mẫu sạch.
Tuỳ thuộc vào loại chất khử trùng, nồng độ và thời gian khử trùng khác nhau
mà hiệu quả tạo mẫu sạch in vitro thu được khác nhau. Trong nghiên cứu này,

83,3
22
73,3
8
HgCl2
6
30
27
90,0
14
46,6
10
0,1%
8
30
30
100
4
13,3
12
Tổng số

Công
thức

KT1
KT2
KT3
KT4
KT5


30

100

26

86,6

7

Kết quả phân tích phương sai một nhân tố cho thấy F tính (65,3) > F crit
(3,1). Như vậy có sự ảnh hưởng rõ rệt giữa các công thức khử trùng, điều này
cho thấy loại hóa chất sử dụng để khử trùng và thời gian khử trùng có ảnh
hưởng đến khả năng tạo mẫu sạch in vitro của mẫu Bình Vôi.

9


Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, khi khử trùng bằng HgCl 2 0,1% tỷ lệ mẫu
sạch cao (83,3 – 100%) nhưng tỉ lệ mẫu tái sinh lại thấp. Khi tăng thời gian
khử trùng thì tỷ lệ mẫu nẩy chồi giảm xuống rất thấp chỉ đạt 13,3 % ở công
thức KT2 khử trùng bằng HgCl 2 0,1% trong 8 phút và thời gian nảy chồi cũng
chậm hơn. Ở công thức KT1 khử trùng bằng HgCl 2 0,1% trong 4 phút tỷ lệ
mẫu sạch đạt cao nhất đạt 83,3 % và tỷ lệ mẫu nẩy chồi cũng cao nhất đạt
73,3%, thời gian lên chồi là 10 ngày nuôi trên môi trường.
Khi khử trùng mẫu cấy với hoá chất là Javen 60% đem lại kết quả tốt hơn
cho tỉ lệ mẫu sạch và tỉ lệ mẫu tái sinh cao. Thời gian khử trùng 12 phút, tỷ lệ
mẫu sạch và tỷ lệ mẫu tái sinh cao nhất đạt 100%, sau 6 ngày nuôi bộ phận
sinh dưỡng nảy chồi. Với thời gian khử trùng là 6 và 18 phút cho tỷ lệ mẫu tái



này, sử dụng chồi của cây in vitro để cấy vào các loại môi trường dinh dưỡng
cơ bản khác nhau, gồm: Môi trường MS, ½ MS, WPM, B5 Gamborg và Chu
(N6) (Bảng 3.2), các loại môi trường này đều được bổ sung 0,5 mg/l BAP + 8
g/l agar + 30 g/l đường sucrose, nhằm xác định môi trường dinh dưỡng thích
hợp cho tái sinh chồi Bình Vôi in vitro. Kết quả thí nghiệm được thu thập sau 2
tuần nuôi cấy và được thể hiện trong bảng 3.2 dưới đây.
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi Bình
Vôi in vitro
Môi
trường
dinh
dưỡng
½ MS
MS
WPM

Tổng số
mẫu cấy
ban đầu
(chồi)
45
45
45

Số mẫu
tái sinh
chồi
25


45

16

57,78

1,44

-

CTTN
MT1
MT2
MT3

Số chồi
TB/mẫu
1,71
2,35
1,86

Chất
lượng
chồi
+
+++
++

Ghi chú: MS (Murashige and Skoog medium); WPM (Woody Plant

Công thức khử trùng vật liệu nuôi cấy tốt nhất là sử dụng dung dịch Javen

60% (NaClO) trong 12 phút, tỷ lệ mẫu sạch in vitro đạt 100%, tỷ lệ mẫu sạch
tái sinh đạt 100%, thời gian mẫu này chồi sau 6 ngày nuôi.
Công thức môi trường dinh dưỡng thích hợp nhất để tái sinh chồi Bình
Vôi in vitro là môi trường: MS + 0,4 mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin + 8 g/l Agar
+ 30g/l sucrose, cho số chồi trung bình đạt 5,25 chồi/mẫu và chiều cao trung
bình của chồi là 3,85 cm, chất lượng chồi tốt.
1.8. Khuyến nghị
Từ những kết luận và tồn tại ở trên tôi xin đưa ra 1 số khuyến nghị như
sau:
- Thử nghiệm kết quả nghiên cứu vào thực tiễn.
- Tiến hành điều tra đặc điểm sinh vật học của Bình vôi ở nhiều tỉnh khác
nhau để có thể tổng hợp nhận xét và đưa ra kết quả tốt nhất.

14


TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

Đỗ Thị Đào (2008 ), “Ảnh hưởng của một số nhân tố tới kết quả giâm củ

cắt Tai chua ”. Khoá luận tốt nghiệp 2008, GVHD Kiều Văn Thịnh.
2.

Phan Nguyên Hồng, Vũ Văn Dũng (1978); Sinh thái thực vật, NXB Giáo

dục, Hà Nội.
3.


trường và giá thể giâm củ cắt Bạch đàn trắng”, tạp chí Lâm nghiệp dố
10/1996.
12.

Lê Đình Khả, Trần Cự, Lê Thị Xuân (1996 ), “ Nhân giống Thông đỏ

bắng Củ”, tạp chí Lâm nghiệp số 9/1996.
13.

Lê Đình Khả, Nguyễn Đình Hải, Cấn Thị Lan (1998) “ Nhân giống cây

Sao đen bằng thuốc bột TTG”, tạp chí khoa học lâm nghiệp số 8/1998.
15


14.

Ngô Kim Khôi (1998), Thống kê toán học trong Lâm nghiệp, NXB Nông

Nghiệp Hà Nội.
15.

Hoàng Kin Ngũ – Phùng Ngọc Lan: Giáo trình sinh thái rừng, ĐH Lâm

nghiệp, NXB nông nghiệp, Hà Nội.
16.

Lê Đức Thọ (2007 ) “ Nhân giống vô tính chàm (Melaleula caujuputy