Header Page 1 of 148.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------

NGUYỄN THỊ ÁNH TUYẾT

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHỔ HỒNG NGOẠI GẦN
VÀ TRUNG BÌNH KẾT HƠP VỚI THUẬT TOÁN HỒI QUY ĐA BIẾN
ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ HOẠT CHẤT CÓ TRONG
THUỐC KHÁNG SINH THUỘC HỌ β –LACTAM.

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2015

Footer Page 1 of 148.


Header Page 2 of 148.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------

NGUYỄN THỊ ÁNH TUYẾT
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHỔ HỒNG NGOẠI GẦN
VÀ TRUNG BÌNH KẾT HƠP VỚI THUẬT TOÁN HỒI QUY ĐA BIẾN
ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ HOẠT CHẤT CÓ TRONG
THUỐC KHÁNG SINH THUỘC HỌ β –LACTAM.

Hà nội, ngày 19 tháng 7 năm 2015
Học viên
Nguyễn Thị Ánh Tuyết

Footer Page 3 of 148.


Header Page 4 of 148.

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .....................................................................................2
1.1.

Tổng quan về nhóm kháng sinh β-lactam......................................................2

1.1.1.

Khái niệm và phân loạinhóm β-lactam...................................................2

1.1.1.1. Nhóm penicillin ...................................................................................2
1.1.1.2.Nhóm cephalosporin .............................................................................4
1.1.1.3.Các kháng sinh β-lactam khác. .............................................................8
1.1.2.
1.2.


Mẫu phân tích .......................................................................................23

2.2. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm .....................................................................25
2.2.1. Hóa chất....................................................................................................25
2.2.2. Dụng cụ và trang thiết bị đo .....................................................................26
2.3. Nội dung nghiên cứu.......................................................................................26
2.4. Phương pháp định lượng bằng phổ hồng ngoại gần .......................................26
2.4.1. Nguyên tắc phương pháp phân tích..........................................................26
2.4.2. Nội dung phương pháp .............................................................................27
2.4.3. Quy trình phân tích...................................................................................27
2.5. Phương pháp phân tích đối chứng Penicillin và Cephalexin..........................28
2.6. Chương trình máy tínhcủa phương pháp phổ hồng ngoại gần kết hợp với
thuật toán hồi qui cấu tử chính ( PCR) ..................................................................30
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THỰC NGHIỆM ...................................................32
3.1. Khảo sát các điều kiện đo phổ hồng ngoại xác định đồng thời Penicillin và
Cephalexin trong cùng hỗn hợp.............................................................................32
3.1.1. Khảo sát phổ hấp thụ các hoạt chất penicillin và cephalexin...................32
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của các tá dược ........................................................35
3.1.3. Khảo sát tỷ lệ khối lượng mẫu/KBr .........................................................37
3.1.4. Khảo sát độ lặp lại của quá trình ép viên .................................................38
3.2. Xây dựng mô hình hồi qui đa biến tuyến tính phân tích hoạt chất Penicillin 39
3.2.1. Mô hình đường chuẩn đa biến xác định hoạt chất Penicillin khi có chứa tá
dược ....................................................................................................................39
3.2.2. Đánh giá tính phù hợp của phương trình hồi quy ....................................42
3.3. Xây dựng mô hình hồi qui đa biến tuyến tính phân tích hoạt chất Cephalexin
...............................................................................................................................44
3.3.1. Mô hình đường chuẩn đa biến xác định hoạt chất Cephlexin khi có chứa
tá dược ................................................................................................................44
3.3.2. Đánh giá tính phù hợp của phương trình hồi qui .....................................46


