ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------

Bùi Minh Thái

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN PHÂN
TÍCH CÁC SULFAMIT BẰNG PHƢƠNG
PHÁP SẮC KÝ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2011


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3
1.1. Quá trình sinh máu .......................................................................................... 3
1.1.1. Cơ quan sinh máu..................................................................................... 3
1.1.2. Quá trình sinh máu ................................................................................... 3
1.2. Bệnh bạch cầu cấp ........................................................................................... 3
1.2.1. Khái niệm chung....................................................................................... 3
1.2.2. Dịch tễ học ............................................................................................... 3
1.2.3. Các nguyên nhân gây bệnh ...................................................................... 4
1.2.4. Cơ chế bệnh sinh ...................................................................................... 4
1.2.5. Phân loại .................................................................................................. 5
1.2.6. Đặc điểm lâm sàng ................................................................................... 6
1.2.7. Đặc điểm xét nghiệm ................................................................................ 7
1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới về nhuộm hóa học tế bào ......................... 8
1.3.1. Kỹ thuật nhuộm Periodic-Axit Schiff (PAS) ............................................. 9

bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho ............................................................. 47
3.3. Nhóm bạch cầu cấp dòng tủy ........................................................................ 48
3.3.1. Phân nhóm bạch cầu cấp dòng tủy theo giới tính và tuổi ...................... 48
3.3.2. Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng tủy theo kết quả
chẩn đoán tại Viện Huyết học-Truyền máu trung ương................................... 50
3.3.3. Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ bằng kit nhuộm
HICYTEC ......................................................................................................... 51
3.3.4. Mức độ phù hợp về chẩn đoán thể bệnh bạch cầu cấp dòng tủy bằng
bộ kít HICYTEC và kết luận của viện Huyết học-Truyền máu TW .................. 53
3.4. Phân loại dòng tế bào bạch cầu cấp thể lai lympho - tủy (Lai L-T) .............. 62
3.5. Kết quả nhuộm photphataza kiềm bạch cầu .................................................. 67
3.6. Kết quả nhuộm sắt trên mẫu tủy của bệnh nhân bạch cầu cấp tại Viện HHTM trung ương ............................................................................................... 69
KẾT LUẬN .............................................................................................................. 69
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 70
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP .......................................................................... 71
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 72


MỞ ĐẦU
Bệnh bạch cầu cấp là nhóm bệnh máu ác tính của hệ thống tạo máu với đặc
trưng bởi sự tăng sinh và tích tụ tế bào non trong máu và tủy xương. Bạch cầu cấp
được chia thành 2 nhóm là bạch cầu cấp dòng tủy và bạch cầu cấp dòng lympho.
Bạch cầu cấp dòng tủy là kết quả của sự tích lũy tế bào non bất thường trong tủy
xương. Bạch cầu cấp dòng lympho là bệnh tăng sinh ác tính trong quá trình tạo máu
dòng lympho. Những tế bào này lấn át sự sinh máu bình thường trong tủy xương,
chúng có thể thoát ra ngoài máu ngoại vi và thâm nhiễm vào các cơ quan nội tạng
[23]. Bệnh có các hội chứng: Thiếu máu, xuất huyết, nhiễm trùng và dẫn tới tử vong
nếu không được phát hiện và điều trị kịp thời. Vì vậy, việc xác định chính xác thể
bệnh cũng như dòng tế bào bị ung thư có vai trò quyết định trong điều trị. Hiện nay,

đề tài “Ứng dụng bộ kít nhuộm hóa học tế bào để phân loại bệnh bạch cầu cấp theo
tiêu chuẩn FAB” là đề tài có ý nghĩa khoa học, thực tiễn, kinh tế - xã hội cấp thiết.
Mục tiêu của đề tài là: Đánh giá sự phù hợp của bộ kít nhuộm hóa học tế bào
trong phân loại dòng tế bào so với phương pháp hình thái học, miễn dịch học và di
truyền trên những bệnh nhân bạch cầu cấp đã được chẩn đoán thể bệnh theo tiêu
chuẩn FAB (1986).
Nội dung nghiên cứu:
 Thống kê đặc điểm bệnh bạch cầu cấp trên các bệnh nhân được chọc tủy lần
đầu tại Viện Huyết học-Truyền máu trung ương.
 Đánh giá tính phù hợp của phương pháp nhuộm hóa học tế bào đồng bộ
HICYTEC 10 kỹ thuật so với phương pháp hình thái học, miễn dịch và di
truyền trên các bệnh nhân đã được chẩn đoán thể bệnh theo tiêu chuẩn FAB.
 Đánh giá giá trị của kít nhuộm hóa học tế bào đồng bộ HICYTEC, khi
nhuộm photphataza kiềm, nhuộm photphataza axit bạch cầu, nhuộm Perls
trên bệnh nhân bạch cầu cấp.

