TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA SƯ PHẠM
BỘ MÔN HÓA HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT QUY TRÌNH
XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ETHOXYQUIN
TRÊN THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG SẮC
KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
Chuyên ngành: Sư phạm Hóa Học

Giáo viên hướng dẫn:
TS. Nguyễn Thị Thu Thủy
CN. La Văn Thái

Sinh viên thực hiện:
Đặng Thị Xuân Hoa
Lớp: Sư phạm Hóa Học K38
MSSV: B1200580

CẦN THƠ - 2016


Luận văn tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Thời gian làm luận văn tôi đã luôn học tập và tích lũy được nhiều kiến thức,
nhiều kinh nghiệm làm hành trang vững chắc giúp tôi bước đi trên con đường sắp
tới. Để đạt được những kết quả như ngày hôm nay ngoài nổ lực bản thân; tôi luôn
nhận được sự động viên, giúp đỡ của gia đình, thầy cô, bạn bè vào những lúc khó

------------...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
Cần Thơ, ngày

tháng

năm 2016

Chữ kí cán bộ hướng dẫn


năm 2016

Chữ kí cán bộ phản biện

iii


Luận văn tốt nghiệp

NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN
------------...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................

1.1. CƠ SỞ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO .......................................................... 3
1.1.1. Khái niệm ..............................................................................................................3
1.1.2. Các phương trình và đại lượng cơ bản trong HPLC .............................................3
1.1.3. Các kiểu sắc ký lỏng hiệu năng cao.......................................................................7
1.1.3.1. Sắc ký pha thường .............................................................................................. 7
1.1.3.2. Sắc ký trao đổi ion .............................................................................................. 7
1.1.3.3. Sắc ký hấp phụ.................................................................................................... 7
1.1.3.4. Sắc ký pha đảo .................................................................................................... 8
1.1.4. Các cách rửa giải trong HPLC...............................................................................8
1.1.5. Giới thiệu thiết bị HPLC .......................................................................................9
1.2. TỔNG QUAN VỀ CHẤT BÉO (LIPIT) VÀ CHẤT CHỐNG OXY HÓA
ETHOXYQUIN ............................................................................................................. 16
v


Luận văn tốt nghiệp
1.3. TÌM HIỂU CHUNG VỀ ETHOXYQUIN ............................................................. 17
1.3.1. Công thức phân tử, công thức cấu tạo và một số tính chất của ethoxyquin ........17
1.3.2. Tác hại của ethoxyquin ........................................................................................18
1.3.3. Một số ứng dụng chủ yếu của ethoxyquin........................................................... 18
1.3.4. Tình hình nghiên cứu về Ethoxyquin ..................................................................18
1.3.4.1. Tình hình sử dụng ethoxyquin trong thức ăn thuỷ sản ..................................... 18
1.3.4.2. Một số nghiên cứu về ethoxyquin .................................................................... 19
1.3.4.3. Qui định mức dư lượng tối đa của ethoxyquin ................................................. 20
Chương 2: THỰC NGHIỆM ......................................................................................... 21
2.1. DỤNG CỤ, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT .............................................................. 21
2.1.1. Thiết bị, dụng cụ ..................................................................................................21
2.1.2. Hóa chất ...............................................................................................................21
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................... 22
2.2.1. Phương pháp thu mẫu ..........................................................................................22

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 43
1. Kết luận...................................................................................................................... 43
2. Kiến nghị ................................................................................................................... 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 45
PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 48

vii


Luận văn tốt nghiệp

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Các chữ viết tắt
C

Độ Celcius

µl

microliters

ACN

Acetonitrile

AOAC

Association Of Analytical Communities

CRM


parts per billion

ppm

parts per million

PTN

Phòng Thí Nghiệm

QC

Quality Control – Kiểm soát và kiểm tra chất lượng.

QUECHERS

Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe – Nhanh, dễ, rẻ,
hiệu quả, ổn định, an toàn.

TACN

Thức ăn chăn nuôi.

