hướng dẫn đọc toàn văn báo cáo KQNC

!
!

Bạn muốn đọc nhanh
những thông tin cần thiết ?
Hy đọc qua Mục lục bên tay trái bạn trước khi
đọc báo cáo ( với Acrobat 4.0 trở lên, cho trỏ chuột vào
mỗi đề mục để đọc toàn bộ dòng bị che khuất )

! Chọn đề mục muốn đọc và nháy chuột vào đó
!
!

Bạn muốn phóng to hay thu nhỏ
trang báo cáo trên màn hình ?
Chọn, nháy chuột vào 1 trong 3 kích th
thưước
có sẵn trên thanh Menu

, hoặc

! Mở View trên thanh Menu, Chọn Zoom to
! Chọn tỷ lệ có sẵn trong hộp kích th
thưước
muốn,, Nhấn OK
hoặc tự điền tỷ lệ theo ý muốn

Chúc bạn hài lòng
với những thông tin đđưược cung cấp


Phản biện 3:

Luận án được bảo vệ tại Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường
họp tại:
vào hồi

giờ

phút, ngày

tháng

năm 20

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
1. Thư viện Quốc gia Việt Nam
2. Trung tâm Thông tin & Thư viện Nguyễn Thúc Hào –
Trường Đại học Vinh


1
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Thực vật ở nước ta rất đa dạng và phong phú, số liệu thống kê
gần đây về thực vật bậc cao ở nước ta cho biết có hơn 13.000 loài, đến
năm 2002 đã biết được có 2.270 chi và 305 họ trong đó có khoảng 4.000
loài cây được sử dụng làm thuốc [9], và 600 loài cây cho tinh dầu [6].
Đây là nguồn tài nguyên thiên nhiên rất quý báu của đất nước.
Hiện nay, có nhiều nghiên cứu về thực vật mà chủ yếu là

riêng, có giá trị kinh tế cao, không chỉ dùng để làm cảnh, quả một số loài
ăn rất ngon mà nó còn được sử dụng nhiều trong thuốc y học dân tộc bởi
những hoạt tính sinh học đáng quý của chúng. Ngoài ra, một số cây có
mùi thơm đặc biệt nên được dùng trong các ngành hương liệu.
Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về cây na, nhưng
ở Việt Nam vẫn chưa được nghiên cứu nhiều. Còn đối với dủ dẻ trâu,
các báo cáo về nó vẫn còn khiêm tốn, ở Việt Nam chưa tìm thấy một
công trình nghiên cứu nào về loài cây này. Vì vậy, việc nghiên cứu
thành phần hóa học của loài cây này giúp đánh giá được giá trị của
nguồn tài nguyên thiên nhiên của nước ta. Kết quả nghiên cứu về loài
cây này sẽ mang lại ý nghĩa to lớn đối với ngành dược liệu. Chính bởi
những ưu điểm như thế, chúng tôi nhận thấy sự cần thiết để nghiên cứu
về thành phần hóa học của các cây này. Với những lí do quan trọng nêu
trên chúng tôi thực hiện luận án với tên “Nghiên cứu thành phần hóa
học và hoạt tính sinh học cây na (Annona squamosa L.) và cây dủ
dẻ trâu (Melodorum fruticosum Lour.) thuộc họ Na (Annonaceae) ở
Việt Nam”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Với những lí do nêu trên, chúng tôi xác định mục tiêu nghiên
cứu của luận án gồm những nội dung như sau:
- Xác định được thành phần hóa học và cấu trúc các hợp chất
được phân lập từ cây na và cây dủ dẻ trâu.
- Thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập được
3. Đối tượng nghiên cứu