2


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Quá trình sinh máu
1.1.1. Cơ quan sinh máu
Cơ quan tạo máu bao gồm: tủy xương, tổ chức lympho (lách, hạch, tuyến ức)
và tổ chức võng mô. Thời kì phôi thai, cơ quan tạo máu gồm có gan, lách, hạch. Sau
khi sinh, quá trình tạo máu (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu) chỉ xảy ra ở tủy đỏ của
các xương. Đến tuổi trưởng thành, quá trình sinh máu chỉ còn diễn ra tại đầu các
xương dẹt, đầu xương đùi, xương cánh tay và một vài khu vực sinh máu ngoài tủy
biệt hóa các dòng lympho T và B [6].
1.1.2. Quá trình sinh máu
Hiện nay nhiều công trình đã chứng minh, các dòng tế bào máu được sinh ra

Cho tới nay nguyên nhân gây bệnh chưa được sáng tỏ. Tuy nhiên qua nhiều
nghiên cứu cho thấy có nhiều yếu tố liên quan tới phát sinh bệnh:
 Tia xạ: Những người tiếp xúc nhiều với tia ion hóa hay tia xạ thường có
nguy cơ bị bạch cầu cấp;
 Hóa chất: Những người nhiễm mạn tính benzen hay sử dụng hóa chất để
chữa bệnh ác tính dễ mắc bệnh bạch cầu cấp;
 Virus: Human T-cell lymphotropic virus gây bạch cầu cấp dòng lympho,
Epstein-Barr virus (EBV) gây ung thư vòm...
 Yếu tố di truyền: Những bệnh nhân bị một số bệnh di truyền như hội chứng
Down, hội chứng Bloom, thiếu máu Fanconi có nguy cơ cao bị bạch cầu cấp [12].
1.2.4. Cơ chế bệnh sinh
 Sự hoạt động của các gen ung thƣ (oncogene): Các gen bình thường do
yếu tố nào đó tác động trở thành các gen bất thường gây ung thư gọi là gen
ung thư. Sản phẩm của các gen ung thư là các protein bất thường, có hoạt
tính mạnh, gây rối loạn quá trình sinh sản và biệt hóa của tế bào;
 Gen ức chế ung thƣ: Các công trình nghiên cứu gần đây đã chứng minh
được trong tế bào bình thường có những gen kiểm soát sự tăng sinh, nếu mất
các gen này sẽ dẫn đến mất kiểm soát phân chia tế bào, gây ra u;
 Hoạt hóa các oncogen trong bệnh bạch cầu cấp: Một số gen hoạt hóa và
kích thích tăng sinh tế bào. Khi các gen này được giải phóng và kết hợp với
4


gen ức chế bị kìm hãm sẽ làm tăng trưởng mạnh sự phát triển khối u và làm
các tế bào bình thường trở thành ác tính [2, 21, 37].
 Một số biến đổi gen thường gặp trong bạch cầu cấp dòng lympho được thể
hiện trên Bảng 1.1 [10].
Bảng 1.1. Biến đổi di truyền và tiên lượng trong bạch cầu cấp dòng lympho.
Tiên lƣợng
Tốt




Thể M4: lơ xê mi cấp hỗn hợp chia làm 2 nhóm:
 M4: lơ xê mi cấp tủy - mono;
 M4eo: lơ xê mi cấp tủy - mono có tăng bạch cầu ái toan.



Thể M5: lơ xê mi cấp dòng mono:
 M5a: ≥80% tế bào mono là monoblast;
 M5b:

Đều đặn, hình bầu
dục hoặc tròn

Hạt nhân

Không thấy hoặc
nhỏ

Một hay nhiều hạt
nhân to

Một hay nhiều hạt
nhân hình túi

Nhân Bào tương

Thấp

Khá cao, thay đổi

Cao

Bào tương ưa base

Nhẹ, vừa hoặc đậm Vừa hoặc đậm

Rất đậm

Không bào trong


Thiếu máu bình sắc, hồng cầu bình thường, hồng cầu lưới giảm;



Bạch cầu: số lượng bạch cầu thường tăng, nhưng có thể bình thường hoặc
giảm. Công thức bạch cầu thường gặp một tỷ lệ tế bào blast. Tuy nhiên
một số trường hợp số lượng bạch cầu giảm nặng có thể không gặp tế bào
blast ở máu ngoại vi;




Tiểu cầu: số lượng giảm.