TAGC

Thức ăn gia cầm.

TACC


TACC 17) ...................................................................................................................... 38
Hình 3.5. Đường chuẩn xác định hàm lượng ethoxyquin trong TACC ( từ TACC 18 –
TACC 37) ...................................................................................................................... 38
Hình 3.6. Đường chuẩn xác định hàm lượng ethoxyquin trong TAGC và TACH....... 40

ix


Luận văn tốt nghiệp

DANH SÁCH BẢNG BIỂU
Trang
Bảng 1.1. Qui định giới hạn cho phép của ethoxyquin trong thức ăn chăn nuôi, thực
phẩm ............................................................................................................................. 20
Bảng 2.1. Số lượng các mẫu thức ăn chăn nuôi được phân tích .................................. 22
Bảng 2.2. Độ lặp lại chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC) .................. 27
Bảng 2.3. Độ thu hồi chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC). ................ 28
Bảng 3.1. Tương quan giữa diện tích pic và nồng độ chuẩn Ethoxyquin .................... 30
Bảng 3.2. Độ lặp lại của tín hiệu đo với chuẩn ethoxyquin trên nền mẫu thức ăn chăn
nuôi ............................................................................................................................... 31
Bảng 3.3. Hiệu suất thu hồi của ethoxyquin trên nền mẫu thức ăn chăn nuôi. ............ 33
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát MLOD và MLOQ trên nền mẫu thức ăn chăn nuôi......... 35
Bảng 3.5. Kết quả phân tích hàm lượng chất chống oxy hóa ethoxyquin trên 84 mẫu
thức ăn chăn nuôi .......................................................................................................... 36
Bảng 3.6. Kết quả phân tích hàm lượng ethoxyquin trên nền mẫu thức ăn cho tôm... 37
Bảng 3.7. Kết quả phân tích hàm lượng ethoxyquin trên nền mẫu thức ăn cho cá ..... 39
Bảng 3.8. Kết quả phân tích hàm lượng ethoxyquin trên nền mẫu thức ăn gia cầm (bao
gồm gà và vịt) ............................................................................................................... 41
Bảng 3.9. Kết quả phân tích hàm lượng ethoxyquin trên nền mẫu thức ăn cho heo ... 41


2. Mục đích
Tìm hiểu phương pháp phân tích ethoxyquin trên thức ăn chăn nuôi bằng HPLC.
Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân tích (bao gồm hiệu suất thu hồi,
khoảng tuyến tính, độ lặp lại, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng). Xác định hàm
lượng của chất chống oxy hoá – Ethoxyquin trong 84 mẫu thức ăn chăn nuôi (trong đó

1


Luận văn tốt nghiệp
23 mẫu thức ăn cho tôm, 37 mẫu thức ăn cho cá, 14 mẫu thức ăn gia cầm và 10 mẫu
thức ăn cho heo).
Nhận định được tình hình sử dụng chất chống oxy hoá – Ethoxyquin có trong
thức ăn chăn nuôi để giúp người tiêu dùng sử dụng sản phẩm hợp lý và phục vụ tốt cho
xuất khẩu thủy sản ở nước ta.
3. Mục tiêu
Trình bày quy trình phân tích ethoxyquin trên thức ăn chăn nuôi bằng HPLC.
Khảo sát các điều kiện thích hợp cho phân tích (bao gồm hiệu suất thu hồi, khoảng
tuyến tính, độ lặp lại, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng).
Phân tích hàm lượng ethoxyquin trên nền mẫu thức ăn chăn nuôi đã thu thập
bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
4. Đối tượng nghiên cứu
Đề tài thực hiện trên 84 mẫu thức ăn chăn nuôi (bao gồm 23 mẫu thức ăn cho
tôm, 37 mẫu thức ăn cho cá, 14 mẫu thức ăn gia cầm và 10 mẫu thức ăn cho heo).
5. Giới hạn đề tài
Khảo sát trên nền mẫu thức ăn chăn nuôi do phòng thí nghiệm hoá Trung Tâm
Phân Tích Dịch Vụ Thí Nghiệm Vinacert Cần Thơ cung cấp.
6. Các bước thực hiện đề tài
 Giai đoạn 1: Nhận đề tài, tìm tài liệu có liên quan đến đề tài, viết đề cương.
 Giai đoạn 2: Thực hiện đề tài.

