BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRẦN THỊ HÀ

KHẢO SÁT ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA KIT THỬ
RED PYROGALLOL-MOLYBDAT
ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NIỆU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh
2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRẦN THỊ HÀ

KHẢO SÁT ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA KIT THỬ
RED PYROGALLOL-MOLYBDAT
ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NIỆU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Kết luận
Chúng tôi xác định được tuổi thọ của thuốc thử red pyrogallol molybdat pha được là
30 tháng.


Final essay for the degree of B.S.Pharma
Academic year: 2013 -2014
EXAMINE THE STABILITY OF THE PYROGALLOL RED MOLYBDATE
TEST KIT FOR QUANTITATIVE PROTEINURIA
Tran Thi Ha
Supervisor: MA. Nguyen Thi Minh Thuan
Abstract
Introduction and objectives: Like other drug products, reagents products use in
biochemistry should also ensure efficiency and quality from production to the end
use. So manufacturers have to study the stability of preparations to determine the
longevity of medication and take out of life shelf. We take this subject with the aim
of examining the stability of pyrogallol red test kit-molybdates proteinuria to
quantify the processes optimized.

Matherials and method: Three batches of reagent red pyrogallol molybdate were
mixed. Proteinuria was determined by a spectrophotometry method using RPM
reagent with the process optimized. This process was evaluated. Then, 3 batches of
red pyrogallol molybdate reagents produced according to the formula which is
optimized were examined the stability by using the long term, accelerate and cause
stress method. Based on demographic to calculate the longevity of 3 batches
according to Van't Hoff approach and calculated the average life expectancy of a
reagent.
Results: Optimal quantitative process achieves the required of validation criteria.
The lifespan of reagent is calculated by the Van't Hoff method is 30 months.
Conclusion: We determined the longevity of red pyrogallol molybdat reagent which


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Từ gốc

Ý nghĩa

Abs

Absorbance

Độ hấp thu

BCA

Bicinchoninic acid

BN

Bệnh nhân

CV

Coefficient of variation

EDTA

Ethylen diamin tetraacetic acid


Relative Humidity

RP

Red Pyrogallol

RPM

Red Pyrogallol – Molybdat

RSD

Relative standard deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

SD

Standard deviation

Độ lệch chuẩn

TB

Trung bình

UV – Vis

Ultraviolet – Visible



11

Chương 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Cũng như các thành phẩm thuốc, các sản phẩm thuốc thử sử dụng trong sinh hóa
cũng cần đảm bảo hiệu quả và chất lượng từ khi sản xuất đến khi hết hạn dùng. Bởi
vậy ở bất kì nước nào, khi nghiên cứu đưa ra thị trường một chế phẩm thuốc hay
thuốc thử, bên cạnh các nghiên cứu công thức, hiệu quả, tác dụng… nhà sản xuất
phải nghiên cứu độ ổn định của chế phẩm để xác định tuổi thọ của chế phẩm và đưa
ra hạn dùng. Phương pháp nghiên cứu đa được ly thuyết hóa theo các quy định
chung nhất. Có thể nghiên cứu độ ổn định theo phương pháp bảo quản dài hạn ở
điều kiện bảo quản tự nhiên hay bảo quản ngắn hạn ở điều kiện lao hóa cấp tốc hoặc
cả hai.
Theo quy chế đăng kí lưu hành thuốc của Bộ y tế Việt Nam, một trong những điều
kiện để chế phẩm được lưu hành là phải có đề cương và kết quả nghiên cứu độ ổn
định của chế phẩm, tuổi thọ của chế phẩm phải lớn hơn hạn dùng [4].
Protein niệu là một trong những xét nghiệm thường quy đóng vai trò quan trọng
trong chẩn đoán và điều trị các bệnh liên quan đến thận, tim và chức năng tuyến
giáp. Thuốc thử red pylogallol – molybdat (RPM) được sử dụng rộng rai trên thế
giới và Việt Nam trong xác định protein niệu. Nhưng ở nước ta hiện nay chưa có cơ
sở nào sản xuất thuốc thử này. Trong các nghiên cứu trước đây, Phùng Thị Hoàng
Nhi đa thực hiện đề tài “Thiết kế và tối ưu hóa quy trình định lượng protein niệu
bằng phương pháp red pyrogallol molybdat”. Tuy nhiên đề tài mới chỉ xây dựng
được công thức thuốc thử và quy trình tiến hành định lượng protein niệu tối ưu mà
chưa tiến hành khảo sát độ ổn định của thuốc thử.
Vì vậy nhằm hướng đến mục tiêu sản xuất rộng rai bộ kit thử RPM để phục vụ công
tác nghiên cứu và sử dụng trong xét nghiệm, chúng tôi tiếp tục thực hiện đề tài
“Khảo sát độ ổn định của kit thử red pyrogallol – molybdat để định lượng protein
niệu” với quy trình đa được tối ưu hóa bằng phần mềm INForm v4.0, 2010
(Intelligensys Ltd) [9]. Mục tiêu của đề tài là:

PHÂN LOẠI PROTEIN NIỆU

Phân tích protein niệu bằng điện di, người ta phân biệt được hai loại protein niệu
nguồn gốc cầu thận và nguồn gốc ống thận [10].