3
Đối tượng nghiên cứu của luận án là lá cây na (Annona
squamosa L.) thuộc chi Na (Annona) và lá cây dủ dẻ trâu (Melodrum
fruticosum Lour.) thuộc chi Dủ dẻ (Melodorum), hai loài này cùng

bào ung thư vú (MCF-7). Có ba hợp chất phân lập từ lá dủ dẻ trâu lần
đầu tiên được nghiên cứu hoạt tính kháng viêm dựa trên khả năng ức chế
sự tạo thành O2- khi cho bạch cầu trung tính phản ứng với formyl-Lmethionyl-L-leucyl-L-phenylalanin/cytochalasin B (FMLP/CB).
6. Bố cục của luận án
Luận án gồm 124 trang với 24 bảng số liệu, 23 hình và 6 sơ đồ
với 144 tài liệu tham khảo. Kết cấu của luận án gồm: mở đầu (4 trang),
tổng quan (27 trang), phương pháp và thực nghiệm (14 trang), kết quả
và thảo luận (60 trang), kết luận (2 trang), danh mục công trình công bố
(1 trang) và tài liệu tham khảo (16 trang). Ngoài ra còn có phần phụ lục
gồm 114 phổ của các hợp chất (62 trrang) và các dữ liệu tinh thể học
của melodamit A (6 trang)

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
Tổng quan về cây na (Annona squamosa L.) và cây dủ dẻ trâu
(Melodorum fruticosum Lour.) được trình bày với các mục gồm:
- Đặc điểm thực vật
- Thành phần hoá học
- Sử dụng và hoạt tính
CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM
2.1. Hóa chất, thiết bị
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp chiết tách
Sử dụng các dung môi thích hợp để chiết hỗn hợp các chất từ
cao metanol trích từ lá na và lá dủ dẻ trâu
2.2.2. Sắc kí lớp mỏng
Thực hiện trên bản mỏng đã được tráng sẵn silica gel Merck 60
F254, độ dày 0,2 mm. Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254
nm và hiện màu với hơi iot



6
Lá na (10 kg)
- Ngâm với metanol
- Cất thu hồi metanol
Cao metanol (786 g)
- Phân bố trong nước
- Chiết lần lượt với hexan,
etyl axetat, butanol
Cao hexan
(287 g)

Cao etyl axetat
(358 g)

Dịch nước

Cao butanol
(145 g)

Sơ đồ 1: Quy trình chiết tách cao từ lá na
2.4.2. Phân lập các chất
Cao etyl axetat (358g)
CC, silica gel
CHCl3:CH3OH (50:1; 30:1;
20:1; 10:1; 4:1)
F-1
(44 g)
(*)
ASE3 (349 mg)
ASE5 (294 mg)

2.5. Kết quả nghiên cứu chiết tách và xác định cấu trúc các thành phần
hóa học trong lá dủ dẻ trâu
2.5.1. Chiết tách cao
Lá cây dủ dẻ (9,8 kg)
- Ngâm với metanol
- Cất thu hồi metanol
Cao metanol (716 g)

Cao hexan (38 g)

Cao etyl axetat (267 g)

Cao butanol (192 g)

Sơ đồ 3: Quy trình chiết tách cao từ lá dủ dẻ trâu
2.5.2. Phân lập các chất
2.5.2.1. Cao hexan
Cao hexan (38 g)
CC, silica gel
hexan : axeton (9:1, 5:1, 3:1, 1:1)
F-1

F-2
(3 g)

F-3

F-4

F-5

CC, silica gel
hexan:axeton (19:1)
MFE3
(52 mg)

F-10
(15,9 g)

CC, silica gel
hexan:axeton
(15:1, 10:1, 7:1, 5:1)

MFE1 (99 mg), MFE4 (70 mg),
MFE5 (71 mg), MFE7 (35 mg)

CC, silica gel
hexan:axeton
(7:1)

MFE6
(58 mg)

Sơ đồ 5: Quy trình phân lập các chất từ cao etyl axetat của lá dủ dẻ trâu
2.5.2.3. Cao butanol
Cao butanol (192 g)
CC, silica gel
CHCl3:MeOH ( 0 %, 5 %, 10 %, 20 %,
30 %, 50 %, 70 %, 90 %, và 100 %)

F-1

CC, silica gel

CHCl3:CH3OH

CC, silica gel

CHCl3:CH3OH:H2O

CHCl3:CH3OH:H2O

(9:1:0,05)

(4:1:0,05)

(19:1)

(15:1)

MFB8 (39 mg)

MFB10 (87 mg)

MFB11 (14 mg)

MFB12 (45 mg)

MFB13
(97 mg)