tại các số sóng đặc trưng. ..........................................................................................37
Bảng 3.5. Khảo sát độ lặp lại quá trình ép mẫu theo độ hấp thụ và theo diện tích píc..........39
Bảng 3.6.Ma trận chuẩn hàm lượng của penicillin và tá dược trong hỗn hợp..........40
Bảng 3.7.Ma trận hàm lượng của penicillin và tá dược để kiểm tra độ đúng của mô
hình hồi qui PCR. ......................................................................................................43
Bảng 3.8.Kết quả sai số tương đối (%) khi xác định đồng thời penicillin và tá dược
trong mẫu kiểm tra bằng phương pháp PCR.............................................................43
Bảng 3.9. Ma trận chuẩn hàm lượng của Cephalexin và tá dược trong hỗn hợp......45
Bảng 3.10. Ma trận kiểm tra của cephalexin và tá dược có trong hỗn hợp ..............47
Bảng 3.11.Kết quả sai số tương đối của Cephalexin và tá dược bằng phương pháp
PCR. ..........................................................................................................................47
Bảng 3.12. Ma trận chuẩn hàm lượng của 3 cấu tử PEN,CEP và tá dược trong
hỗnhợp.......................................................................................................................49
Bảng 3.13. Ma trận kiểm tra hàm lượng của 3 cấu tử PEN,CEP và tá dược để đánh
giá tính phù hợp mô hình hồi qui. .............................................................................51
Bảng 3.14. Kết quả (%)sai số tương đối xđ đồng thời CEP,PEN và tá dược bằng
phương pháp PCR .....................................................................................................52
Bảng 3.15.Giá trị LOD, LOQ khi xác định đồng thời các cấu tử PEN, CEP và tá
dược bằng phương pháp PCR ...................................................................................53
Bảng 3.16. Thông tin về các mẫu thuốc thực tế........................................................59
Bảng 3.17.Khối lượng mẫu bột thực tế cephalexin và tá dược được thêm vàohỗn hợp ....60
Bảng 3.18. Khối lượng mẫu bột thực tế penicillin và tá dược thêm vào hỗn hợp ....61
Bảng 3.19. Hàm lượng hoạt chất CEP thực tế tìm thấy trong các mẫu thực tế ........61
Bảng 3.20. Hàm lượng hoạt chất PEN thực tế tìm thấy trong các mẫu thực tế ........62

Footer Page 7 of 148.


Header Page 8 of 148.



Bình phương tối thiểu nghịch đảo (inverse least square)

PLS

Bình phương tối thiểu từng phần (partial least square)

PC

Cấu tử chính (Principal component)

UI
EtOH

Đơn vị quốc tế chuẩn hóa
(international unit)
Ethanol

KLTB

Khối lượng trung bình viên

PCR

Hồi qui cấu tử chính (principal component regression)

PEN

Penicillin



Header Page Luận
10 of 148.
văn Thạc sỹ khoa học

Footer Page 10 of 148.

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học


Header Page Luận
11 of 148.
văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

MỞ ĐẦU
Hiện nay hoạt động sản xuất và buôn bán kháng sinh nói riêng và tân dược
nói chung đem đến nguồn lợi nhuận khổng lồ khiến một số tổ chức, cá nhân đã tung
ra thị trường hàng triệu viên thuốc giả mỗi ngày. Thuốc giả không chỉ đánh lừa
người tiêu dùng, còn vô hiệu hóa các liệu pháp điều trị để cứu sống bệnh nhân và
trong rất nhiều trường hợp thuốc giả gây ra tác hại to lớn như gây ra các phản ứng
dị ứng, nhiễm độc kim loại nặng cũng như làm bệnh nhân dễ kháng thuốc. Đại diện
tổ chức Y Tế Thế giới cảnh báo thuốc giả đang chiếm 7-15% tổng số thuốc ở các
nước phát triển, 25% ở các nước đang phát triển, trong đó các nước ở khu vực Châu
Á chiếm 50%. Các mẫu thuốc giả thường được phát hiện chủ yếu là các loại kháng
sinh như Ampicillin, Penicillin…Điều khiến nhiều người quan tâm là tỉ lệ thuốc giả
ở Việt Nam ngày càng một gia tăng và diễn biến trở nên phức tạp hơn dẫn đến công
tác kiểm tra khó khăn hơn.
Vì vậy, vấn đề kiểm định thuốc đúng hoạt chất, và đúng hàm lượng hoạt

Tổng quan về nhóm kháng sinh β-lactam

1.1.1. Khái niệm và phân loạinhóm β-lactam
Kháng sinh là những chất kháng khuẩn (antibacterial substances) được tạo ra
bởi các chủng vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, Actinomycetes), có tác dụng ức chế sự
phát triển của các vi sinh vật khác [2].
Nhóm β-lactam là một họ kháng sinh rất lớn, bao gồm các kháng sinh có cấu trúc
hóa học chứa vòng β-lactam. Khi vòng này liên kết với một cấu trúc vòng khác sẽ
hình thành các phân nhóm lớn tiếp theo.
Cáckháng sinh β-lactam được chia thành 4 nhóm gồm các penicillin tự nhiên
và