2.2.1. Protein niệu do cầu thận
Thường do tăng tốc độ lọc qua cầu thận hoặc do tăng độ khuếch tán khi nồng độ
protein trong máu cao [10]. Khi lượng protein trên 3500 mg trong nước tiểu mỗi
ngày thì gọi là hội chứng thận hư [3].
Protein niệu do độ lọc cầu thận tăng khi nước tiểu có albumin huyết tương (như:
hemoglobin, chuỗi nhẹ của globin trong u tủy…). Trường hợp này thường do tổn
thương cầu thận làm tăng độ thẩm thấu của thận, gặp ở các bệnh ly như viêm cầu
thận, viêm thận nhiễm mỡ [10].
Protein niệu do độ khuếch tán tăng là khi nước tiểu có albumin và các protein có
kích thước lớn hơn albumin. Thường gặp trong trường hợp nồng độ protein ở máu
cầu thận tăng hoặc khi có sự ứ đọng lưu lượng cầu thận tiếp giáp với màng lọc như
protein niệu do suy tim, tắc tĩnh mạch thận, có thai …[10].
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại họcChương 2. Tổng quan


14

2.2.2. Protein niệu do ống thận
Trường hợp này ít gặp hơn, trong nước tiểu xuất hiện các protein có trọng lượng
phân tử nhỏ hơn albumin (đặc biệt là α1 và β2 microglobulin). Nguyên nhân là do rối
loạn tái hấp thu protein đa được lọc bình thường bởi cầu thận. Thường gặp trong
các trường hợp tổn thương bẩm sinh ống thận ở trẻ em, ngộ độc bởi kim loại nặng.
Ngoài ra, cũng có thể gặp protein niệu do viêm hoặc tổn thương đoạn dưới của
đường tiết niệu, bàng quang hay niệu quản, gọi là protein niệu sau thận [10].
Tỷ lệ albumin/ globulin trong protein niệu từ 5 – 10. Tỷ lệ này tăng trong viêm thận

− Globulin niệu chọn lọc: Chủ yếu có α1 và β – globulin. Tỷ lệ albumin huyết
thanh thấp do nguồn gốc ống thận, gặp trong viêm ống thận kẽ cấp, viêm ống
thận bẩm sinh, bệnh Wilson, galactose niệu.
− Protein niệu Bence – Jones có β, γ– globulin với sự hiện diện của albumin huyết
thanh hoặc không, còn gọi là protein nhiệt tan (chỉ tủa ở 60 – 70 oC) gặp trong
đau tủy xương.

2.4.

CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NIỆU
2.4.1. Phương pháp đo độ hấp thu tử ngoại
Có hai phương pháp đo độ hấp thu tử ngoại là đo độ hấp thu ở bước sóng 205 nm và
ở bước sóng 280 nm.

2.4.1.1. Đo độ hấp thu ở bước sóng 205 nm
Nguyên tắc: Liên kết peptid hấp thụ ánh sáng ở bước sóng tối đa dưới 210 nm. Tuy
nhiên, đỉnh hấp thu rộng của liên kết peptid cho phép đo ở các bước sóng dài hơn,
có thể có nhiều lợi thế thực tế về thiết bị và sự chính xác của phép đo. Do sự tác
động từ các dung môi và các thành phần của đệm sinh học, độ hấp thu thường được
đo ở bước sóng từ 214 – 220 nm [22], [24].
Ưu điểm: Dễ thực hiện, nhạy hơn và ít biến đổi hơn phép đo ở 280 nm do trong
phân tử protein có một lượng lớn liên kết peptid. Định lượng các dung dịch pha
loang. Có thể sử dụng để đo lường liên tục trong sắc ky cột hoặc để phân tích các
chuỗi acid amin chứa rất ít acid amin thơm [22], [24].
Nhược điểm: Độ chính xác không cao, bị ảnh hưởng bởi các chất can thiệp như chất
tẩy rửa, acid nucleic, các giọt mỡ [22], [24].