Tuỷ đồ:


Số lượng tế bào tuỷ: thường tăng, tủy giàu tế bào. Trong một số trường
hợp tủy nghèo hoặc có mật độ bình thường;





Tăng sinh tế bào blast trên 30% tế bào có nhân trong tuỷ xương;



Các dòng hồng cầu, bạch cầu hạt và mẫu tiểu cầu bị lấn át.

 Tế bào nguồn đầu dòng B: CD10, CD19;
 Tế bào tiền lympho B: CD10, CD19, CD20;
 Lympho B trưởng thành: CD19, CD20, CD21, CD22, CD23;
 Tương bào: CD38.



Nhóm dấu ấn CD thay đổi trong quá trình biệt hóa bạch cầu lympho T:
 Tế bào nguồn đầu dòng T: TdT, HLA;
 Tế bào tiền lympho T: TdT, CD7, CD2, CD3;
 Tế bào lympho T4: CD2, CD3, CD4;
 Tế bào lympho T8: CD2, CD3, CD8.



Xét nghiệm về di truyền NST:
Xét nghiệm di truyền thường được dùng để chẩn đoán và tiên lượng bệnh.

Có một số bất thường nhiễm sắc thể phổ biến trong một số thể bạch cầu cấp
(chuyển đoạn, đảo đoạn,…), cụ thể như sau:


t(8;12) trong bạch cầu cấp M2;



t(15;17) trong bạch cầu cấp M3;




Phương pháp dựa trên nguyên lý của phản ứng hóa học gồm hai giai đoạn:
Giai đoạn 1: Axit periodic oxi hóa glycogen trong tế bào thành diandehit
theo hình 1.1:
HO

R1

+
R2

R1CHO

HIO4

+

R2CHO

OH

1-2 Glycol

Diandehit

Hình 1.1. Glycogen bị oxi hóa bởi axit periodic thành diandehit
Ghi chú: R1, R2 là các gốc: amin (-RNH2) hoặc alkyl amino thế (-RNHR')
Giai đoạn 2: Diandehit tạo thành tham gia vào phản ứng nhuộm hoàn nguyên
bằng thuốc thử Schiff thể hiện trên hình 1.2:
NH2


ưa axit, bazơ và dòng hồng cầu thì gần như âm tính. Những tính chất khác nhau đó
là cơ sở của kỹ thuật nhuộm hóa học bạch cầu để phân biệt các dòng tế bào và xếp
loại thể bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB [27, 28].
1.3.2. Kỹ thuật nhuộm peroxidaza (PER)
Cơ chế của phản ứng nhuộm peroxidaza đi qua hai giai đoạn thể hiện trên
hình 1.3 và 1.4 [29, 46]:

H2 O2

Peroxydaza

H2O + O:

Hình 1.3. H2O2 bị khử do xúc tác của peroxidaza tạo oxi nguyên tử
H2N

NH2

O

NH

HN

Benzidin

Di-imin diphenyl

Hình 1.4. Oxi nguyên tử ôxi hóa benzidin thành di-imin diphenyl.
Dưới xúc tác của peroxidaza là một enzym oxi hóa khử, nước ôxi già bị khử

CONH
OCOCH2Cl

esteraza
CH3

CONH
OH

Naphtol AS-D Cloaxetat

Naphtol AS-D

Hình 1.5. Thủy phân cơ chất este thành naphtol

11

CH3


Giai đoạn 2: dẫn xuất naphtol tác dụng với muối điazo tạo thành chất màu
azo theo hình 1.6

CONH

CONH
CH3

OH
OCH3

electrophin của nhóm azo cho nguyên tử proton ở nguyên tử cacbon C4 trên vòng
naphtol. Tùy theo loại muối điazo mà phẩm màu azo có màu đỏ hoặc màu đen. Nếu
xuất hiện màu trên nguyên sinh chất của tế bào có nghĩa là có esteraza. Tốc độ của
quá trình nhuộm màu phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nồng độ cơ chất, muối điazo,
thành phần dung môi, nhiệt độ và pH môi trường... các hóa chất sử dụng luôn đòi
hỏi độ tinh khiết cao, giá thành đắt [3, 14, 40, 47, 55].

