TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
------------------------

NGUYỄN THỊ CHUNG ANH

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN NHANH NĂM GIỐNG CÚC
(TRẮNG TUYẾT, MAI VÀNG, LAN TÍM, CHI ĐỎ VÀ ĐỎ CỜ)
BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

HÀ NỘI, 2016


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
------------------------

NGUYỄN THỊ CHUNG ANH

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN NHANH NĂM GIỐNG CÚC
(TRẮNG TUYẾT, MAI VÀNG, LAN TÍM, CHI ĐỎ VÀ ĐỎ CỜ)
BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

Người hướng dẫn khoa học
TS. La Việt Hồng

Hà nội, ngày…..tháng 5 năm 2016
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Chung Anh


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Agar

Thạch

BAP

6 - Benzyl amino purin

IAA

Beta - Indole - acetic acid

IBA

Indode - 3 - Butyric acid

MS

Murashige and Skoog, 1962

NAA


Hình 3.7. Rèn luyện cây cúc in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên
........................................................................................................... 33


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 2
3. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 2
3.1. Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro .......................................................... 2
3.2. Ra rễ tạo cây in vitro hoàn chỉnh ............................................................... 2
3.3. Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên........................... 3
4. Ý nghĩa của đề tài .......................................................................................... 3
NỘI DUNG ....................................................................................................... 4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 4
1. Giới thiệu về cây hoa cúc .............................................................................. 4
1.1. Nguồn gốc cây hoa cúc .............................................................................. 4
1.2. Vị trí phân loại ........................................................................................... 4
1.3. Đặc điểm thực vật học cây hoa cúc............................................................ 4
1.4. Đặc điểm sinh thái học của cây hoa cúc: ................................................... 5
1.5. Giá trị kinh tế của cây hoa cúc ................................................................... 5
2. Tình hình sản xuất cây hoa cúc trên thế giới và Việt Nam ........................... 6
2.1. Tình hình sản xuất cây hoa cúc trên thế giới ............................................. 6
2.2. Tình hình sản xuất hoa cúc tại Việt Nam ................................................... 6
3. Tình hình nghiên cứu cây hoa cúc trên thế giới và ở Việt Nam trong lĩnh
vực nuôi cấy mô tế bào ..................................................................................... 7
3.1.Tình hình nghiên cứu cây hoa cúc trên thế giới .......................................... 7
3.2. Tình hình nghiên cứu cây hoa cúc ở Việt Nam ......................................... 9
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 11
2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu ................................................................. 11

dụng thanh nhiệt, giải độc, giải cảm, giáng hỏa, mát gan, làm sáng mắt…
Thực tế việc trồng hoa cúc ở nước ta đã được thực hiện trên quy mô
lớn tại các làng hoa đặc biệt là ở các vùng như Đà Lạt, Mê Linh…. với diện
tích lên tới hàng nghìn ha. Ví dụ như: Diện tích trồng hoa của Hà Nội năm
1995 là 500 ha, tăng 12,8 lần so với năm 1990 [3], đến năm 2001, đạt tới 867
ha [15]. không chỉ cung cấp nhu cầu về hoa trong nước mà còn xuất khẩu
sang các nước khác. Giải quyết công ăn việc làm cho rất nhiều nhân công,
góp phần tích cực vào việc xóa đói giảm nghèo. Trong tương lai nhu cầu về
hoa cúc sẽ còn tiếp tục tăng đồng nghĩa với việc quy mô sản xuất cây hoa cúc
sẽ ngày càng được mở rộng. Kéo theo đó là nhu cầu giống cây có chất lượng
với một số lượng lớn.
Tuy nhiên việc tạo giống ngoài tự nhiên bằng các phương pháp thủ công
như gieo hạt (chỉ áp dụng được với những giống cúc trồng bằng hạt), tách cây
con từ rễ, giâm cành mang lại hiệu quả thấp, phụ thuộc nhiều vào điều kiện tự

1


nhiên dẫn đến không đáp ứng đủ nhu cầu về giống cây. Trong khi đó phương
pháp nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào (in vitro) cho hiệu
quả cao hơn hẳn. Đây là phương pháp kỹ thuật khoa học nhằm tạo ra các
giống cây con sạch bệnh với số lượng lớn trong một thời gian ngắn ở điều
kiện vô trùng, tuy chi phí đầu tư khá cao nhưng nếu sản xuất với quy mô và
số lượng giống lớn thì giá thành sản phẩm lại phù hợp với khả năng chi trả
của người trồng hoa. Xét về hiệu quả kinh tế thì đây là một phương pháp tối
ưu. Nó có thể giải quyết được các mặt hạn chế mà các phương pháp thủ công
gặp phải. Ở Việt Nam hiện nay, phương pháp này cũng đã được áp dụng trên
đối tượng cúc và cho hiệu quả tốt. Một vài giống cúc đã được nhân giống in
vitro thành công và thích nghi tốt với điều kiện ngoài đồng ruộng. Từ những
lý do trên chúng tôi quyết định tiến hành đề tài:



NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Giới thiệu về cây hoa cúc
1.1. Nguồn gốc cây hoa cúc
Tên khoa học (Chrysanthenum sp.) cây hoa cúc có nguồn gốc từ Trung
Quốc, Nhật Bản, Việt Nam và một số nước Châu Âu (nó được người Trung
Quốc, Nhật Bản và các cụ ta xưa rất quý trọng, coi nó những người bạn tâm
tình, một thứ hoa quân tứ, dáng hoa đẹp, mùi thơm dịu và kín đáo.
Chrysanthemum được trồng đầu tiên tại Trung Quốc để làm thảo dược từ thế
kỷ 15 trước Công nguyên. Ban đầu cây có hoa nhỏ và màu vàng. Sau nhiều
thế kỷ gieo trồng, số lượng giống tăng đáng kể. Sách viết về hoa cúc thời nhà
Tống ghi chép được 35 giống, đến thời nhà nhà Nguyên đã tăng lên thành 136
giống. Sách Bản thảo cương mục của Lý Thời Trân thời nhà Minh liệt kê hơn
900 giống cúc. Ngày nay có hơn 3.000 giống ở Trung Quốc.
Ngày nay, hoa Cúc được trồng rộng rãi trên thế giới như: Đức, Pháp,
Nhật bản, Mỹ, Nga, singapore, Isaren…[1], [13]. Ở Việt Nam đến đầu thế kỷ
XIX, hoa cúc đã được trồng thành các vùng chuyên canh. Hiện nay Đà Lạt có
diện tích trồng hoa cúc lên tới 5000 ha; Hà Nội đã hình thành các vùng
chuyên canh như Tây Tựu (Từ Liêm) diện tích xấp xỉ 200 ha, quận Tây hồ
diện tích 70 ha, đảm bảo cung cấp hoa cho người tiêu dùng.
1.2. Vị trí phân loại
Hoa

cúc

được

xếp

- Ẩm độ: độ ẩm đạt từ 60 - 70 % và độ ẩm không khí từ 55 - 65% là
thuận lợi cho cây sinh trưởng và phát triển. Nếu độ ẩm trên dưới 80% thì cây
sinh trưởng mạnh, nhưng dễ phát sinh sâu bệnh làm ảnh hưởng đến chất
lượng hoa [13].
- Đất và dinh dưỡng:
+ Đất cung cấp nước, dinh dưỡng cho sự sống của cây. Đất phải có hàm
lượng mùn lớn hơn 5%, độ pH khoảng 6 - 6,5.
+ Dinh dưỡng: các loại phân hữu cơ (phân chuồng, phân vi sinh, than
bùn), phân vô cơ (đạm, lân, kali) … có ý nghĩa hết sức quan trọng đối với sự
sinh trưởng phát triển và chất lượng của hoa cúc [13].
1.5. Giá trị kinh tế của cây hoa cúc
Cúc luôn là một loại cây cảnh quan trọng nhất thế giới [19]. Từ lâu, hoa
cúc được xem như một loài thảo dược có nhiều tác dụng tốt cho sức khỏe con
người. Ăn hoa cúc lâu ngày sẽ giúp làm đẹp nhan sắc, kéo dài tuổi thọ… Cả

5


hoa cúc khô và tươi đều được dùng để chế biến thành các loại trà. Các thành
phần hoạt chất trong tinh dầu hoa cúc là Bisabolol được coi là có tác dụng
chống kích ứng, chống viêm và chống vi khuẩn.
Sản xuất và kinh doanh hoa cúc đã đem lại cho người trồng hoa lợi
nhuận cao. Trên mỗi sào (Bắc Bộ) đất trồng trọt với mật độ trung bình 50
cây/m2, người trồng có thể thu được từ 5 - 6 triệu đồng (giá trung bình 300
đ/bông); chi phí cho làm đất, chăm sóc, giống và các vật tư khác thì hết 1,8 2 triệu đồng. Trong khi đó trồng lúa thì thu nhập chỉ đạt 350.000 - 400.000
đ/sào [4], [7]. Ngoài ra nếu hoa được dùng xuất khẩu thì lợi nhuận còn lớn
hơn nhiều.
2. Tình hình sản xuất cây hoa cúc trên thế giới và Việt Nam
2.1. Tình hình sản xuất cây hoa cúc trên thế giới
Trên thế giới xuất khẩu hoa cúc đang trở thành mũi nhọn và mang lại