K=

CS
CM

Trong đó: CS là nồng độ mol chất tan trong pha tĩnh.
CM là nồng độ mol chất tan trong pha động.
Trị số K càng lớn chất tan phân bố càng nhiều trong pha tĩnh và di chuyển càng
chậm. Nếu các chất trong hỗn hợp có hệ số K khác nhau càng nhiều, thì khả năng tách
diễn ra càng dễ dàng hơn.

3


Luận văn tốt nghiệp
1.1.2.2. Thời gian lưu (tR)
Thời gian lưu của một chất là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi
chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại.
Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian lưu
sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn. Vì vậy thời gian lưu là đại lượng
để phát hiện định tính các chất.
Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:
 Bản chất sắc ký của pha tĩnh.
 Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động.
 Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan.
 Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha
động.
Trong một phép phân tích nếu tR nhỏ quá thì sự tách kém, còn nếu tR quá lớn thì
pic bị doãng và độ lặp lại của pic kém, thời gian phân tích dài đồng thời kéo theo nhiều
vấn đề khác như tốn dung môi, hoá chất, độ chính xác của phép phân tích.

thực tế k từ 1 - 5 là tối ưu.
1.1.2.4. Hệ số chọn lọc α
Độ chọn lọc cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký, khi 2 chất A, B có kA và
kB khác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biểu thị ở độ chọn lọc.

k 'B
α=
(Với điều kiện k 'B ˃ k'A nên α luôn lớn hơn 1).
k'A
Thường chọn α dao động trong khoảng 1,05 – 2. Nếu α lớn quá thời gian phân
tích sẽ dài.
Hệ số tách phụ thuộc vào:
 Bản chất pha tĩnh của cột phân tích.
 Pha động.
 Nhiệt độ.
1.1.2.5. Số đĩa lý thuyết N
Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc
ký nhất định. Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ký giống như là một lớp pha tĩnh có chiều
cao H. Lớp này có tính chất động tức là một khu vực của hệ phân tách mà trong đó
một cân bằng nhiệt động được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha
tĩnh và pha động.
Bề dày H phụ thuộc vào:
 Đường kính và độ hấp phụ của hạt pha tĩnh.
 Tốc độ và độ phân cực của pha động.
 Hệ số khếch tán của các chất trong cột.
Trong cùng một điều kiện sắc ký chiều cao H là hằng định với một chất phân tích
và số đĩa lý thuyết cũng là hằng định.
Số đĩa lý thuyết có thể tính dựa trên sắc ký đồ. Người ta chứng minh được:
5


2

chiều cao pic.

tR

h
W1/2

W
Thời gian
Hình 1.2. Pic sắc ký.
Số đĩa lý thuyết càng lớn và bề rộng W càng nhỏ thì mũi sắc ký càng nhọn. Khi
chiều cao của cột không đổi, số đĩa lý thuyết tăng thì hiệu năng tách của cột càng cao.
1.1.2.6. Độ phân giải RS
Độ phân giải là đại lượng đánh giá khả năng tách giữa hai cấu tử, được tính theo
công thức:

RS =
Hay

RS =

 t R B -  t R A
0,5×(WA + WB )
N (α-1) k 'B
×
× '
4
α

Ứng dụng: phân tích tốt các đối tượng là anion, cation cả vô cơ và hữu cơ trong
dung dịch nước.
1.1.3.3. Sắc ký hấp phụ
Pha tĩnh là chất rắn phân cực. Ở các vị trí hấp phụ chất phân tích tranh chấp với
pha động. Lưu giữ chất phân tích là do lực hấp phụ.
Pha tĩnh thường dùng là silic oxide (silica) và aluminum oxide.
Pha động ảnh hưởng đến hệ số phân bố của chất phân tích, để rửa giải các chất đã
bị hấp phụ người ta dùng pha động có sức rửa giải khác nhau.
Ứng dụng: tách các đồng phân vị trí các hợp chất hữu cơ; phân tích các chế phẩm
dầu mỏ, thực phẩm, dược phẩm.