2.4.1.2. Đo độ hấp thu ở bước sóng 280 nm

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại họcChương 2. Tổng quan

Nguyên tắc chung: Protein bị kết tủa bởi các tác nhân hóa học, sau đó đem đo độ
đục trên máy đo quang.
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại họcChương 2. Tổng quan


17

2.4.3.1. Phương pháp dùng acid sulfosalicylic
Nguyên tắc: Acid sulfosalicylic kết hợp với protein tạo thành tủa. Đo độ đục của
dung dịch ở bước sóng 600 nm [2], [16].
Ưu điểm: Đặc hiệu, nhạy với albumin hơn các protein khác.
Nhược điểm: Độ chính xác không cao, bị cản trở bởi một số chất khác trong nước
tiểu.

2.4.3.2. Phương pháp dùng acid tricloracetic
Nguyên tắc: Acid tricloracetic gây kết tủa protein. Dung dịch thu được đem đo độ
đục ở bước sóng 420 nm [16].
Ưu điểm: Ít bị ảnh hưởng bởi các chất trong nước tiểu hơn phương pháp acid
sulfosalicylic.
Nhược điểm: Bị ảnh hưởng bởi các thuốc, phải bảo quản nước tiểu luôn luôn ở 20 –
25 oC.

2.4.3.3. Phương pháp dùng benzethonium clorid
Nguyên tắc: Benzethonium clorid tạo tủa với protein trong môi trường kiềm. Đo độ
đục ở bước sóng 505 nm [16].
Ưu điểm: Độ đục ổn định, ít bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ hơn hai phản ứng trên.
Nhược điểm: Tạo độ đục khác nhau đối với các protein khác nhau.

2.4.4. Phương pháp đo màu
2.4.4.1. Phương pháp biuret

Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng biuret, gồm 2 giai đoạn:

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại họcChương 2. Tổng quan


19
− Giai đoạn 1: Phản ứng Biuret: Cu 2+ phản ứng với các acid amin cystein, cystin,
tryptophan, tyrosin và các liên kết peptid tạo thành Cu+.
− Giai đoạn 2: BCA tạo phức chelat với Cu+ tạo thành sản phẩm màu tím đậm. Đo độ
hấp thu ở bước sóng 540 – 590 nm, hấp thu cực đại ở 562 nm [22], [24], [27].

Hình 2.2. Phản ứng BCA với Cu+
Ưu điểm: Tăng độ nhạy cảm và khoảng tuyến tính so với phương pháp Lowry.
Nhược điểm: Bị tác động bởi nhiều chất cũng có khả năng tạo phức với Cu +
(EDTA, đường khử…).

2.4.4.4. Phương pháp Bradford
Nguyên tắc: Dựa trên sự thay đổi màu sắc của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant
Blue G – 250 khi tạo phức với protein trong môi trường acid dẫn đến sự thay đổi
bước sóng hấp thu cực đại. Khi chưa kết hợp với protein, thuốc nhuộm tồn tại ở
dạng cation có màu nâu xanh lá hấp thu cực đại ở 465 nm. Khi đa tạo phức với
protein sẽ chuyển thành dạng anion có màu xanh dương hấp thu cực đại ở 595 nm
[14], [22], [27].

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại họcChương 2. Tổng quan


20

Hình 2.3. Phản ứng của Coomassie Brilliant Blue G – 250

mặt của các chất khác có trong mẫu thử [6], [32].

2.5.2. Tính tuyến tính
Tính tuyến tính của quy trình phân tích là khả năng luận ra các kết quả của phương
pháp dựa vào đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng của đại lượng đo được
và nồng độ [6], [32].
Để xây dựng đường tuyến tính, sử dụng day nồng độ thường gồm từ 6 đến 8 mẫu,
trong đó có mẫu ở nồng độ giới hạn định lượng dưới (LLOQ). Để đường chuẩn có y
nghĩa thì ít nhất 4 trong 6 mẫu định lượng có độ lệch thực nghiệm ≤ 20% (đối với
mẫu ở nồng độ LLOQ) hoặc ≤ 15% (đối với các mẫu có nồng độ lớn hơn LLOQ)
[6].
Tính chất tuyến tính được biểu thị bằng hệ số tương quan R hay giá trị bình phương
của hệ số tương quan R2. Nếu sự phụ thuộc tuyến tính, ta có khoảng khảo sát đường
biểu diễn là một đoạn thẳng tuân theo phương trình [6]: y = bx + b0.