12


b) Kỹ thuật nhuộm esteraza không đặc hiệu ức chế và không ức chế bằng NaF
Nhuộm phát hiện esteraza không đặc hiệu bạch cầu người lần đầu tiên được
công bố vào năm 1959 bởi Braunstein. Esteraza không đặc hiệu dương tính trong tất
cả các dòng tế bào máu vì thế nên được gọi là không đặc hiệu. Cơ chế phản ứng
thủy phân dựa trên cơ chế hình thành phẩm màu azo giống như nhuộm esteraza đặc
hiệu (hình 1.4, 1.5 và 1.6). Cơ chất thường sử dụng là naphtol AS axetat, -naphtyl
axetat, -naphtyl butyrat và naphtol AS-D axetat. Chất ghép đôi thường sử dụng là
muối điazo và tùy theo loại muối điazo mà phẩm màu azo có phổ màu khác nhau từ
đen đến đỏ. Các cơ chất của -naphtyl axetat, -naphtyl butyrat thường cho phản
ứng dương tính mạnh đối với dòng mono, dòng tiểu cầu; các dòng khác lên màu
dưới dạng hạt và yếu. Riêng tế bào lymphoxít B cho kết quả âm tính. Đối với cơ
chất naphtol AS-D axetat và naphtol AS Axetat thì dương tính mạnh ở tất cả các
dòng trừ dòng tế bào lymphoxit B. Tuy có mức độ dương tính khác nhau nhưng chỉ
có dòng mono bị ức chế bởi NaF với nồng độ 1,5 mg/1 ml. Chính nhờ tính chất này
mà kỹ thuật nhuộm với chất ức chế NaF thường dùng để phân biệt dòng mono với
các dòng tế bào khác trong bệnh bạch cầu cấp và là tiêu chuẩn để phân loại dòng tế
bào theo tiêu chuẩn FAB [27, 28].
1.3.5. Kỹ thuật nhuộm photphataza
Photphataza bạch cầu thuộc nhóm Hidrolaza (EC 3.1.3.2) là một enzym xúc
tác cho phản ứng thủy phân nhóm photphat từ nhiều loại phân tử, bao gồm các

NaH 2 PO4

-Naphtyl

Hình 1.7. Thủy phân naphtyl photphat thành naphtol.
Giai đoạn 2: Naphtol tác dụng với muối điazo tạo thành chất màu azo theo
hình 1.6 như ở phần nhuộm esteraza.
Photphataza kiềm bạch cầu dương tính đối với dòng tủy từ hậu tủy bào đến
bạch cầu hạt. Tế bào càng trưởng thành thì mức độ dương tính càng mạnh. Ngoài ra
các tế bào tạo cốt bào cũng cho phản ứng dương tính trong kỹ thuật nhuộm này.
Trong bệnh bạch cầu kinh, hoạt tính của photphataza kiềm bạch cầu giảm trong
bệnh thiếu máu do tan máu; hoạt tính của photphataza kiềm bạch cầu tăng trong các
bệnh nhiễm khuẩn cấp, lách to sinh tủy, phản ứng giả bạch cầu [3, 25, 30, 40, 43].
Photphataza axit dương tính mạnh trong bệnh bạch cầu cấp dòng lympho loại
tế bào B, tế bào liên võng, hủy cốt bào và các nguyên mẫu tiểu cầu. Dòng hồng cầu,
mono, lympho (trừ bệnh bạch cầu tế bào tóc-tế bào B hay còn gọi là Hairy cell) và
dòng tủy từ nguyên tủy bào đến tiền tủy bào cho kết quả âm tính [40, 56].
1.4. Ứng dụng phƣơng ph p nhuộm hóa học tế bào trong y học
Nhuộm hóa học tế bào được ứng dụng rộng rãi trong y học, nghiên cứu sinh
học và đặc biệt trong chuyên ngành Huyết học-Truyền máu. Trong bệnh bạch cầu
cấp, kết quả của phương pháp hình thái học-nhuộm hóa học tế bào, phương pháp
marker và di truyền là tiêu chuẩn để phân loại dòng tế bào bệnh bạch cầu cấp cũng
như thể bệnh. Việc xác định chính xác thể bệnh quyết định việc dùng thuốc điều trị
đặc biệt là các thuốc nhắm đích. Trong bệnh bạch cầu kinh, nhuộm photphataza
kiềm thường bị giảm điểm nhuộm và có giá trị phân biệt với các bệnh nhiễm trùng,
14


tăng bạch cầu đơn nhân... Năm 1976, Hội các nhà huyết học Pháp-Anh-Mỹ đã sử
dụng kết quả của các phương pháp: hình thái học-nhuộm hoá học tế bào làm cơ sở