tổng

hợp,cáccephalosporin

bán

tổng

hợp,các

chấtcarbapenem,

monobactam.Trong đó có hai nhóm được sử dụng phổ biến nhất là nhóm các
penicillin và cephalosporin.
Các penicillin và cephalosporin tự nhiên được chiết tách từ môi trường nuôi
cây nấm penicilium notaum mà nay gọi là penicillin chrysogenum và
cephalosporium aeremonium [2].
1.1.1.1. Nhóm penicillin

naza (do vi khuẩn đường ruột hay vi khuẩn Gr (-) sinh ra.
Phân loại:
Sự thay đổi nhóm thế trong cấu trúc của penicilin bán tổng hợp dẫn đến sự thay
đổi tính bền vững với các enzym penicilinase và β-lactamase, thay đổi phổ kháng
khuẩn cũng như hoạt tính kháng sinh trên các chủng vi khuẩn gây bệnh.
Dựa vào phổ kháng khuẩn, có thể tiếp tục phân loại các kháng sinh nhóm
Penicilin thành các phân nhóm với phổ kháng khuẩn tương ứng bảng như sau:
 Penicillin nhóm 1: Các penicillin phổ kháng khuẩn hẹp gồm Gồm:
benzylpenicilin (penicillinG), phenoxymethylpenicilin (penicillin V),

Chuyên ngành hóa phân tích
Footer Page 13 of 148.

3

Trường ĐHKHTN


Header Page Luận
14 of 148.
văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

penicillin chậm (procain benzylpenicilin, benzathin benxylpenicilin và
benethamin penicillin).
 Penicillin nhóm 2: Các penicillin phổ kháng khuẩn hẹp đồng thời có tác
dụng trên tụ cầu gồm Methicillin, oxacillin, Cloxacillin (CLO),
Dicloxacillin, Nafcillin.
Dược động học

động học khác nhau.

Chuyên ngành hóa phân tích
Footer Page 14 of 148.

4

Trường ĐHKHTN


Header Page Luận
15 of 148.
văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

Công thức hóa học:
Cấu trúc hóa học của các kháng sinh nhóm cephalosporin đều là dẫn xuất của
Axit 7-aminocephalosporanic (viết tắt là A7AC). Các cephalosporin khác nhau
được hình thành bằng phương pháp bán tổng hợp.Cấu trúc chung gồm vòng βlactam 4 cạnh gắn với 1 dị vòng 6 cạnh. Khi thay đổi các gốc R1, R2 được các
cephalosporin có độ bền, tính kháng khuẩn và dược động học khác nhau. Công thức
cấu tạo của một số hoạt chất trong nhóm cephalosporin được đưa ra trong bảng 1.2.
Phân loại:
Dựa vào phổ kháng khuẩn, chia các cephalosporin thành 4 thế hệ.Các
cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn G+ mạnh hơn nhưng trên vi
khuẩn G- yếu hơn thế hệ sau. Các tên thuốc sử dụng các thế hệ Cephalosporin được
đưa ra trong bảng 1.3.

Chuyên ngành hóa phân tích
Footer Page 15 of 148.


Tên thuốc
Cefazolin

Cephalosporin thế hệ 1

Cephalexin
Cefadroxil
Cefoxitin
Cefaclor

Cephalosporin thế hệ 2

cefafrozil
cefuroxim
cefotetan
ceforanid
Cefotaxim
Cefpodoxim
Ceftibuten
Cefdinir
Cefditoren

Cephalosporin thế hệ 3
Ceftizoxim
Ceftriaxon
Cefoperazon
Ceftazidim
Cephalosporin thế hệ 3


Cực đại hấp thụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy thuộc vào cấu trúc khác làm
dạng phổ thay đổi (đỉnh phụ, vai, sự dịch chuyển sang bước sóng ngắn hoặc dài,
giảm độ hấp thụ).
 Tính chất hóa học các kháng sinh nhóm β- Lactam
Tính không bền của vòng β-lactam:
Sự tấn công của các tác nhân thân điện tử (An): Các bazơ mở vòng azetidin-2on, tạo ra những dẫn xuất của axit cephalosporic không có hoạt tính sinh học [5].
Ví dụ: các bazơ (NaOH, KOH) đậm đặc tạo muối của axit cephalosporic.
Tính axit:
Các β-lactam là các axit với nhóm –COOH có pKa=2,5-2,8 tùy vào cấu trúc
phân tử.Trong môi trường axit hoặc kiềm, β-lactamcó tác dụng phân cắt khung phân
tử, mở vòng β-lactam làm kháng sinh mất tác dụng.
Các penicillin là các axit khó tan trong nước, dạng muối natri hoặc kali dễ tan
dùng để pha thuốc tiêm.