MFB9

Axit-ent-kaur-16en-19-oic

C20H30O2

1027

2

ASE2

Axit 16-hydro17-axetoxy-entkauran-19-oic

C22H34O4

246

3

ASE3

Axit-16- hydro-ent
kauran-17,19-dioic

C20H30O4

349

4

ASE4


-sitosterol-3-O-D-glucopyranozit

C35H60O6

342

3.1.3. Điểm nổi bật từ kết quả phân lập các hợp chất trên lá na
3.1.3.1. Cấu trúc các hợp chất phân lập


10
12

12
13

11

2

9

10

3

8

5

4

18

6

14

7

2

COOH

16

12

(ASE3) axit 16hydro-ent-kauran17,19-dioic

5

4

19

OH

14



14

10

(ASE5) 16,17-Dihydroxyent-kauran-19-al

27

22

12

15

CHO

18

(ASE4) Axit 16hydro-19-al-entkauran-17-oic

9

10

3

CHO

16

COOH

14

COOH

18

17

1

8

9
5

4

17

16

20

10

3

15


(ASE1) axit entkaur-16-en-19-oic
1

9

10

3

8

13

11

20

1

16

12

H 17

13

11
17


19

HOH 2C

HO
HO

17

O
5'
3'

2'

O

3

4

5

25
26

16

14 15


OH

(ASE7) -Sitosterol-3-O--D-glucopyranozit
3.1.3.2. Những đóng góp từ kết quả thu được
Những hợp chất ent-kauran ditecpenoit phân lập được đã từng
tìm thấy trong nhiều loài thuộc chi Na (Annona) cùng với hai hợp chất
steroit β-sitosterol (ASE6) và -Sitosterol-3-O--D-glucopyranozit
(ASE7) thường bắt gặp trong hầu hết các loài thực vật. Theo thống kê
các tư liệu tham khảo cho thấy hầu hết các hợp chất đã phân lập được
của luận án đều đã từng được phân lập và công bố trên đối tượng cây na
ngoại trừ hợp chất axit 16-hydro-17-axetoxy-ent-kauran-19-oic
(ASE2) chỉ tìm thấy trong các loài khác thuộc chi này. Cấu trúc các
hợp chất tuy đã được xác định nhưng đây là lần đầu tiên các hợp chất
này được phân lập và xác định cấu trúc từ lá na phân bố ở Việt Nam và
cũng là lần đầu tiên kết quả nghiên cứu từ đối tượng lá na Việt Nam
được công bố.
3.2. Lá cây dủ dẻ trâu (Melodorum fruticosum Lour.)


11
3.2.1. Các hợp chất được phân lập
Các cao chiết ứng với dung môi khác nhau gồm: hexan đã phân lập
được 1 hợp chất, cao etyl axetat phân lập được 6 hợp chất và cao butanol
phân lập được 6 hợp chất, các chất với tên cụ thể được nêu ở bảng 3.9.
Bảng 3.9: Danh mục các chất phân lập từ cây dủ dẻ trâu
ST
T
1
2

MFB9

10
11

MFB10
MFB11

12

MFB12

13

MFB13

Tên hợp chất
Melodamit A
β-Sitosterol
Flavokawain A
2',6'-Dihydroxy-4'metoxychalcon
2',4'-Dihydroxy-4,6'dimetoxydihydrochalcon
4',5-Dimetoxy-7hydroxyflavanon
(Tsugafolin)
5-O-Metylnaringenin
(7,4′-dihydroxy-5metoxyflavanon)
Naringenin - 4',7dimetylete
Kaempferol 3-O{-D-apiofuranozyl(12)[-L-rhamnopyranozyl(16)]-D-glucopyranozit}
Rutin
Oxoanolobin