7


Luận văn tốt nghiệp
1.1.3.4. Sắc ký pha đảo
Phân tách các cấu tử dựa trên sự phân bố của các cấu tử giữa pha tĩnh không
phân cực và pha động phân cực.
Pha tĩnh thường dùng: C18, C8, phenyl, C3…
Pha động: là hỗn hợp dung dịch nước (đệm) với các dung môi hữu cơ tan trong
nước như acetonitrile (ACN), methanol (MeOH), tetrahydrofuran (THF)… nhằm đảm
bảo tương tác với chất tan để tách pha đảo hỗn hợp nhiều chất.
Ứng dụng: sắc ký pha đảo được sử dụng phổ biến để phân tích các chất thuộc
nhiều lĩnh vực khác nhau như dược, hoá sinh, thực phẩm, môi trường…
1.1.4. Các cách rửa giải trong HPLC[1, 16]
Trong HPLC có hai chế độ rửa giải là isocratic và gradient:
1.1.4.1. Rửa giải với chế độ isocratic
Theo cơ chế này thành phần pha động không đổi trong suốt qua trình rửa giải.
Ưu điểm:
 Thành phần pha động chính xác.

và không ổn định.
 Một số đầu dò hoặc ứng dụng khác không thể sử dụng chế độ gradient
dung môi.
1.1.5. Giới thiệu thiết bị HPLC[1, 2, 17]
Do bản chất của chất phân tích khác nhau nên có nhiều kiểu sắc ký lỏng để tách
và định lượng chất phân tích. Mặc dù vậy, nguyên tắc cấu tạo của một máy sắc ký lỏng
đều giống nhau, gồm các bộ phận cơ bản sau:

Hình 1.3. Sơ đồ hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
1. Bình chứa dung môi pha động.
9


Luận văn tốt nghiệp
2. Bộ phận khử khí.
3. Bơm sắc ký lỏng.
4. Bộ phận tiêm mẫu.
5. Cột và pha tĩnh.
6. Đầu dò.
7. Hệ thống máy tính có phần mềm nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều
khiển hệ thống HPLC.
8. Máy in.
1.1.5.1. Bình chứa dung môi pha động
Bình chứa dung môi pha động thường là bình thuỷ tinh. Hiện nay, máy HPLC
thường thiết kế có 4 đường dung môi và cho phép người sử dụng 4 bình chứa dung
môi cùng một lần để rửa giải theo mong muốn. Tuỳ theo tính chất của chất phân
tích mà số lượng đường dung môi được sử dụng khác nhau, thường thì chỉ sử dụng 2
hoặc 3 đường dung môi để pha động luôn được đồng nhất và đơn giản.
Có hai cách dùng pha động rửa giải: đẳng dòng (isocratic) và gradient. Hiện nay,
4 đường dung môi chủ yếu để phục vụ cho chế độ rửa giải gradient.