Chuyên ngành hóa phân tích
Footer Page 18 of 148.

8

Trường ĐHKHTN


Header Page Luận
19 of 148.
văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

Các cephalosporin có vòng β-lactam đều kém bền do cộng hưởng amid không
tồn tại. Cộng hưởng amit mất đi chủ yếu còn do có cộng hưởng “en-amin”.

Trường ĐHKHTN


Header Page Luận
20 of 148.
văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

phẩm thịt, dùng làm thực phẩm cho người và thức ăn gia súc. Phương pháp này dựa
vào phản ứng tạo phức đặc trưng và hoàn toàn định lượng của cadimi với thuốc thử
phenantrolin-cadimi sinh ra phức bền. Chiết phức này bằng nitrobenzen và đo phổ
hấp thụ nguyên tử AAS của kim loại cadimi trong phức ở pha hữu cơ, hay phân hủy
pha hữu cơ lấy cadimi vào dung dịch HCl 1% và đo phổ của cadimi. Phương pháp
này phức tạp, không đặc trưng và chỉ xác định được lượng tổng Penicillin.
Wei Liu và cộng sự [36] đã sử dụng phản ứng quang hóa của β-lactam với hệ
luminol – K3Fe(CN)6 kết hợp với phương pháp chiết pha rắn để phân tích một số βlactam trong sữa đạt độ nhạy cao: PEN là 0,5mg/l, cefadin là 0,04 mg/l, CEP là 0,1
mg/l .
Tuy nhiên, nếu không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn mắc nối tiếp, các
phương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chất kháng sinh và
trong các đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương tự chất phân tích việc
xác định sẽ kém chính xác. Ngoài ra, trong nhiều trường hợp chất phân tích cần
thủy phân mới phát hiện cũng được.
Sheikha M. Al- ghannam [35] cũng đã sử dụng phương pháp hấp thụ nguyên
tử AAS để xác định hai hợp chất của cephalosporins (Cephalexin monohydrate và
Cephradine). Các quy trình này dựa trên sự tạo phức cặp ion giữa các thuốc với
muối ammonium reineckate. Các kết tủa tạo thành dùng để định lượng hoặc bằng
phương pháp đo quang trắc hoặc bằng phương pháp AAS. Các phương pháp này
gồm phản ứng của các thuốc với muối. Reinecke trong môi trường axit ở nhiệt độ
25 ± 20. Quy trình phép phổ quang kế (quy trình 1) dựa trên sự hòa tan tạo kết tủa

TitusA.M.Msagati và cộng sự [4] đã xác định lượng dư các β-lactam trong thực
phẩm bằng sắc ký lỏng – khối phổ bằng hỗn hợp đệm phosphat,
tetraetylammoniumclorua (Et4NCl) và acetonitril.Sau đó, các β-lactam sẽ được tách
và định lượng bằng sắc ký lỏng khối phổ chế độ ion dương (LC-PI-ESI-MS). Giới
hạn phát hiện của phương pháp này đối với penicillin G và penicillin V trong gan và
bầu dục là là 1 ng/kg, trong sữa là 0,7 µg/l.
Helio A.Martins-Júnior [25] cũng đã sử dụng phương pháp LC/MS để xác định
lượng dư kháng sinh có trong sữa. Mục đích của nghiên cứu này nhằm phát triển
một phương pháp phân tích mới đơn giản và nhanh chóng để xác định và định
lượng mười bốn kháng sinh từ các mẫu sữa khác nhau .Trong đó, có năm β-lactam,
bốn sulfonamides, ba tetracycline, một macrolid và một cephalosporin. Các chất
này đều được xác định trong khoảng nồng độ 0,75-3,75 mg L-1, hệ số tuyến tính (r2)
cao hơn 0,9960, với thời gian phân tích ít hơn 10 phút. Giới hạn định lượng thấp
nhất và cao nhất của Dicloxacillin và erythromycin tương ứng 0,05 và 9,77 µg L-1,
có hiệu suất thu hồi dao động từ 65-125%, độ lệch chuẩn từ 2,0 to 15%.
Phương pháp bằng sắc ký lỏng khối phổ-tandem (LC-MS / MS) cũng đã được
Frédérique van Holthoon và các cộng sự [23] sử dụng để xác định tám penicillin
trong các mô của heo, sữa và thức ăn gia súc . Kết quả đạt độ chính xác dao động
trong khoảng 94-113% (cơ bắp), 83-111% (thận) và 87-103% (sữa) và 88-116%

Chuyên ngành hóa phân tích
Footer Page 21 of 148.