39

C32H38O19

12

C27H30O16
C17H10NO4

87
14

C17H12O8

45

C35H60O6

97


12
3.2.2. Xác định cấu trúc các hợp chất
3.2.2.1. Hợp chất MFE1
Hợp chất MFE1 đã được phân lập có dạng chất bột không màu,
28 ,8
đ.n.c 183–185°C. Độ quay cực  D = 0,001 (CH3OH, c 1,53) cho
thấy hợp chất này không quang hoạt.
Phổ ESI-MS (positive) cho pic ion giả phân tử [M+H]+ ở m/z
284, còn phổ ESI-MS (negative) cho pic ion giải phân tử [M-H]- ở m/z

bảng 3.10).
Phổ 13C-NMR, DEPT và kết hợp với phổ HSQC cho thấy tín
hiệu của 17 cacbon gồm một nhóm xeton liên hợp ( 185,2 ppm), một
amit liên hợp ( 164,8 ppm), hai tín hiệu cacbon olefin ( 138,6 và
122,1 ppm), hai cacbon olefin liên hợp đối xứng ( 152,8, 126,8 ppm),
tín hiệu của sáu cacbon thơm (δ 134,9, 129,4, 129,4, 128,9, 127,5,
127,5 ppm) một cacbon bậc bốn có gắn oxi (δ 67,8 ppm), hai nhóm
metylen (δ 39,0 và 34,2 ppm). Xác định vị trí các nhóm thế dựa vào
phổ HMBC, mối tương quan giữa H-2 (δ 6,56 ppm) với C-1 (δ 164,8
ppm)/ C-3 (δ 138,6 ppm)/ C-4 (δ 134,9 ppm) từ đó xác định được thứ
tự amit cinnamic của hợp chất MFE1. Tương quan của proton nhóm
amit ( 8,09 ppm) với C-1 ( 164,8 ppm)/C-1' (34,2 ppm), proton
nhóm hydroxyl  5,83 ppm với C-2' ( 39,0 ppm)/C-3' ( 67,8
ppm)/C-4' ( 152,8 ppm)/C-8' (152,8 ppm). Ngoài ra, vòng B có cấu
trúc của một cyclohexadienon xuất hiện tại tín hiệu H-5'/H-7' (δ 6,09
ppm) và H-4'/H-8' (δ 6,94 ppm) đều có tương quan với C-3' (δ 67,8
ppm) và C-6' (δ 185,2 ppm). Thêm vào đó, các pic giao nhau của H-1'
(δ 3,18 ppm) tương quan với C-1 (δ 164,8 ppm)/C-2′ (δ 39,0 ppm)/C-3′
(δ 67,8 ppm) và của H-2′ (δ 1,83 ppm) với C-1′ (δ 34,2 ppm)/ C-3′ (δ
67,8 ppm)/C-4′ (δ 152,8 ppm)/C-8′ (δ 152,8 ppm), phổ HMBC cho
thấy amit liên hợp và vòng B liên kết với C-1' và C-2' (hình 3.8 – hình
3.17 và bảng 3.10).
Bảng 3.10: Số liệu phổ DEPT và HMBC của hợp chất MFE1
C (ppm)
Vị trí
H (ppm)
HMBC
1
164,8
2

127,5
C-3, C-5, C-7
1'
3,18 (2H, dd, J = 14,0, 7,0 Hz)
34,2
C-1, C-2', C-3'
2'
1,86 (2H, t, J = 7,0Hz)
39,0
C-1', C-3', C-4', C-8'
3'
67,8
4'
6,94 (1H, d, J = 8,5 Hz)
152,8
C-3', C-6'
5'
6,09 (1H, d, J = 8,5 Hz)
126,8
C-3', C-6'
6'
185,2
7'
6,09 (1H, d, J = 8,5 Hz)
126,8
C-3', C-6'
8'
6,94 (1H, d, J = 8,5 Hz)
152,8
C-3', C-6'


4'

5'

1'

1

6'

3'

N

2'

O

H
HMBC

Hình 3.18: Tương tác HMBC và cấu trúc của Melodamit A (MFE1)

Bên cạnh đó, cấu trúc của hợp chất melodamit A còn được
khẳng định qua kết quả về tinh thể học được xác định bằng nhiễu xạ tia
X. Sau đây là các thông tin về tinh thể của MFE1.
Bảng 3.11: Một số thông số về hình học của tinh thể MFE1
Dữ liệu tinh thể
Hệ tinh thể: monoclinic