sạch bệnh.
Việc sử dụng đỉnh sinh trưởng để nuôi cấy in vitro cũng được thực hiện
thành công bởi Fukai, Goi và Tanaka (1991) [17]. Các tác giả đã nghiên cứu
phương pháp tối ưu để tạo mẫu vô trùng có tỷ lệ sống và tái sinh chồi cao
nhất. Kết quả cho thấy bảo vệ chồi đỉnh cúc trước nuôi cấy 2 ngày trong điều
kiện lạnh dần cứ 0,20C/phút đến -400C với 10% dimethyl sufoide và 3%
glucose cho tỷ lệ sống và tái sinh chồi rất cao, có loài lên tới 100%.
Năm 2007, Zhen Liu và Shanlin Gao [31] đã tiến hành nghiên cứu sự
hình thành rễ cuả các giống cúc trong môi trường MS cơ bản bổ sung BAP và
NAA, kết quả thu được như sau: Cảm ứng rễ và có thể quan sát rễ trong vòng
15 ngày sau khi nuôi cấy trong môi trường ½ MS bổ sung 0,2 mg/l IAA.
Khi nghiên cứu tác dụng của axit gibberellic (GA3) và malein hydrazyt
(MH) sau khi trồng 30 và 60 ngày đến sự phát triển hoa và năng suất của hoa
cúc được trồng trong điều kiện nhà lưới, S.R. Dalal và cs (2009) [26] đã cho
thấy GA3 ở nồng độ 200 ppm làm tăng chiều cao cây tối đa, thúc đẩy nhanh

7


sự ra hoa, tăng đường kính của hoa, chiều dài của cuống hoa và năng suất
giống hoa cúc thí nghiệm. Phun MH ở nồng độ 750 ppm làm tăng số nhánh
trên cây và đường kính bông hoa.
Ksenija Karlovie và cs (2004) [21] đã nghiên cứu các nồng độ
khác nhau của Daminozide (B9) và Chlormequat (CCC) là những chất ức chế
sinh trưởng đến sự sinh trưởng của cây hoa cúc ‘Revert’. Kết quả cho
thấy Daminozide ở nồng độ 2.000 ppm có tác dụng làm giảm chiều cao cây
hoa tốt nhất, số lượng chồi hoa cũng giảm đi và hiệu quả cao hơn so với việc
sử dụng chất Chlormequat.
Prohexadione Calcium (Pro-Ca) là chất có tác dụng ức chế quá
trình sinh tổng hợp gibberellin làm giảm chiều dài tế bào của đốt thân, chiều

3.2. Tình hình nghiên cứu cây hoa cúc ở Việt Nam
Ở Việt Nam, mặc dù cây hoa cúc đã được nhập nội vào nước ta từ lâu
nhưng sự hiểu biết cũng như kết quả nghiên cứu về cây hoa này còn chưa
nhiều. Nhìn chung, các kết quả nghiên cứu thường tập trung vào việc tập hợp
các kinh nghiệm trồng hoa và các phương pháp nhân giống.
Từ năm 1992, Trung tâm nghiên cứu và Phát triển Hoa – Cây cảnh,
Viện Di truyền Nông nghiệp kết hợp Bộ môn nuôi cấy mô tế bào của Viện đã
tiến hành nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cây hoa cúc bằng
phương pháp nuôi cấy in vitro. Tiến hành thu thập, khảo sát và đánh giá một
số giống cúc mới, kết quả là từ 2/1993 đến tháng 2/1999, giống cúc CN93 và
CN98 đã được Hội đồng khoa học Bộ Nông nghiệp cho phép khu vực hóa,
đến tháng 4/1996 và 9/2000 lần lược 2 giống cúc CN93 và CN98 đã được
công nhận là giống cúc quốc gia.
Năm 1998, Nguyễn Quang Thạch và cộng sự [12] đã xây dựng hoàn
chỉnh quy trình nhân giống bằng nuôi cấy mô cho một số giống cúc đang

9


được trồng phổ biến ở miền Bắc nước ta như CN93, vàng Đài Loan, đỏ Hà
Lan.
Theo Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (1998) [12] để nâng cao tỷ lệ
sống và ra rễ của cành giâm trong nhân giống vô tính có thể sư dụng IBA
hoặc α – NAA với nồng độ 1000 ppm bằng cách nhúng phần gốc của cành
khoảng 0,5 – 1 cm vào dung dịch thuốc từ 3 - 5 giây rồi cắm vào đất hoặc cát.
Nguyễn Thị Diệu Hương, Dương Tấn Nhựt (2004) [5] khi nghiên
cứu hoàn thiện quy trình nhân nhanh giống cây hoa cúc (Chrysanthemum
indicum L.) sạch bệnh bằng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong môi
trường ½ MS đã bổ sung BAP kết hợp với NAA, IAA, IBA theo sự biến thiên
của các chất kích thích sinh trưởng. Kết quả cho thấy trong môi trường ½ MS