11

Trường ĐHKHTN


Header Page Luận
22 of 148.

Amoxicillin có hiệu suất thu hồi kém (dưới 40%). Giới hạn phát hiện phương pháp
(MDL) được ước tính khoảng từ 8 - 10 ng/L với nước bề mặt, 13 - 18 ng / L với

Chuyên ngành hóa phân tích
Footer Page 22 of 148.

12

Trường ĐHKHTN


Header Page Luận
23 of 148.
văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

nước thải trước xử lý và 8 - 15 ng / L nước thải sau xử lý của một nhà máy xử lý
nước thải.
Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments cùng các cộng sự [19] đã
sử dụng phương pháp HPLC để xác định 8 hợp chất penicillin (benzylpenicillin,
phenoxymethylpenicillin, ampicillin, amoxicillin, nafcillin, oxacillin, cloxacillin, và
dicloxacillin) ở mức lượng vết trong các mô cơ. Các điều kiện chiết các penicillin
với đệm phosphat có pH = 9 sau khi chiết bằng cột chiết tách pha rắn C18, phản
ứng với anhydrit benzoic ở 500C trong 5 phút và với 1,2,4-triazol, dung dịch thủy
ngân (II ) clorua có pH = 9 ở 650C trong 10 phút. Các hợp chất dẫn xuất được tách
rửa trên một cột C18 với pha động chứa acetonitril và đệm phosphat (pH=6; 0,1
mol/L) được nạp với natri thiosunfat và cặp ion tetrabutylammonium-hydro sunfat.
Giới hạn phát hiện phương pháp là khoảng 3-11 µg/l.
1.2.3. Phương pháp phổ hồng ngoại

Bản chất của phương pháp phổ hồng ngoại là dựa trên hiện tượng các hợp chất
hóa học có khả năng hấp thụ chọn lọc các bức xạ hồng ngoại. Các phân tử chỉ có
khả năng hấp phụ bức xạ hồng ngoại khi chúng phải thỏa mãn 2 yếu tố:
- Một là tần số dao động tự nhiên của một phần phân tử (các nguyên tử và các
liên kết trong phân tử) bằng chính tần số dao động của bức xạ tới.
- Hai là một phân tử chỉ hấp thụ bức xạ hồng ngoại khi nào sự hấp thụ đó gây
nên sự biến thiên momen lưỡng cực của chúng.
Do sự hấp thụ chọn lọc này mà khi chiếu chùm bức xạ điện từ với một dải tần
số khác nhau đi qua môi trường vật chất thì sau khi đi qua, chum bức xạ này sẽ bị
mất đi một số bức xạ có tần số xác định nghĩa là các tia này đã bị hấp thụ.
*Các vùng phổ hồng ngoại
Phổ hồng ngoại thường được ghi với trục tung biểu diễn độ truyền qua T hoặc
độ hấp thụ A, trục hoành biểu diễn số sóng (cm-1).
- Độ truyền qua T: là tỷ số của cường độ bức xạ truyền qua và cường độ bức xạ tới.
- Độ hấp thụ ánh sáng (A): là logarit thập phân của nghịch đảo độ truyền quang.
Bức xạ hồng ngoại là một vùng bức xạ điện từ có độ dài bước sóng từ 0,8 đến
1000µm và chia thành ba vùng:
- Vùng hồng ngoại gần (near infrared): 12500-4000 cm-1 (λ = 0,8–2,5µm)
- Vùng hồng ngoại trung (medium infrared): 4000-400 cm-1 (λ = 2,5–50µm)
- Vùng hồng ngoại xa (far infrared): 400-10 cm-1 (λ = 50-100µm).
Hầu hết các nhóm nguyên tử trong các hợp chất hữu cơ hấp thụ ở vùng 4000650cm-1.
1. Vùng hồng ngoại gần (NIR):

Chuyên ngành hóa phân tích
Footer Page 24 of 148.

14

Trường ĐHKHTN

19 và các dao động biến dạng trong hệ thống mạch vòng
hoặc chưa no. Vùng dao động tần số thấp trong phổ hồng ngoại rất nhạy đối với sự
thay đổi cấu trúc phân tử, bởi vậy đám phổ vùng hồng ngoại xa thường cho phép dự
đoán các dạng đồng phân.