Phản xạ tự do 2619
θmin = 4,96o
Máy đơn sắc: graphite
h = -9  10
Dạng hiệu chỉnh hấp thụ: k = -12  12
multi-scan
T = 100 K
l = -21  24
Cấu trúc tinh tế
wR (F2) = 0,0857
w = 1/[2(Fo2) + (0,0495P)2 + 0,4542P]
S = 1,036
trong đó: P = (Fo2 + 2 Fo2)/3
Số thông số: 200
Các thông số về độ dài liên kết và góc liên kết (xem phụ lục trang
PL-64-67)

Hình 3.19: Cấu trúc đơn tinh thể nhiễu xạ tia X của melodamit A
3.2.3. Điểm nổi bật từ kết quả phân lập các hợp chất trên lá dủ dẻ trâu
3.2.3.1. Cấu trúc các hợp chất phân lập


16
O

HO

3

5

O

5'

4'

8

2

8

14

10

(MFE1) Melodamit A (chất mới)
3

6'

4'

OCH3

5

4

6

8

O

OH

6

HO

O

8

7

3'
8

OH
4'

1'

O

9

6



O

3

(MFB8) Naringenin – 4',7dimetylete

OH

6'

O
6''

6'

O

5''

4''

HO
HO

6
5

O


2''''

OH OH

1
O 2 1'

9

2'

1''

O
5''''

8

HO 7

2''
3''

4''''

5'

5

5'

O

9

4'

1'
2

OCH3O

1

1

8

H3CO

(MFE7) 5-O-Metylnaringenin
(7,4′-dihydroxy-5-metoxyflavanon)
8

3

(MFE6) Tsugafolin hay
4',5-dimetoxy-7-hydroxyflavanon)

3



2'

6'''

1
2

1

OCH3

2'

5

1

(MFE5) 2',4'-Dihydroxy-4,6'dimetoxydihydrochalcon

HO

1

(MFE4) 2,6'-Dihydroxy-4'-metoxychalcon



1'


6'

4'

(MFE3) Flavokawain A

HO

OH
7

OH

4

6

8

9

3'

HO

15

7
3


19

1

2

20

18
12

9

27

22

5''

O
6''' 5'''

H3C
HO

4'''

O
HO



4

1

4'

1'
5'

O

3

3a

5

N6

O

6'

1

7a

10



17
13
8

25
26

16

14 1 5

10

6'

22
20

18

11
9

2

HO
HO

O


4

2

O

OH

1b

2'

O

3

5

6

7
6

1'

OH

(MFB13) -Sitosterol-3-O--Dglucopyranozit
3.2.3.2. Những đóng góp từ kết quả thu được

gan (Hep-G2- Human hepatoma), ung thư phổi (Lu- Human lung
carcinoma) và ung thư vú (MCF-7- Human breast adenocarcinoma).
Các giá trị trong bảng 3.22 cho thấy các hợp chất ASE4 và
ASE2 thể hiện hoạt tính với các dòng tế bào thử nghiệm đều có các giá
trị % CS > 50%, điều đó có nghĩa là khả năng gây độc tế bào của chúng
rất yếu nên xem như không thể hiện hoạt tính với thử nghiệm này. Các
hợp chất với giá trị % CS < 50% sẽ được chọn để tiếp tục thử nghiệm.
Bảng 3.22: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào theo công thức Ducan
Nồng
Dòng tế bào
KH
T
độ
Cell survival (%)
Kết luận
mẫu
T
Lu
MCF-7
(g/ml) Hep-G2
DMSO
Chứng
(+)
1

ASE1

100,0  0,0 100,0  0,0 100,0 0,0

5


88,20,6

68,5  1,0

Âm tính

3

ASE4

5

85,6  1,2

92,5  1,2

95,1  0,6

Âm tính

4

ASE5

5

69,3  0,4

90,8  1,1

2

ASE5

>5

>5

2,594

Kết luận
Dương tính
Dương tính với
dòng Hep-G2
và MCF-7
Dương tính với
dòng MCF-7