2.1.3. Trang thiết bị và dụng cụ
Thiết bị: Cân kĩ thuật, tủ lạnh sâu, máy đo pH, nồi hấp khử trùng, máy
cất nước 2 lần, buồng cấy vô trùng, máy khuấy từ ra nhiệt, cân phân tích, tủ
ấm, Micropipet Jinson.
Dụng cụ: Cốc thủy tinh, ống falcon (loại 50ml), giấy báo, túi nilon,
dao, khay cấy, panh, kéo…
2.1.4. Môi trường nuôi cấy và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
- Môi trường sử dụng nuôi cấy là MS cải tiến (Murashige và Skoog,
1962) [30] gồm các khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin…thường được sử
dụng trong nghiên cứu về nuôi cấy mô tế bào thực vật (phụ lục).
- Các chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng: BAP (6 - Benzyl amino
purin); NAA (Naphthalene acetic acid) của hãng Dulchefa, Hà Lan.
- Nước dừa.
- Các thành phần khác: +Đường Saccarose: 30 g/l của công ty TNHH
Đức Lộc cung cấp.
+Agar: 7 g/l của công ty Long Hải cung cấp.
Môi trường được điều chỉnh về pH = 5,8 ± 0,05 (bằng NaOH 1N và
HCl 1N) trước khi khử trùng bằng nồi hấp khử trùng ở 1170C, 1 atm trong 15
phút.

11


2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Bố trí thí nghiệm
2.2.1.1. Tái sinh và nhân nhanh chồi in vi tro
Các thí nghiệm nuôi cấy in vitro đều sử dụng môi trường dinh dưỡng
cơ bản (Murasihge và skoog, 1962) [22]: MS + 30 g/l đường Saccarose + 7,5
g/l agar bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng BAP, nước dừa và NAA với
các nồng độ khác nhau gồm 3 thí nghiệm sau:

Văn Mã và cs, (2013) [8].

13


CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro của năm giống cúc
3.1.1. Giống Trắng tuyết

b

a

d

Hình 3.1. Ảnh hưởng của BAP, nước dừa và NAA đến khả năng tái
sinh và nhân nhanh chồi in vitro của Trắng tuyết
a. BAP 0,5 mg/l

b. BAP 0,3 mg/l + 10% nước dừa

c. NAA 0,04 mg/l + BAP 1,0 mg/l

d. BAP 0,7 mg/l + 10% nước dừa

14


Bảng 3.1.1. Ảnh hưởng của BAP, nước dừa và NAA đến sự tái sinh và nhân nhanh của giống cúc Trắng tuyết
Công thức

Đối chứng

4,00 ±0a
c

BAP0,3

7,00±1,00

BAP0,5

5,30 ±0,58b
b

BAP0,7

6,00±0

BAP1,0

5,00±1,00b

Đều

Xanh – mập

Đen/0 cm

-


X

Không

Xanh – mập

Đen/1,7 cm

-

-

X

X

Không

Xanh – mập

Đen/1,3 cm

-

-

2,27±0,67a

X


-

BAP0,5+10% ND

5,70 ±2,08a

2,87±0,55a

X

Không

Xanh – mập

Đen/2 cm

-

-

BAP0,7+10% ND

a

2,80±0,26

a

X



NAA0,02+BAP0,5

5,30±1,53

NAA0,02+BAP0,7

5,30±0,58b

1,83±0,25a

X

Không

Xanh – mập

Đen/1,7 cm

X

-

NAA0,02+BAP1,0

4,3±0,58

ab

a


NAA0,04+BAP0,7

6,00±0ab

2,17±0,60a

X

Không

Xanh – mập

Đen/1,8 cm

X

-

NAA0,04+BAP1,0

5,33±0.58ab

1,97±0,29a

X

Không

Xanh – mập

c. Ảnh hưởng của BAP kết hợp NAA
Trắng tuyết ở tất cả các công thức bổ sung BAP kết hợp NAA đều cho mô
sẹo lớn khoảng 1,3 - 1,7 cm, chồi thấp, chồi nhiều nhưng đều phát sinh từ mô
sẹo, chồi không đồng đều, nhanh lụi (Bảng 3.1.2). Kết luận môi trường môi
trường MS cơ bản bổ sung BAP kết hợp NAA không phù hợp cho sự tái sinh và
nhân nhanh của Trắng tuyết (H.3.1).

16