Di truyền

1) Early Pre B: t(4; 11)
1)
PAS dương tính 1) 1CD (+): TdT; CD (-): Smlg;
(q21:q23).
hạt to trên một số 2) Early Pre B: (+): CD10, HLADR; (-/+): CD19; (-): CD3,5, 2) Pre B: t(1; 19)(q23:p13).
lymphoblast trong 80%
Cylg.
3) Pre T và T: t(1; 14)
trường hợp;
(p32:q11); t(7;v)(q32-q36;
2)
Peroxidaza, Sudan 3) Pre B: (+): CD19, Cylg, HLADR; (-/+): CD10; (-): CD3,5.
v),
t(8;14)
(q24;q11),
B, CE âm tính;
t(10;14)(q24;q11),
3) NE âm tính trừ tế bào 4) Pre T: (+): CD5; (-):
CD3,10,19, Cylg, HLA-DR.
t(11;14)(p13;q11-q13),
non dòng lymphoxít T
5) 5) Lympho T: (+): CD3,5; (-):
inv(14)(q11;q32).
có thể dương tính hạt
CD10, 19, Cylg, HLA-DR.

bazơ.


17

Di truyền

1) CD (+): TdT; CD (-): Smlg;
1) Early Pre B: t(4; 11)
2) Early Pre B: (+): CD10, HLA(q21:q23).
DR; (-/+): CD19; (-): CD3,5, 2) Pre B: t(1; 19)(q23:p13).
Cylg.
3) Pre T và T: t(1; 14)
3) Pre B: (+): CD19, Cylg, HLA(p32:q11); t(7;v)(q32-q36;
DR; (-/+): CD10; (-): CD3,5.
v), t(8;14) (q24;q11),
4) Pre T: (+): CD5; (-):
t(10;14)(q24;q11),
CD3,10,19, Cylg, HLA-DR.
t(11;14)(p13;q11-q13),
5) Lympho T: (+): CD3,5; (-):
inv(14)(q11;q32).
CD10, 19, Cylg, HLA-DR.


Thể
L3

Hình thái học-số lƣợng tế bào tủy

Hóa học tế bào

Marker CD

t(11;14)(p13;q11-q13),
 Có 1 hoặc nhiều hạt nhân lớn;
5) Pre T: (+): CD5; (-):
có thể dương tính hạt.
inv(14)(q11;q32).
CD3,10,19,
Cylg,
HLA-DR.
 Bào tương vừa, bắt màu bazơ nhẹ
có các không bào.

6) Lympho T: (+): CD3,5; (-):
CD10, 19, Cylg, HLA-DR.

18


Bảng 1.4. Bảng phân loại dòng tế bào theo FAB có bổ sung thêm marker và di truyền [26]
Thể
M0

Hình thái học-số lƣợng tế bào tủy (SLTBT)
1)

1) 10% SLTBT là bạch cầu hạt trưởng thành;
5)
sinh chất.
M4

1) 5.109 hoặc

1) Peroxidaza, Sudan B âm
tính hoặc dương tính yếu;

3) ≥80% tế bào không phải dòng hồng cầu là 2) CE âm tính;
monoxít;
4) ≥80% tế bào monoxít là monoblast;

3) NE dương tính mạnh và bị
ức chế bởi NaF

5) Hiếm khi xuất hiện thể Auer trên nguyên
sinh chất.
21

1) CD (+): 13, 14, 15, t(9; 11) (p22:q23)
33;
2) HLA-DR (+).


Thể
M5b

Hình thái học-số lƣợng tế bào tủy (SLTBT)
1)

1) CD (+): 13, 14, 15, 1) del(5 và/hoặc 7q);
33;
2) Ba nhiễm sắc thể
2) HLA-DR (+).
số 8.

chất.
M7

1) ≥30% tế bào có nhân là blasts;

1) PAS dương tính

1) CD (+): 41, 61;

2) Có thể chẩn đoán bằng máu ngoại vi trong 2) Peroxidaza, Sudan B, CE 2) Kháng nguyên có liên
trường hợp không thể lấy mẫu tủy.

âm tính;
3) NE và Peroxidaza tiểu cầu
dương tính.
22

quan đến yếu tố VIII
(+).