Hợp chất ASE5 ức chế mạnh dòng tế bào ung thư vú (MCF-7)
với IC50 là 2,594, còn hợp chất ASE1 ức chế mạnh dòng tế bào ung thư
gan (Hep-G2) và ung thư vú (MCF-7) với giá trị IC50 tương ứng là 3,14
và 1,799. Như vậy, hai hợp chất này đều có khả năng ức chế mạnh các
dòng tế bào ung thư, trong đó, cả hai hợp chất ASE1 và ASE5 đều ức
chế được tế bào ung thư vú, nhưng hợp chất ASE1 có khả năng ức chế
mạnh hơn hợp chất ASE5 vì IC50 (ASE1) < IC50 (ASE5).
3.3.2. Hoạt tính tạo ra các anion peroxit và giải phóng elastase
Trong các hợp chất sạch được phân lập từ lá dủ dẻ trâu
(Melodorum fruticosum Lour.) có 8 hợp chất gồm: MFE1, MFE3,
MFE7, MFE4, MFE6, MFB8, MFB10, MFB12 được tiến hành thử
nghiệm để đánh giá khả năng kháng viêm dựa trên khả năng ức chế sự

MFE8
(7,69 ± 5,72)
(-4,54 ± 1,44)*
MFB10
(39,46 ± 2,29)***
(10,06 ± 4,75)
*
MFB12
(3,08 ± 0,88)
(14,91 ± 5,97)
b
Sorafenib
3,44 ± 0,29
1,00 ± 0,60
b
SB202190
6,73 ± 0,65
(5,53 ± 3,50)
Percentage of inhibition (Inh %) ở nồng độ 10 µM. Các kết quả được biểu thị
bằng giá trị trung bình ± SEM (n =3).
*

p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 so sánh với giá trị đối chứng. a Nồng độ

cần thiết để ức chế 50% (IC50). b Sorafenib tosylate và SB202190 được sử dụng làm
chất đối chứng dương.

Từ các số liệu thu được ở bảng 3.23 cho ta biết chỉ có ba hợp
chất MFE1, MFE3, MFE4 thể hiện khả năng ức chế sự tạo thành
anion peoxit và không có hợp chất nào thể hiện khả năng ức chế quá



22
KẾT LUẬN
Lần đầu tiên ở Việt Nam, có công trình khoa học báo cáo về
thành phần hóa học và cả về hoạt tính sinh học của các chất phân lập từ
lá cây na (Annona squamosa L.) và lá cây dủ dẻ trâu (Melodorum
fruticosum Lour.).
Nghiên cứu thành phần hoá học lá cây na và lá cây dủ dẻ trâu
của Việt Nam chúng tôi đã thu được một số kết quả như sau:
 Từ dịch chiết lá cây na (Annona squamosa L.) đã phân lập
và xác định cấu trúc 5 hợp chất ent-kauran diterpenoit: axit ent-kaur16-en-19-oic (ASE1), axit 16-hydro-17-axetoxy-ent-kauran-19-oic
(ASE2), axit 16- hydro-ent-kauran-17,19-dioic (ASE3), axit 16hydro-19-al-ent-kauran-17-oic (ASE4), 16,17-dihydroxy-ent-kauran19-al (ASE5) và 02 hợp chất steroit là: β-sitosterol (ASE6) và sitosterol-3-O--D-glucopyranozit (ASE7).
 Từ dịch chiết của lá cây dủ dẻ trâu (Melodorum fruticosum
Lour.) đã chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc được 13 hợp chất
bao gồm:
- 01 hợp chất amit thơm mới là melodamit A (MFE1),
- 08 hợp chất flavonoit là: flavokawain A (MFE3), 2,6’dihydroxy-4’-metoxychalcon
(MFE4),
2’,4’-dihydroxy-4,6’dimetoxydihydrochalcon
(MFE5),
tsugafolin
(MFE6),
5-Ometylnaringenin (MFE7), naringenin - 4',7- dimetylete (MFB8),
kaempferol
3-O-{-D-apiofuranozyl-(12)-[-L-rhamnopyranozyl(16)]--D-glucopyranozit} (MFB9), rutin (MFB10),
- 01 hợp chất ankaloit là oxoanolobin (MFB11),
- 01 hợp chất tannin là axit 3,3’,4’- trimetoxy ellagic (MFB12),
- 02 hợp chất steroit là β-sitosterol (MFH2) và -sitosterol3-O--D-glucopyranozit (MFB13).