Có hai cách lấy mẫu vào trong cột: tiêm mẫu bằng thủ công và tiêm mẫu tự động.
Dùng van tiêm sẽ thuận tiện cho việc tự động hoá. Phần mềm máy tính dễ điều
khiển và kiểm soát hệ tiêm mẫu. Sai số khi tiêm mẫu bằng van thấp khoảng 0,5%.
Nếu tiêm mẫu bằng bơm tiêm qua tấm đệm ở đầu cột thì khi tiêm phải dừng dòng
và áp suất trong cột không cao. Với cách tiêm này độ lặp lại thấp và sai số lớn.
1.1.5.5. Cột và pha tĩnh
Cột chứa pha tĩnh được xem là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Cột thường chế tạo bằng thép không gỉ, thủy tinh hoặc chất dẻo có chiều dài 10 –
30 cm, đường kính trong 1 – 10 mm, hạt nhồi cỡ 5 – 10 µm. Số đĩa lý thuyết dao động
từ 40000 đến 60000/m.
Hiện nay đã có loại cột nhỏ (microcolumn) với chiều dài khoảng 3 – 10 cm,
đường kính trong từ 1 – 4,6 mm. Loại cột này được nhồi hạt cỡ 1,8 – 5 µm. Ưu điểm
nổi bật của cột này là có hiệu năng tách cao, chạy sắc ký ít tốn dung môi và ít thời
gian.
Chất nhồi cột cho sắc ký lỏng được chế tạo từ silica bằng cách làm kết tụ các hạt
silica để tạo ra các hạt có kích thước lớn hơn và đường kính đều nhau. Ngoài ra còn có
các chất nhồi khác như: aluminum oxide, polyme xốp, nhựa trao đổi ion,… tuỳ thuộc
vào loại hình sắc ký.

11


Luận văn tốt nghiệp
1.1.5.6. Đầu dò (detector)
Đầu dò là bộ phận quan trọng để phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho
các tín hiệu ghi trên săc ký đồ để có thể định tính và định lượng .Tùy theo tính chất
của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại đầu dò thích hợp và phải thoả mãn
điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân tích.
Để phát hiện chất phân tích có thể dựa vào:
 Đáp ứng chọn lọc với chất phân tích khi detector hấp thụ bức xạ UV

của pha động có hoà tan chất phân tích.
Có thể đáp ứng được những cấu tử không mang nhóm mang màu hoặc không
phát huỳnh quang.
Rất nhạy với nhiệt độ và không chạy được với chế độ gradient dung môi.
Đầu đò chỉ số khúc xạ kém nhạy, lại có khoảng tuyến tính hẹp nên phạm vi sử
dụng bị hạn chế.
d. Đầu dò tán xạ bay hơi
Chất phân tích được phát hiện nhờ ánh sáng tán xạ tạo ra tín hiệu điện, phù hợp
với chế độ rửa giải gradient.
Độ nhạy khá, đáp ứng với bất kỳ chất phân tích nào kém bay hơi hơn so với pha
động của sắc ký lỏng, là giải pháp cho các cấu tử không đáp ứng UV, huỳnh quang…
Khoảng nhiệt độ làm việc từ nhiệt độ phòng đến khoảng 60 oC.
Đáp ứng với khối lượng chất phân tích.
e. Đầu dò điện hoá
Phát hiện các chất phân tích dựa vào độ dẫn diện của pha động có mặt các chất
phân tích ion hoặc dòng điện tạo thành do phản ứng oxy hoá khử ở điện thế xác định.
Không phù hợp cho chế độ gradient dung môi, có 2 loại:
- Đầu dò độ dẫn: thích hợp cho sắc ký ion trong đó chất phân tích là ion
mang điện tích.
- Đầu dò đo dòng: loại này rất nhạy, chọn lọc cao nhưng điện cực dễ bị
nhiễm bẩn.
1.1.5.7. Bộ phận ghi tín hiệu
Để ghi tín hiệu phát hiện do đầu dò truyền sang.
 Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ,
thời gian lưu, diện tích của pic, chiều cao.
 Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính nó có thể lưu tất
cả các thông số, phổ đồ và các thông số của pic như tính đối xứng, hệ số phân
giải.... trong quá trình phân tích đồng thời sử lý, tính toán các thông số theo
yêu cầu của người sử dụng như: nồng độ, RSD %,...
13

 Phương pháp đường chuẩn
Nguyên tắc định lượng trong HPLC:
 Chuẩn bị một dãy mẫu chuẩn của chất phân tích có nồng độ C0, C1, C2,
C3, C4, C5 và các mẫu phân tích Cx1, Cx2,… trong cùng điều kiện phù
14