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại họcChương 2. Tổng quan


22

2.5.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
2.5.3.1. Giới hạn phát hiện (LOD)
Giới hạn phát hiện của một quy trình là lượng thấp nhất của chất cần phân tích
trong mẫu mà còn có thể phát hiện được nhưng không nhất thiết phải chính xác hàm
lượng [6], [32].

2.5.3.2. Giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn định lượng của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất cần
phân tích có trong mẫu thử còn có thể xác định với độ đúng, độ chính xác thích hợp
[6].


ĐỘ ỔN ĐỊNH
2.6.1. Đại cương vê độ ổn định
2.6.1.1. Một số khái niệm

− Độ ổn định của thuốc là khả năng của thuốc (nguyên liệu hay thành phẩm) giữ
nguyên các đặc tính vốn có về vật ly, hóa học, vi sinh học, các đặc tính trị liệu và
độc tính trong một khoảng thời gian nhất định được bảo quản trong đồ bao gói
chuyên dụng trong một điều kiện bảo quản nhất định [7], [34].
− Tuổi thọ của thuốc là khoảng thời gian mà thuốc còn đáp ứng các yêu cầu chất
lượng như đa quy định trong điều kiện bảo quản đúng [7].
Hiện nay, hạn dùng là khoảng thời gian mà [7]:
• Thuốc vẫn được ổn định khi được bảo quản trong những điều kiện qui định.
• Thuốc vẫn còn giữ được 90% hàm lượng hoạt chất ghi trên nhan (trừ một số
trường hợp đặc biệt)
• Tạp phân hủy chưa vượt quá giới hạn cho phép
Hạn dùng = tuổi thọ + thời điểm xuất xưởng
− Vùng khí hậu: theo WHO, thế giới được chia thành 4 vùng khí hậu như bảng 2.1
[34].
Bang 2.1. Vùng khí hậu theo WHO
Vùng khí hậu

Tính chất

Điêu kiện bao quan

Nước tiêu biểu

I


Theo sự phân chia này, Việt Nam thuộc vùng khí hậu IV.
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại họcChương 2. Tổng quan


24

2.6.1.2. Mục tiêu nghiên cứu độ ổn định
Độ ổn định là một yếu tố quan trọng của chất lượng, độ an toàn và hiệu lực của chế
phẩm. Chế phẩm sau khi sản xuất và trước khi đến tay người tiêu dùng phải trải qua
một quá trình từ khâu tồn trữ, vận chuyển. Độ ổn định là một yêu cầu chung của chế
phẩm có chất lượng [7].
Thuốc phải ổn định trong thời gian dự kiến. Độ ổn định của thuốc được đặc trưng
bằng hạn dùng. Vì vậy nghiên cứu độ ổn định để xác định tuổi thọ, từ đó có thể xác
định hạn dùng của chế phẩm. Đây là một nghiên cứu bắt buộc trước khi làm hồ sơ
đăng ky xin phép lưu hành ngoài thị trường. Do vậy thuốc trước khi đưa vào sản
xuất rộng rai cần phải nghiên cứu độ ổn định để tránh:
− Sự giảm hàm lượng thuốc trong quá trình sản xuất, tồn trữ dẫn đến giảm tác dụng trị
liệu dưới mức quy định so với hàm lượng ghi trên nhan.
− Sự xuất hiện các tạp chất do thuốc bị phân hủy trong quá trình bảo quản, vận
chuyển [7].

2.6.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định
Độ ổn định của chế phẩm chịu ảnh hưởng của 2 yếu tố chủ yếu là:
− Yếu tố nội tại: phụ thuộc bản chất của chế phẩm.
− Yếu tố ngoại cảnh: bao gói, môi trường…

 Yếu tố nội tại
Bao gồm:
− Cấu trúc hóa học của dược chất và nguyên phụ liệu.
− Nồng độ, hàm lượng hoạt chất trong chế phẩm.


2.6.2.2. Các phương pháp nghiên cứu độ ổn định
Các tài liệu đề cập tới ba phương pháp: phương pháp thử dài hạn, phương pháp lao
hóa cấp tốc, phương pháp sử dụng điều kiện khắc nghiệt (gây stress) [13], [18],
[34].
 Phương pháp dài hạn
Là phương pháp nghiên cứu độ ổn định trong điều kiện bảo quản được ghi trên
nhan chế phẩm. Là thử nghiệm đánh giá tính chất hóa ly, sinh học, vi sinh học của
một sản phẩm trong suốt thời gian dự kiến tuổi thọ của thuốc trong điều kiện bảo
quản phù hợp [7], [13], [18], [34].
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại họcChương 2. Tổng quan